本发明属于生物医药
技术领域：
：，具体涉及ripk4作为靶位点在制备治疗膀胱癌药物中的应用。
背景技术：
：：膀胱尿路上皮癌(buc)的发病率和死亡率在中国泌尿生殖系统肿瘤居首。buc可分为非侵入性和侵入性亚型，后者具有更大的转移风险。转移性buc仍然是一种致死性疾病，除一线治疗之外几乎没有治疗选择：转移性疾病患者的5年生存率仅为5％。人膀胱肿瘤标本和小鼠模型研究buc的进展和转移已经涉及多个信号通路。目前，对buc中调节nf-κb通路的精确分子机制知之甚少。受体相互作用蛋白激酶4(ripk4)是rip激酶家族的成员，并且是丝氨酸/苏氨酸激酶。它最初被确定为角质形成细胞分化的重要调节因子，其编码基因在bartsocas-papas综合征中突变。最近，一些研究表明，ripk4在某些类型的癌症如皮肤癌，卵巢癌，宫颈癌和结肠直肠癌中过表达，并且在异种移植肿瘤模型中，ripk4表达增加促进卵巢癌。然而，ripk4在buc中的临床和生物学意义在很大程度上还不清楚。因此，需要广泛调查ripk4在buc中的功能。技术实现要素：本发明旨在提供一种可以用于制备治疗膀胱癌药物的新靶点。本发明通过评估ripk4对nf-κb激活和buc进展的影响。我们观察到，buc中ripk4明显上调，这种过度表达与buc患者的生存期和临床病理特征显著相关。ripk4的过度表达诱导，而沉默ripk4抑制体外和体内buc的侵袭和转移。此外，我们证明ripk4可能通过k63连接，促进肿瘤坏死因子受体相关因子2(traf2)，受体相互作用蛋白(rip)和nf-κb的必需调节因子(nemo)的多聚泛素化，从而在控制buc的侵袭和转移中起重要作用。这促进nf-κb-p65的细胞质核转位，使nf-κb活性增加，最终导致血管内皮生长因子a(vegf-a)水平增加。我们的研究结果表明，ripk4是buc在侵袭和转移中的关键参与者，并且ripk4可成为buc这种恶性肿瘤患者的新型预后生物标志物和治疗靶标。本发明在25例冷冻保存的膀胱标本和112例buc石蜡标本中检测ripk4的表达。进行体内和体外测定来验证ripk4对nf-κb通路介导的buc进展的作用。本发明在buc组织中观察到ripk4的高表达，并且是总体生存差的独立预测因子。上调或下调ripk4的表达分别增强或抑制buc细胞在体外和体内的迁移和侵袭。机制上，ripk4促进由k63连接的，肿瘤坏死因子受体相关因子2(traf2)，受体相互作用蛋白(rip)和nf-κb必需调节因子(nemo)的多聚泛素化。ripk4还促进nf-κb-p65的核定位，并极大维持了nf-κb的活化，导致vegf-a的上调，最终促进buc细胞的侵袭性。本发明的数据强调了ripk4在buc中的分子病因学和临床的重要性：ripk4的上调促进nf-κb活化，并上调vegf-a和促进buc进展。靶向ripk4可能是提高buc患者生存率的一种新的治疗策略。总之，本发明的研究表明，buc中ripk4明显上调，ripk4的过度表达诱导，而沉默ripk4抑制体外和体内buc的侵袭和转移。因此，ripk4可作为靶位点在制备治疗膀胱癌药物中的应用。所述膀胱癌是指buc。此外，我们证明ripk4的上调会导致血管内皮生长因子a(vegf-a)水平增加。因此，ripk4在制备靶向负性调控vegf-a表达制剂中可应用。同时，vegf-a也可作为靶位点在制备治疗膀胱癌药物中应用。下面对本发明做进一步解释和说明：我们的研究表明，nf-κb的激活在buc进展中是重要的。因此，加强我们对nf-κb信号调节的理解可能会确定buc治疗的新靶点。在本研究中，观察到ripk4通过rip的募集和泛素化促进nf-κb活动。沉默ripk4显著减少nf-κb活动，而过度表达ripk4促进nf-κb活动。因此，结果揭示了bucs中活化nf-κb的新机制。含有n端rip样激酶结构域和以11个重复锚蛋白为特征的c端区域的ripk4是调节信号转导的ser/thr激酶家族的成员(meylan等人，2002)。到目前为止，ripk4在恶性肿瘤发病机制中的作用尚未被广泛研究。liu和他的同事报道，ripk4在宫颈鳞状细胞癌中过表达，体外ripk4敲低减少了细胞迁移和侵袭(liu等，2015)。类似地，ripk4在皮肤，卵巢和结直肠癌中过表达(huang等，2013)。然而，(adams等人，2007)发现ripk4在过度增殖的角质上皮细胞中下调(adams等人，2007)；在肝细胞癌和舌鳞状细胞癌中，ripk4的表达也下调(heim等，2015；wang等，2014)。这些研究中的不一致表明，在不同的肿瘤中，ripk4具有不同的致癌机制。为了探讨ripk4作为buc的治疗靶点的用途，我们观察到buc细胞系和原代buc组织中ripk4水平增加，并且与buc中的进展和患者存活率正相关。过度表达ripk4促进buc的上皮间质转移和入侵/转移，但沉默ripk4减少buc的上皮间质转移和入侵/转移。因此，我们的研究结果表明，ripk4在bucs中起着致癌基因的作用，并且ripk4过表达促进buc进展。然而，ripk4调节buc细胞的分子机制转移/入侵尚不清楚。为了更深入地了解ripk4参与的下游分子过程和buc的侵袭和转移，使用dna微阵列技术比较了用shripk4或shnc转染的t24细胞之间的全基因表达谱，与迁移和血管生成有关的差异表达的基因中，有17个差异表达≥2倍。随后，使用western印迹分析这17个基因的蛋白质水平。在ripk4-shrnat24和rt4细胞中使用western印迹在蛋白质水平验证vegf-a的这种下调。相比之下，ripk4的过度表达增加了biu87细胞中vegf-a的蛋白质水平。此外，我们观察到我们buc队列的ripk4水平和vegf-a水平之间的显著正相关性。总之，我们的研究结果暗示ripk4可能通过buc细胞中vegf-a调节细胞迁移和侵袭。近来，血管生成被确定为药理学抗buc策略有效且重要的靶标；例如使用针对vegf和vegf受体的单克隆抗体(vogelzang，2013)。迫切需要发现新的和改进的抗血管生成剂来治疗buc患者。在本研究中，我们显示ripk4的过度表达导致buc细胞中某些已知的促血管生成因子如vegf-a的上调。这表明ripk4可能是buc治疗的一个吸引人的靶标。因此，有必要进一步评估buc患者血液中ripk4水平与其存活率之间的相关性。我们的结果表明ripk4在nf-κb活化中具有重要作用。此外，我们假设ripk4反应中的nf-κb激活主要由rip的募集和泛素化所刺激。我们的研究结果显示ripk4对nf-κb通路激活有很大的影响，提示在不同的细胞类型中nf-κb调控的基因可能有不同的分子机制，这可能取决于细胞的具体情况。我们实验室正在研究ripk4激活和维持nf-κb活性的机制。总之，我们在buc中报道了ripk4的表达模型，并证实了ripk4在癌症侵袭中的潜在作用。此外，ripk4的功能和机制研究表明，通过nf-κb通路上调vegf-a，其在细胞上皮间质转移，侵袭和转移中起关键作用。我们还发现ripk4的水平与buc中vegf-a的水平相关。我们的研究结果显示，ripk4的高表达是buc患者新的独立预后因素，使临床医生能够识别需要更强化治疗的高危患者。因此，靶向ripk4途径可能是buc或其他癌症患者改善治疗和存活的一种新策略。为了增强我们对癌症进展的生物基础的理解，需要进一步研究ripk4在人类癌症中的表达机制。附图说明图1.ripk4在buc细胞系和组织中的表达。(a)通过western印迹检测的5个buc细胞系中ripk4蛋白的水平。(b)通过qrt-pcr分析分析确定，与来自15位患者的配对的相邻正常膀胱尿路上皮组织标本相比，buc组织中的ripk4表达增加。(d)免疫组织化学的典型图像显示在一个buc组织样品中ripk4的低表达和在三个buc组织样品中ripk4的高表达。原始放大倍数，×200。(e)kaplan-meier生存曲线比较所有buc患者的低和高ripk4表达水平与累积生存率之间的关系。图2.下调或上调ripk4的表达分别增强或抑制体外和体内buc细胞的迁移和入侵能力。(a)用表达ripk4shrna-1，shrna-2，shrna-3和shrna-4的慢病毒或对照shrna感染t24和rt4细胞；蛋白质印迹测量ripk4蛋白质水平。(b)伤口愈合测定显示与对照细胞相比，ripk4沉默的t24和rt4细胞具有较低的运动性。(c)matrigel入侵检测显示，与对照细胞相比，ripk4沉默的t24和rt4细胞的侵袭能力降低。(d)条件培养基培养沉默ripk4和对照shnc人脐静脉内皮细胞(huvec)典型图像。(e)在严重联合免疫缺陷(scid-beige)小鼠体内，沉默ripk4抑制t24和rt4细胞侵袭和转移。上图：用t24-载体，t24-shripk4，rt4-载体，rt4-shripk4细胞注射的小鼠的四个肺结节样品进行苏木精和曙红染色的实例。原始放大倍数，×200；下图：尾部注射混和的对照shrnat24和对照shrnart4，和ripk4shrnat24与ripk4shrnart4细胞后8周，小鼠肺部转移的数目(每组n＝7)，在解剖显微镜下检查结节。对照shrnat24和rt4细胞(红色；平均值±sem，t24为13.3±4.1，rt4为14.4±7.0)ripk4shrnat24和ripk4shrnart4(蓝色；平均值±sem，t24为6.2±2.8，rt4为3.4±2.8)。(f)蛋白质印迹显示biu87-ripk4细胞中的异位ripk4表达显著高于biu87-载体细胞中ripk4的表达。(g)伤口愈合测定证明biu87-ripk4细胞比biu87-载体细胞具有更高的运动性。(h)细胞侵袭实验(transwell)表明ripk4的异位过表达增强biu87细胞的侵袭。(i)用条件培养基培养ripk4-过表达细胞和载体对照细胞的人脐静脉内皮细胞(huvec)的典型图像。(j)体内重度联合免疫缺陷(scid-beige)小鼠，其ripk4的过表达促进biu87细胞侵袭和转移。上图：biu87载体和biu87-ripk4细胞注射小鼠的四个肺结节样品，用苏木精和伊红染色，原始放大倍数，×200。下图：尾部注射biu87-载体细胞和biu87-ripk4细胞8周，在解剖显微镜下检查小鼠肺部转移结节的数目(每组n＝7)。biu87-载体细胞(红色；平均值±sem，3.0±2.2)和biu87-ripk4细胞(蓝色；平均值±sem，平均值±sem，11.1±4.9)。通过student'st检验，*p<0.05，**p<0.01。图3.ripk4调节buc细胞和组织中的vegf-a表达。(a)使用dna微阵列实验，转染t24-shripk4与转染对照t24-shnc相比较，差异表达基因(>2倍，p<0.001)根据它们的功能分类。每个类别中的基因用括号括起来。(b)t24-shripk4细胞与t24-shnc细胞相比较，cdh1，cd82，hpse，mmp7，met，tp53，smad2，cd44，fn1，fat1，itgb3，kiss1，mmp11，mmp13，vegf-a，tgfb1和mtss1这17个与迁移/血管生成相关基因，显示超过2倍的mrna差异表达。(c)蛋白质印迹分析显示在t24和rt4细胞中通过shrna转染导致ripk4沉默，vegf-a水平降低而cd82水平升高；而在biu87细胞中，通过pcdna-ripk4转染ripk4异位过表达，vegf-a水平升高和cd82水平降低。(d)免疫组织化学图像显示了典型buc组织样品中高表达的ripk4和高表达的vegf-a。原始放大倍数，×200。ripk4和vegf-a水平呈正相关(p＝0.005)。(e)vegf-a的上调与buc患者的存活率低显著相关。图4.特定shrna沉默vegf-a或nf-κb-p65后可部分抑制ripk4介导的buc的biu87细胞emt和入侵/迁移。(a)通过western印迹，测量表达vegf-ashrna-1，shrna-2，shrna-3和shrna-4的慢病毒或对照shrna感染biu87细胞的vegf-a蛋白水平。(b)通过western印迹，测量表达nf-κb-p65shrna-1，shrna-2，shrna-3和shrna-4的慢病毒或对照shrna感染biu87细胞的nf-κb-p65蛋白水平。(c)westernblot结果显示沉默ripk4-biu87细胞的vegf-a或nf-κb-p65，细胞核内nf-κb-p65和vegf-a表达下降。使用β-肌动蛋白作为内部参照。(d)westernblot结果显示，沉默ripk4-biu87细胞的vegf-a或nf-κb-p65沉默后，间充质细胞标志物(波形蛋白和纤连蛋白)水平降低，上皮标志物e-钙粘蛋白和β-catenin)增加。使用β-肌动蛋白作为内部参照。(e)伤口愈合测定显示沉默vegf-a或nf-κb-p65可抑制ripk4-biu87细胞增强的迁移能力。(f)transwell实验显示shvegf-a或shnf-κb-p65处理后ripk4-biu87细胞的侵袭能力受到显著抑制。三个独立的实验数据，平均值±se。(g)所示条件培养基培养转导载体，ripk4，ripk4shnf-κb-p65，ripk4shvegf-a的人脐静脉内皮细胞(huvec)，其血管形成实验的典型图像。studentt检验*p<0.05。图5.过度表达ripk4激活nf-κb信号传导。(a)在所示细胞中分析nf-κb萤光素酶报道基因的活性。每条代表三次独立实验的平均值±sd。(b)emsa显示在ripk4转导的细胞中内源性nf-κb活性增加并且在ripk4沉默的细胞中活性降低。oct-1-dna结合复合物作对照。(c)western印迹所示细胞中核nf-κb-p65，细胞质nf-κb-p65，ikk，p-ikk，iκb和p-iκb水平。使用β-肌动蛋白作为对照。(d)相对于对照shnct24和rt4细胞，免疫荧光染色显示shripk4t24和rt4细胞中p65水平降低，以及与biu87-载体细胞相比，biu87-ripk4细胞中p65水平升高。student'st检验，*p<0.05，**p<0.01。图6.ripk4维持nf-κb激活。(a)ripk4稳定buc细胞中的traf2，rip和nemo含量。(b)用tnf-α(10ng/ml)处理的指定细胞，western印迹分析k63连接的rip(上图)，traf2(中图)和nemo(下图)多聚泛素化水平。(c)western印迹分析tnf-α(10ng/ml)处理的指定细胞中的iκbα表达的水平，使用β-肌动蛋白作对照。图7：buc细胞系和组织中ripk4的表达和emt标志物之间的相关性。(a，b)蛋白质印迹和免疫荧光染色测定显示与那些对照shrna处理的细胞相比，shripk4敲低ripk4导致t24细胞中上皮生成物(e-钙粘蛋白和β-连环蛋白)水平升高和间充质标志物(波形蛋白和纤连蛋白)水平降低。(c，d)蛋白质印迹和免疫荧光染色测定显示与对照shrna处理的细胞相比，shripk4敲低ripk4导致rt4细胞中上皮生成物(e-钙粘蛋白和β-连环蛋白)水平增加和间充质标志物(波形蛋白和纤连蛋白)水平降低。(e，f)western印迹和免疫荧光染色测定显示与biu87-载体细胞相比，biu87-ripk4细胞中的上皮标志物(e-钙粘蛋白和β-连环蛋白)水平降低以及间充质标志物(波形蛋白和纤连蛋白)水平升高。(g)免疫组织化学染色显示buc组中高水平的ripk4伴随e-钙粘蛋白和β-连环蛋白水平的降低以及波形蛋白和纤连蛋白水平增加。原始放大倍数，×200。图8：ripk4/nf-κb/vegf-a轴在人类bucs中的临床相关性。(a)emsa显示nf-κb-dna复合物；蛋白质印迹显示ripk4表达；qrt-pcr分析临床样本vegf-amrna的表达。(b)112例人原发buc标本，ripk4水平与nf-κb-p65表达正相关，显示两个典型案例。原始放大倍数，×200。(c)p-p65的阳性表达与buc患者的较差存活显著相关。图9：gepia的ripk4和vegf-amrna表达的分析。(a)在buc中ripk4水平与vegf-a表达正相关。(b)黑素瘤中ripk4水平与vegf-a表达正相关。(c)胸腺瘤中ripk4水平与vegf-a表达呈正相关。表1显示了bc患者中ripk4水平与临床病理学变量之间的关系。表2单变量分析112例bc患者生存，显示对buc生存有影响的变量。表3多变量分析112例bc患者生存，显示对buc生存有影响的变量。表4显示ripk4表达水平和emtmaker之间的关系。表5显示17个与转移和血管生成有关差异表达的基因(超过2倍的变化；p<0.001)。表6显示bc患者ripk4表达与vegf-a,cd82,nf-κb-p65之间的关系。具体实施方式下面结合附图和实验数据对本发明做进一步的解释和说明1、载体，逆转录病毒感染和转染通过将pcr扩增的人ripk4编码序列亚克隆到载体pmscv(clontech)中，构建过表达人ripk4的载体pmscv/ripk4。我将四种短发夹rna(shrna)寡核苷酸沉默内源性ripk4克隆到载体psuper-retro-puro产生psuper-retro-ripk4-的shrna(s)。构建慢病毒shrna的nf-κb-p65，构建慢病毒vegf-a的shrna。慢病毒感染后48小时，选择稳定表达ripk4，ripk4-shrna,nf-κb-p65-shrna,andvegf-a-shrna。2、buc患者ripk4上调为了评估在buc中ripk4的表达模型，我们对包括biu87,5637，t24，ej和rt4细胞在内的几种buc细胞系中的ripk4蛋白水平进行了分析，发现具有较强的侵袭性的t24，ej和rt4中ripk4水平高，而弱侵袭性的biu87和5637中，ripk4水平低，(图1a)。对15对人原代buc组织及其相应的非癌性膀胱尿路上皮组织进行qrt-pcr。与相应的非癌组织相比，在原始buc的86.7％(13/15)中检测到ripk4在mrna水平的过度表达(图1b)。与qrt-pcr分析的结果相一致，westernblotting显示，86.7％(13/15)的人原代buc组织中ripk4的水平高于相同患者的匹配的非癌组织(图1c)。此外，在接受根治性膀胱切除术的112个临床组织中，使用ihc检测ripk4的蛋白质水平。ihc结果显示ripk4蛋白主要存在于癌细胞的细胞质中。在54/112(48.2％)的buc中观察到ripk4的水平高，其余58例(51.8％)的ripk4水平低(图1d)。表1显示了buc患者中ripk4水平与临床病理学变量之间的关系。bucs中高水平的ripk4与高级别的pt状态(p＝0.003)和pn状态(p＝0.004)显著相关。ripk4水平与其他临床病理特征无明显相关性，包括患者的年龄，性别，肿瘤大小，肿瘤大小多样性或肿瘤分级。kaplan-meier分析显示buc患者的高水平的ripk4其总体生存率(os)较低，(p<0.001，图1e)。在单变量分析中，buc患者高水平的ripk4与较低的总体生存率密切相关(p<0.001；补充表s2)。除了ripk4水平外，还对患者的年龄，患者性别，肿瘤大小，肿瘤多样性，肿瘤分级和肿瘤分期值进行了单变量分析其对总生存率的影响。在单变量分析中显示对患者生存有显著影响的变量列于表2中，进一步进行多变量分析。结果显示高水平ripk4是buc患者总体生存率低的独立预测因子(p<0.001；附表s3)。3、下调或上调ripk4的表达增强或抑制体外和体内buc细胞的迁移和入侵能力为了确定ripk4在buc侵袭和转移中的功能，我们构建了转染shrna或阴性对照shnc至t24和rt4细胞的几种稳定细胞系。在所测试的四种ripk4shrna中，shrna-3在t24和rt4细胞系中产生最一致的敲低结果，因此被选择用于后续研究(图2a)。伤口愈合和基质胶侵袭实验表明，与对照shnc细胞相比，shrna-3转染敲低ripk4显著降低了t24和rt4细胞的迁移和侵袭能力(图2b和c)。另外，ripk4-shrnat24和ripk4-shrnart4细胞的条件培养基显示出诱导huvec的促血管生成能力下降(图2d)。更重要的是，在肺转移体内动物模型，敲低t24和rt4细胞中的ripk4后，转移结节的大小和数目显著减少(图2e)。这些结果意味着敲低ripk4抑制buc细胞的侵袭和转移。为了进一步评估ripk4在buc进展中的功能，我们在buc细胞系biu87中短暂表达ripk4。通过蛋白质印迹，在biu87-ripk4稳定细胞中发现ripk4蛋白质的水平高，而在对照组稳定的biu87-vector细胞系中ripk4蛋白质的水平低(图2f)。ripk4的过表达，使biu87细胞的迁移和侵袭能力显著增加(图2g和h)。另外，ripk4转导的biu87细胞的条件培养基显示诱导huvec血管形成的能力增强(图2i)。此外，在体内肺转移动物模型的biu87细胞中，过度表达ripk4后其转移结节的大小和数量急剧增加(图2j)。这些结果与敲低ripk4数据一致，并显示ripk4促进buc细胞的侵袭和转移。4、ripk4上调了vegf-a的表达为了进一步研究在buc中ripk4介导的细胞迁移/侵入的基本分子机制，使用dna微阵列比较转染了shrnaripk4和shnc的t24细胞的全基因表达谱。在233个差异表达基因中(超过2倍的变化；p<0.001)，97个上调，136个下调(图3a)。其中有17个基因与转移和血管生成有关(cdh1，cd82，hpse，mmp7，met，tp53，smad2，cd44，fn1，fat1，itgb3，kiss1，mmp11，mmp13，vegf-a，tgfb1和mtss1)(图3b和supplementarytables5)。western印迹也显示，使用shripk4转染敲低ripk4显著下调vegf-a水平，并显著增加t24和rt4细胞中cd82的丰度(图3c)。一致地，通过pcdna-ripk4转染biu87细胞使ripk4过度表达，显著上调vegf-a水平，降低cd82水平(图3c)。此外，我们在112例buc标本上进行了ripk4和vegf-a的ihc染色。结果显示，在该buc组中，ripk4水平与vegf-a水平呈正相关(p＝0.005，图3d和补充表6)。然而，低ripk4和高ripk4组之间的cd82水平没有显著差异(p＝0.411，补充表6)。重要的是，我们观察到buc组中较高的vegf-a水平和较差的存活率之间的关系(p<0.001，图3e)，这与buc标本中ripk4的水平较高一致。这些结果表明vegf-a在ripk4促进buc的侵袭和转移中起主要作用。5、vegf-a介导ripk4诱导buc细胞emt和侵袭/转移为了研究ripk4和emt之间的关系，在沉默t24和rt4细胞中的ripk4后，如western印迹(图7a和c)和免疫荧光染色(图7b和d)所示两种上皮标志物e-钙粘蛋白(e-cadherin)和β-连环蛋白(β-catenin)的蛋白质水平增加，而两种间充质标志物纤连蛋白(fibronectin)和波形蛋白(vimentin)的蛋白质水平降低。相比之下，在biu87细胞中ripk4异位过表达后，western印迹(图7e)和免疫荧光染色(图7f)显示，e-钙粘蛋白和β-连环蛋白水平降低，而纤连蛋白和波形蛋白的纤连蛋白和波形蛋白增加。此外，对112个主要buc组织进行ihc染色。图7g显示了buc组织中emt标志物的典型ihc染色。ripk4水平与间充质标志物vimentin(p<0.001)，fibronectin(p＝0.002)呈正相关，与上皮标志物e-cadherin(p<0.001)，β-catenin(p<0.001)呈负相关(表4)这些数据表明，在buc进展中，ripk4促成了emt过程。vegf-a和nf-κb-p65促进ripk4诱导buc细胞的emt。免疫荧光染色显示ripk4-biu87t24细胞沉默vegf-a或nf-κb-p65后，e-cadherin水平升高。免疫荧光染色显示ripk4-biu87t24细胞沉默vegf-a或nf-κb-p65后，β-catenin水平升高。免疫荧光染色显示ripk4-biu87t24细胞中沉默vegf-a或nf-κb-p65后，波形蛋白的水平降低。免疫荧光染色显示ripk4-biu87t24细胞沉默vegf-a或nf-κb-p65后，纤连蛋白水平降低。为了研究在ripk4诱导buc细胞的emt和侵袭/转移是否需要vegf-a，使用shrna使biu87-ripk4细胞中的vegf-a表达沉默(图4a和c)。shvegf-a处理抑制ripk4诱导的emt，如biu87-ripk4细胞中上皮标志物(e-钙粘蛋白和β-连环蛋白)丰度上升和间充质标志物(波形蛋白和纤连蛋白)水平降低所示(图4d和图8)。另外，创伤愈合(图4e)，侵袭实验(transwellassays)(图4f)和huvec血管形成实验(图4g)表明，vegf-a沉默后，显著抑制biu87-ripk4细胞的迁移和侵袭能力。总之，这些数据提供了证据表明vegf-a介导ripk4诱导的emt和buc细胞的侵袭/转移。6、过表达的ripk4激活nf-κb信号nf-κb是vegf-a转录的关键调节因子(karin和greten，2005)。因此，我们研究了buc中ripk4参与调节nf-κb通路。ripk4的过度表达显著提高了nf-κb荧光素酶报告基因的活性，而ripk4的沉默显著降低了报告基因的活性(图5a)。重要的是，在ripk4沉默的细胞中nf-κb-p65的核水平显著降低，而在ripk4转导的细胞中则增加(图5b和c)。相比之下，通过免疫荧光染色证明的(图5d)，在biu87细胞中异位过表达ripk4后，nf-κb-p65的水平增加，而沉默ripk4nf-κb-p65的水平减低。为了进一步证实ripk4介导buc的emt和侵袭/转移通过nf-κb活化发生，在ripk4-过表达细胞中使用靶向编码nf-κb-p65(rela)，shrna-nf-κb-p65基因的shrna(图4b和4c)阻断nf-κb途径。正如所料，shrna-nf-κb-p65抑制了ripk4过表达对nf-κb活化的刺激作用(图4c)。此外，正如biu87-ripk4中上皮标志物(e-钙粘蛋白和β-连环蛋白)水平升高和间充质标志物(波形蛋白和纤连蛋白)水平降低(图4d和图8)，ripk4诱导的emt也被shrna-nf-κb-p65抑制。此外，通过伤口愈合(图4e)，transwell实验(图4f)和huvec血管生成实验(图4g)证实，shrna-nf-κb-p65减少了ripk4诱导的侵袭和转移。综上所述，我们的结果表明ripk4的致癌活性依赖于nf-κb的激活。7、ripk4维持nf-κb激活刺激肿瘤坏死因子(tnf)诱导nf-κb受体复合物中的rip，traf2和nemo在快速募集和泛素化，该过程对于tnf诱导的nf-κb活化是关键的(ea等，2006；wang等al，2001)。与载体对照细胞相比，分离ripk4过表达细胞的细胞膜，观察到rip，traf2和nemo的水平显著增加，并且与rnai载体转导的细胞相比，分离沉默ripk4细胞的细胞膜，相同蛋白质(rip，traf2和nemo)的水平显著降低(图6a)。图6b显示ripk4转导的细胞k63连接rip，traf2和nemo的多聚泛素化水平高于相应的对照细胞，ripk4沉默的细胞中k63-多聚泛素化水平低。这表明在nf-κb信号传导中，ripk4促进泛素共轭结合。nf-κb信号通路可根据不同的诱导因子如tnf和il-1β进一步细分；因此，我们进一步观察到，tnf-α处理过表达ripk4细胞的iκb下降水平显著延长，而在ripk4沉默的细胞中缩短(图6c)。这些结果表明ripk4通过促进nf-κb信号传导的相关蛋白泛素化结合来维持nf-κb活化。8、人buc中ripk4诱导的nf-kb激活的临床相关性最后，我们研究了buc细胞ripk4激活nf-κb的临床相关性。emsa和qrt-pcr结果显示人类buc的ripk4水平与nf-κb活性呈正相关，并且与nf-κb下游基因vegf-amrna表达水平呈正相关(图8a)。一致的是，对112个组织标本的ihc分析显示，ripk4水平与p-p65水平呈正相关(p<0.001；图8b)。重要的是，p-p65的阳性与该buc队列的生存率差有关(p＝0.001，图8c)。此外，根据标准处理流程，gepia(http://gepia.cancerpku.cn)分析tcga中的23种癌症和正常样品的rna测序表达数据的结果，buc(r＝0.2，p＝5.5e-05)，黑色素瘤(r＝0.45，p＝3.5e-05)和胸腺瘤组织(r＝0.73，p＝9.7e-21)中ripk4的水平与vegf-a表达水平显著相关(图9)。这些数据支持了我们的假设，即ripk4过表达激活nf-κb信号转导途径，最终导致侵袭性的buc表型和buc的不良临床结果。表1显示了bc患者中ripk4水平与临床病理学变量之间的关系。supplementarytable1.correlationbetweenripk4andtheclinicopathologicalfeaturesofbcabbreviations:achi-squaretest；bmedianage；cmediansize；bc＝bladderurothelialcarcinoma；significantassociationsareshowninboldfaceinthep-valuecolumn(p-value<0.05).表2单变量分析112例bc患者生存，显示对buc生存有影响的变量。abbreviations:amedianage；bmediansize；hr＝hazardratio；ci＝confidenceinterval；bc＝bladderurothelialcarcinoma；significantassociationsareshowninboldfaceinthep-valuecolumn(p-value<0.05).表3多变量分析112例bc患者生存，显示对buc生存有影响的变量supplementarytable3.multivariateanalysisofsurvivalin112casesofbcabbreviations:hr＝hazardratio；ci＝confidenceinterval；bc＝bladderurothelialcarcinoma；significantassociationsareshowninboldfaceinthep-valuecolumn(p-value<0.05).表4显示ripk4表达水平和emtmaker之间的关系supplementarytable4.associationbetweentheexpressionofripk4andemtmarkersinbcabbreviations:afisher’sexacttest；emt＝epithelial-mesenchymaltransition；bc＝bladderurothelialcarcinoma；significantassociationsareshowninboldfaceinthep-valuecolumn(p-value<0.05).表5显示17个与转移和血管生成有关差异表达的基因(超过2倍的变化；p<0.001)supplementarytable5alistofdifferentiallyexpressedgenesrelatedtomigrationandangiogenesisofbc(foldchange>2；p<0.001)表6显示bc患者ripk4表达与vegf-a,cd82,nf-κb-p65之间的关系supplementarytable6.associationbetweentheexpressionofripk4andvegf-a,cd82nf-κb-p65inbcabbreviations:afisher’sexacttest；bc＝bladderurothelialcarcinoma；significantassociationsareshowninboldfaceinthep-valuecolumn(p-value<0.05).当前第1页12当前第1页12