预防皮肤损伤及促进皮肤再生的组合物及其制造方法与流程

本发明涉及预防皮肤损伤及促进皮肤再生的组合物，具体地说是包括去除洋葱特有气味的同时改善洋葱提取物内的绣线菊苷(spiraeoside)含量，从而达到预防皮肤损伤及促进受损皮肤再生的洋葱提取物的预防皮肤损伤及促进皮肤再生组合物及其制造方法。

背景技术

形成皮肤老化的主要原因之光辐射皮肤老化正在成为导致大部分皮肤美容及医学问题的根源。

与内因性皮肤老化相比，光辐射皮肤老化下的肤质更粗糙干燥，且皮肤弹力明显下降，从而出现皮肤下垂、皱纹较深以及紫斑、皮脂腺增生等症状。形成光辐射皮肤老化的皮肤表皮厚度起初稍微增加后，最后变得比内因性皮肤老化还要薄，胶质细胞的形态和排列也会变异常。朗格汉斯细胞数也显著减少，从而导致局部免疫功能的严重低下。黑色素细胞数也同样减少的同时，细胞活性不规律的增加，从而导致皮肤同时出现斑样色素减退与泛发性色素异常症状，恶性肿瘤发病几率也会显著提高。

此外，与内因性皮肤老化相比，形成光辐射皮肤老化的皮肤真皮基质内的胶质量也明显减少。当真皮内含3～4％的弹力素数量和直径减少且长度变短时，将导致皮内钙质沉着，再加上形成光辐射皮肤老化的真皮上层内沉着有大面积弹力纤维物质(elastoticmaterial)，真皮基质黏多糖(mucopolysaccharide)内的hyaluronicacid显著减少便导致皮肤弹力下降。真皮厚度变薄及其组成成分的变化将导致皮肤弹力下降，导致皮肤下垂或皱纹明显。

导致光辐射皮肤老化的光线波长为紫外线领域。日光晒伤的主要原因为紫外线b(uvb，290-320nm)，导致皮肤内dna损伤以及一系列光辐射皮肤老化症状。

因此产生了能够减少dna损伤的化妆品原料开发需求，含dna的线粒体在神经细胞之凋亡性细胞(apoptoticcell)死亡和坏死细胞(necroticcell)死亡方面起到重要作用。programmedcelldeath的初期阶段特点为活性化线粒体崩溃，从而导致基底膜电位变化及氧化还原电位(oxidation-reduction

potential)变化等现象。这一初期细胞凋亡(apoptosis)现象之线粒体膜电位(mitochondrialtransmembranepotential)变化可用对线粒体内部电化学势(electrochemical

potential)敏感的荧光染料(fluorochrome)进行测量，将最常用的绿色荧光菁染料(greenfluorescentcyaninedye)jc-1注入真核细胞(eukaryoticcell)胞液内，便会顺着电位累积于线粒体内。累积时jc-1的fluorescence

emissionshift由green(～529nm)变化至red(～590nm)，最终使线粒体极化并导致red/greenfluorescenceintensityratio减少。

同时产生皮肤的最外层外皮细胞持续剥离并去除，并由新生细胞进行替代的过程。因此，当皮肤受外界刺激而受损时，伤口能够马上愈合，表皮受损的伤口表面因基底膜暴露而呈鲜红色。

受损皮肤形成新的结缔组织的过程包括新血管生成和胶原合成过程。胶原合成(collagensynthesis)过程中的成纤维细胞(fibroblast)是胶原合成及其他结缔组织形成中最重要的细胞，在伤口愈合过程中也起到重要作用。成纤维细胞对炎症期内因血小板、巨噬细胞等生成的产物和成长因子等产生反应、运动并增生，并在炎症期后期开始出现于伤口部位。一次治愈方式下的伤口愈合仅用少量胶原质即可填补受损部位，且胶原质合成与表皮细胞移动几乎同时发生。

对此，本申请人用细胞划痕实验(cellscratchassay)制作一定出发点后用本发明制成的试剂进行了处理，并进行了用显微镜观察随时间变化下的细胞生长的实验，从而开发了预防紫外线皮肤损伤及促进受损皮肤再生的洋葱提取物。

专利文献

韩国公开专利第10-2004-0012913号

技术实现要素：

本发明的目的在于提供去除洋葱特有气味的同时，改善洋葱提取物内的绣线菊苷(spiraeoside)含量，从而预防紫外线导致的皮肤损伤及促进皮肤再生的洋葱提取物及包含该成分的预防皮肤损伤及促进皮肤再生的组合物。

为了解决上述问题，本发明中提示的预防皮肤损伤及促进皮肤再生的组合物制造方法包括：

用乙醇沉浸干洋葱后获得洋葱提取物的第1阶段；过滤洋葱提取物的第2阶段；将过滤洋葱提取物进行浓缩的第3阶段；将浓缩液内的固含量溶解至5～20wt％的第4阶段；用乙烷和乙酸乙酯对溶解液依次进行提取后去除溶解液内非极性成分的第5阶段；以及由此获得的洋葱提取物。

此外，本发明中提示的预防皮肤损伤及促进皮肤再生的组合物制造方法，

以包括将提取物进行减压浓缩后制成洋葱提取物粉末的第6阶段；为特点。

并且，上述第1阶段的洋葱提取物获得过程中，

以干洋葱与乙醇以1:5wt％比例用95％乙醇在常温下浸泡1～5天后进行提取为特点。

同时，上述第2阶段的过滤过程，以用网孔大小为0.1～10μm的过滤器进行提取为特点。

同时，上述第3阶段的浓缩过程，以将洋葱提取物在40～70℃温度下进行浓缩制造为特点。

同时，上述第6阶段中，以将上述提取物在40～100℃温度下用40～550torr进行减压浓缩而获取洋葱提取物粉末为特点。

同时，依据本发明提示的预防皮肤损伤及促进皮肤再生的组合物制造方法制成的洋葱提取物粉末以具有除臭功效及绣线菊苷含量为10.0wt％～40.0wt％为特点。

同时，提供含有依据本发明制成的预防皮肤损伤及促进皮肤再生组合物的化妆品。

同时，依据本发明制成的预防皮肤损伤及促进皮肤再生的化妆品以将组合物内的洋葱提取物粉末用10～40％bg溶解为特点。

依据本发明制成的预防皮肤损伤及促进皮肤再生的组合物根据其含量或使用方法，可作为保湿及维持水分的化妆品原料适用于精华液、乳液、面霜、水洗(wash-off)或免洗(leave-on)产品及其他产品。

适用本发明的化妆品可制成乳液、护唇产品或其他常用剂型，各剂型可任意适量使用通用的软化剂或香料、色素、抗氧化剂、ph调节剂等添加剂。

依据本发明制成的洋葱提取物在去除洋葱特有气味的同时，具有预防紫外线导致的皮肤损伤及促进受损皮肤再生的功效。

附图说明

图1为依据本发明制成的第1实施示例之洋葱提取物粉末毒性实验结果图表；

图2为与图1对应的指标物质绣线菊苷的毒性实验结果图表；

图3为将依据本发明制成的洋葱提取物粉末及指标物质绣线菊苷与control对照组和uvb50mj的染色程度进行比较的图片资料；

图4为第2实施示例之洋葱提取物粉末及绣线菊苷毒性实验结果比较图表；

图5至图15为洋葱提取物粉末及指标物质绣线菊苷的细胞再生促进功效观察资料，图5为control，图6为fbs2％，图7为洋葱提取物粉末25μg/ml，图8为洋葱提取物粉末50μg/ml，图9为洋葱提取物粉末100μg/ml，图10为洋葱提取物粉末250μg/ml，图11为绣线菊苷0.15μg/ml，图12为绣线菊苷0.3μg/ml，图13为绣线菊苷0.6μg/ml，图14为绣线菊苷1.5μg/ml，图15为绣线菊苷3μg/ml处理案例。

具体实施方式

以下将通过如下附图与实施示例及实验示例对本发明进行详细说明。如下附图、实施示例及实验示例仅为对本发明的举例说明，并不代表本发明的内容局限于此。此外，对功效检测实验过程中的常用测量实验说明进行了省略。

1.抗光辐射皮肤老化功效评价实验方法

1-1.细胞毒性实验(mttassay)

为验证洋葱提取物的抗光辐射皮肤老化功效，在24-wellplate接种角质形成细胞(hacat)并培养24小时后，将所培养的细胞培养基用serumfree进行更换后用不同浓度的试剂加以处理后培养24小时。将完成培养的细胞培养基用2.5mg/mlmtt溶液进行10倍稀释的培养基替换并引起反应后，去除上层液并添加dmso1ml，将生成的mtt-formazan结晶体溶解后用elisareader在570nm下测量吸光度，将细胞毒性与对照组进行比较后用百分比表示吸光度。

1-2.jc-1staining(jc-1染色)

为验证线粒体的细胞膜电位变化，将角质形成细胞(humankeratinocyte)注入35mmplate后进行24小时稳定化，再用serum-freemedium更换后进行试样。1小时后用hbss(hank'sbalancedsaltsolution)缓冲液清洗并添加freshhbss后观察uvb50mj/cm²。用serum-freemedium替换培养基后进行试剂处理，并在37℃，5％co2incubator下培养24小时，去除培养基后进行1μg/mljc-1solution处理，在37℃，5％co2incubator且无光线状态下反应2小时后去除培养基并用荧光显微镜观察。

1-3.使用仪器及试剂

①elisareader:infinitem200(tecan,austria),②mtt:thiazolylbluetetrazoliumbromide(m5655,sigma-aldrich),③rna:qubitfluoremeterwithrnabrassaykit(invitrogen,usa),④cdna:highcapacityrna-to-cdnakit(appliedbiosystems,usa),⑤real-timepcr:7500fastwithpowersybrgreenpcrmastermix(appliedbiosystems,usa),⑥jc-1dye(invitrogen),⑦leica显微镜

1-4.气味改善洋葱提取物粉末试剂制作方法及提取物内指标物质绣线菊苷的含量分析方法

为验证洋葱提取物的气味改善并分析提取物内的绣线菊苷含量，用以下方法进行了试剂制作及分析。

1-5.制作试剂

筛选洋葱后清洗并烘干。

将干洋葱与95％乙醇以1:5最好是1:2wt％比例在常温下浸泡1～5天，最好是浸泡2天后获取洋葱提取物。

其次，用0.1～10μm网孔大小或优选1μm大小的过滤器进行洋葱提取物过滤。

将过滤的洋葱提取物在约40～70℃，优选60℃温度下进行浓缩后制成浓缩液。

将制成的浓缩液用净化水溶解，获取固含量为5～20wt％，优选为10wt％的溶解液。

将制成的溶解液用乙烷进行1～6次，优选3次以上提取而去除洋葱提取物溶解液内产生气味的非极性成分之挥发成分后，用乙酸乙酯进行1～4次，优选2次以上二重提取而去除溶解液内残余的非极性成分，使全体试剂含量内的绣线菊苷提取含量增多。

如上用乙酸乙酯进行提取而获得提取物后在约40～100℃,优选50～60℃,最佳优选55℃温度下用约40～550torr减压状态进行浓缩而获取洋葱提取物粉末。

1-6.制作指标物质绣线菊苷

此外，作为比较试剂，将指标物质绣线菊苷1,000ppm用30％bg(butyleneglycol)加热溶解后，用网孔大小为0.1～0.3μm或优选0.22μm的过滤器进行过滤后使用。

将过滤后的绣线菊苷2.1mg放入50ml烧瓶内后加入meoh溶解，并将其溶液作为标准溶液。

此外，将50mg洋葱提取物粉末用meoh完全溶解后用0.45μm过滤得出的溶液作为试料。

此时，含量分析条件如下：

column：capcellpakc184.6ⅹ250mm(shiseidohplccolumn)

flowrate：1.0ml/min

detection：uv280nm

temp：30℃

injectionvolume:20ul

analysistime：30min

mobilephase：acn.净化水.醋酸(250:750:1)

1-7.实验结果

乙醇提取获得的洋葱提取物粉末和用乙酸乙酯提取获得的洋葱提取物粉末及用乙烷进行一次提取后再用乙酸乙酯进行二次提取而得出的洋葱提取物粉末的绣线菊苷含量实验结果如表1。

【表1】

如表1所示，用95％etoh提取的粉末的绣线菊苷含量为0.45％且具有洋葱特有气味。用乙酸乙酯进行2次提取的洋葱提取物粉末的绣线菊苷含量为11.2％且气味无太大改善。相反，用乙烷进行1次提取后再用乙酸乙酯进行2次提取的粉末，气味完全改善且绣线菊苷含量达35.8％，有效成分数值居高。

将由此制成的洋葱提取物粉末用于化妆品时，根据不同剂型可能出现粉状原料不易使用的情况，因此进行了将无味的粉末以液态加工的实验。

为此，将改善气味的洋葱提取物粉末分别用10～40％bg，优选30％丁二醇(bg)与乙二醇(hexanediol)进行了溶解，其结果如表2。

【表2】

如表2所示，用30％bg溶解得出的绣线菊苷数值比用hexanediol溶解时高约11倍。

由此，可根据化妆品剂型使用改善气味的洋葱提取物粉末或用30％bg溶解该粉末的产品。

将改善气味的洋葱提取物粉末作为试剂进行了如下测试。

1-7-1.细胞毒性测试(mttassay)

进行jc-1staining前，利用角质形成细胞(hacat)进行了毒性评价，实验结果如表3及图1、图2所示。

表3及图1、图2所示，洋葱提取物粉末浓度内均未检出毒性，因此用50、100、250、500μg/ml等不同浓度的洋葱提取物粉末进行了实验，绣线菊苷也根据洋葱提取物内的含量进行了0.3、0.6、1.5、3μg/ml等不同浓度的实验。

【表3】

1-7-2.jc-1staining

将洋葱提取物粉末及指标物质绣线菊苷与control(未处理)及对照组uvb50mj处理组进行比较得出的染色度比较结果为图3的比较图。

如图3所示，所有浓度内活细胞红色荧光染色数量比起uvb处理组有所增加，且低浓度下的光保护功效大于高浓度。

由此可判断，洋葱提取物粉末及绣线菊苷在低浓度下具有更卓越的抵抗uvb导致的细胞消灭的功效。

2.伤口愈合功效评价实验方法

2-1.细胞毒性评价(mttassay)

为验证洋葱提取物的促进皮肤再生及伤口治愈功效，在24-wellplate接种成纤维细胞(humanfibroblast)后培养24小时，用serum-free培养基替换细胞培养基后按各试剂浓度加以处理后培养24小时。将完成培养的细胞培养基用2.5mg/mlmtt溶液进行10倍稀释的培养基替换并引起反应后，去除上层液并添加dmso1ml，将生成的mtt-formazan结晶体溶解后用elisareader在570nm下测量吸光度，将细胞毒性与对照组进行比较后用百分比表示吸光度。

2-2.woundhealingassay

在60mmplate接种fibroblast后培养24小时，完成培养后直线scraping并用serum-free培养基替换，并按不同试剂浓度分别加以处理，培养3天或6天后用显微镜(leica)拍摄细胞图片。

2-3.使用仪器及试剂

①elisareader:infinitem200(tecan,austria),②mtt:thiazolylbluetetrazoliumbromide(m5655,sigma-aldrich),③scraper(nunc),leica

2-4.试剂信息

所使用的洋葱提取物粉末为通过上述抗光辐射皮肤老化功效评价中制成的粉末，溶媒使用了二甲亚砜(dmso[dimethylsulfoxide])。

所使用的绣线菊苷为由生产商(extrasynthese)采购的商品，溶媒同为二甲亚砜(dmso[dimethylsulfoxide])。

2-5.测试结果

2-5-1.细胞毒性测试(mttassay)

有关洋葱提取物粉末及绣线菊苷的毒性测试结果如表4及图4。

【表4】

fibroblast

如表4及图4所示，所有浓度的洋葱提取物粉末及绣线菊苷均未检出毒性，因此用50、100、250、500μg/ml等不同浓度的洋葱提取物粉末及相对应的0.15、0.5、0.6、1.5、3μg/ml等指标物质绣线菊苷含量进行了migration测试。

2-5-2.cellmigration测试

为观察洋葱提取物粉末及指标物质绣线菊苷的细胞再生促进功效而进行了woundhealingassay，并将其结果按不同浓度及day1、day2、day3、day4、day7等日期依次标注于图5至图15。

其中，图5为control结果，图6为fbs(fetalbovineserum)2％处理结果，图7为洋葱提取物粉末25μg/ml，图8为洋葱提取物粉末50μg/ml，图9为洋葱提取物粉末100μg/ml，图10为洋葱提取物粉末250μg/ml，图11为绣线菊苷0.15μg/ml，图12为绣线菊苷0.3μg/ml，图13为绣线菊苷0.6μg/ml，图14为绣线菊苷1.5μg/ml，图15为绣线菊苷3μg/ml处理结果。

如图5至图15所示，实验结果显示绣线菊苷呈与浓度相关的migration功效，洋葱提取物粉末的所有浓度均呈migration功效，尤其是50、100μg/ml浓度下观察到了与positivecontrolfbs2％程度相似的细胞再生促进功效。

由此可判断，洋葱提取物粉末与绣线菊苷在伤口起到促进细胞再生的功效。

虽然本发明对上述优选实施例进行了相关说明，但在不脱离本发明主旨的范围内可进行各种修改或变形，所添附的专利申请范围也包括属于本发明实际范围内的相应修改及变形。