专利名称：抑制mphosph1与prc1之间的结合的作用剂的筛选方法
技术领域：
本发明涉及采用M期磷蛋白(MPHOSPHl)和细胞质分裂蛋白蛋白调控 因子1 (PRC1)的结合为指标的筛选方法。可以根据本方法进行鉴定适用于 癌症，特别是膀胱癌的治疗或预防的作用剂。
背景技术：
膀胱癌是人群中第二常见的泌尿生殖器肿瘤，全世界每年约有357,000 例的新发病例(Parkin DM etal.，CA Cancer J Clin 2005, 55:74-108)。这其中 约有1/3的患者很可能在诊断时已成为浸润性疾病或转移性疾病(ParkinDM et al., CA Cancer J Clin 2005, 55: 74-108; Sternberg CN, Ann Oncol 1995, 6: 113-26; Ardavanis A et al., Br J Cancer 2005, 92: 645-50)。虽然对于那些4又发 生肌肉浸润性膀胱癌的患者的治疗而言根治性膀胱切除术被视为"黄金标 准"，然而这些患者中约有50%在接受膀胱切除术后2年出现转移，并随后 死于该疾病(SternbergCN， Ann Oncol 1995,6: 113-26)。
近二十年间，CMV (顺铂(dsplatin)、曱氨蝶呤(methotrexate)、长春碱 (vinblastine)或M-VAC(甲氨蝶呤、长春碱、多柔比星、顺柏)等基于顺铂的 组合化学疗法成为晚期膀胱癌患者的首选(Ardavanis A et al.， Br J Cancer 2005, 92: 645-50; Lehmann J et al., World J Urol 2002， 20: 144-50)。然而，总 体预后仍然很差。而且，M-VAC化学疗法的副作用极大(Vaughn DJ, Semin Oncol 1999, 26(suppl 2): 117-22)。因此，人们热切希望开发新的针对膀胱癌 的分子靶向药物。
cDNA微阵列已被证明是能够同时分析数千基因的表达图式的有效手 段。基于cDNA微阵列的癌细胞与正常细胞的全基因组表达模式的比较可 提供有用的信息来帮助发现用于癌症诊断和治疗开发的候选靶标分子(Debouck C et al., Na Genet 1999, 21: 48-50)。最近的药物开发研究着重以与 癌症发生相关的重要分子为靶标，以伊马替尼(imatinib)、去铁胺(mesylate) 和曲妥单抗(trastuzumab)为代表。通过将RNAi与癌表达模式分析相结合， 可望鉴定这才羊的治疗药物靶标(Clarke PA et al., Eur J Cancer 2004, 40: 2560-91)。
通过全基因组表达分析，分离了与肝细胞癌(Hamamoto R et al., Nat Cell Biol2004, 6: 731-40; YagyuR et al., Int J Oncol2002, 20: 1173-8)、滑膜肉瘤 (Nagayama S et al.， Oncogene 2004， 23: 5551-7; Nagayama S et al.， Oncogene 2005. 24: 6201-12)、肾细胞癌(Togashi A et al.， Cancer Res 2005, 65: 4817-26) 和乳腺癌(WO 2005/28676)的发生和/或进展相关的多个癌基因。这样的分子 被认为是用于开发新治疗方法的良好候选分子。
M-VAC等细胞毒剂屡屡产生严重的不良反应，因此，基于已经充分阐 明的机理来慎重地选择新的靶标分子，对于开发将副作用的危险性控制在 最小限度的有效抗癌剂而言是非常有益的。在此目标的基础上，曾经进行 了 26例膀胱癌与29例正常人组织的表达模式分析，发现了在膀胱癌中特 异性过表达的多个基因(Takata R et al" Clin Cancer Res April 1, 2005， 11(7): 2625-36; Saito-Hisaminato A et al" DNA Res 2002, 9: 35-45)。 MPHOSPHl(参 照C2093)被鉴定为膀胱癌中过表达的基因之一。
而且，MPHOSPHl先前被鉴定为在G2/M过渡期被特异性磷酸化的蛋 白质，而且;f皮定性为正末端指向驱动蛋白相关蛋白(plus-end-directed kinesin related protein)(Abaza A et al.， J Biol Chem 2003, 278: 27844-52)。 M尸7/OS7W7 cDNA编码1780个氨基酸的蛋白质，该1780个氨基酸包括3个NH2型驱 动蛋白相关蛋白的特征结构域即NH2驱动蛋白马达域、中央巻曲螺旋-茎柄 域和C-球形尾域。而且，先前已经证明MPHOSPHl是在胞质分裂中起重要 作用的正末端指向分子马达，在HeLa细胞中MPHOSPHl从后期到末期在 纺锤体的中间区蓄积(Abaza A et al" J Biol Chem 2003, 278: 27844-52; Kamimoto T et al" J Biol Chem 2001， 276: 37520-8)。
有报道称PRC1与数个驱动蛋白家族蛋白相互作用(BanRetal.， JBiol Chem 2004, 279: 16394-402; Kurasawa Y et al.， EMBO J 2004, 23: 3237-48; Zhu C & Jiang W， Proc Natl Acad Sci USA 2005, 102: 343-8; Gruneberg U et al., J Cell Biol 2006， 172: 363-72)。有报道称Hela细胞中抗PRC1抗体对PRC1的抑制引起双核细胞的增加(Mollinari C et al., J Cell Biol 2002， 157: 1175-86)。而且，有报道称PRCl可以与数种与细胞分裂事件特别是胞质 分裂相关的分子(例如KIF4或KIF14)相互作用(EMBO J 2004, 23: 3237-48; MollinariCetal.,Mol Biol Cell 2005, 16: 1043-55)。而且，PRCl已经由本发 明人等鉴定在乳腺癌中过表达(WO 2005/28676)。
发明内容
本发明基于，至少部分基于体内的MPHOHPH1与PRCl间的相互作用 的发现。MPHOSPHl和PRCl这两种蛋白均在膀胱癌细胞中过表达，而 MPHOSPHl的表达仅见于膀胱癌细胞和正常睾丸组织。如本说明书中揭示 的，如果抑制编码这些蛋白的基因中的一个，细胞质分裂就会受到抑制， 诱导多核化，从而最终导致表达该基因的细胞的增殖抑制。
因此，本发明提供一种筛选抑制MPHOSPHl与PRCl的结合的作用剂 的方法。更具体地，该方法包括下述步骤a)在作用剂存在下使MPHOSPHl 与PRCl接触、b)检测MPHOSPHl与PRCl的结合水平、c)与不存在作用 剂的条件下检测出的MPHOSPHl与PRCl的结合水平相比较；d)选择降低 MPHOSPHl与PRCl的结合水平的作用剂。在本方法的语境中，也可以用 片段来代替完整MPHOSPHl或完整PRC1使用，只要各片段能够保持与其 配偶配体的结合能力。本筛选中特别优选使用的MPHOSPHl片段包括这样 的片段，它们包含SEQIDNO:2的第1188-1718位的氨基酸残基。
考虑到经上述方法鉴定的作用剂很可能抑制表达所述蛋白质的细胞的 增殖，这样鉴定出的作用剂可作为膀胱癌的治疗或预防的候选物质。因此， 本发明还提供鉴定抑制膀胱癌细胞增殖的作用剂的方法，以及用于膀胱癌 治疗或预防的作用剂。
图1显示了膀胱癌与正常组织中的MPHOSPHl的表达。图面A显示了 在来自10例膀胱癌患者的肿瘤细胞和人正常组织(显微切除的正常膀胱移 行细胞、心脏、肺、肝脏、肾脏)中通过半定量RT-PCR测定的MPHOSPHl 的表达。以GAPDH的表达作为定量对照。图面B显示了膀胱癌细胞系 (HT1197、 UMUC3、 J82、 HT1376、 SW780、 RT4)和正常人脏器(心脏、肺、肝脏、肾脏、脑、胰脏、睾丸、膀胱)中的MPHOSPHl转录物的Northern 印迹分析结果。图面C显示了各种人组织中的MPHOSPHl转录物的 Northern印迹分析结果。图面D显示了手术切除的膀胱癌组织(浅表性膀胱 癌2例和浸润性膀胱癌2例)和正常膀胱组织切片中使用亲和纯化抗 MPHOSPHl多克隆抗体免疫组织化学染色测定的MPHOSPHl蛋白质表达。
图2显示了细胞周期进行中膀胱癌细胞内源性MPHOSPHl蛋白质的亚 细胞定位。对于UMUC细胞，使用亲和纯化的MPHOSPHl多克隆抗体进 行了免疫组织化学染色(绿)。DAPI显示了核染色(蓝)。
图3显示了 MPHOSPHl-siRNA对膀胱癌细胞系J82和UMUC3的增殖 抑制效果。图面A显示通过western印迹(上图面)和半定量RT-PCR(下图面) 测定的MPHOSPHl表达。图面B显示了用表达MPHOSPHl-siRNA、对照 siRNA (EGFP)或MPHOSPHl错配siRNA的质粒转染的J82细胞和UMUC3 细胞的集落形成测定结果。图面C显示，与对照的导入相比较，J82细胞和 UMUC3细胞应答于MPHOSPHl-siRNA的通过MTT测定的存活力纟是高。
图4显示NIH3T3细胞中外源性MPHOSPHl的生长促进效果。图面A 显示用外源性MPHOSPHl高水平表达细胞或者模拟载体转染的细胞的 western印迹分析结果。用抗HA标签单克隆抗体验证了外源性导入的 MPHOSPHl表达。使用了 (3-肌动蛋白作为上样对照。图面B显示体外的 NIH3T3-MPHOSPH1细胞生长。采用MTT测定法测量了用MPHOPH1转染 的NIH3T3细胞(NIH3T3-MPH0PH1-弁1 、 #2、 #3)和用模拟转染的细胞 (NIH3T3-模拟41 、#2、#3)的生长。在图面C中，采用阿非迪霉素(aphidicoline) 处理24小时使NIH3T3-MPH0SPH1 (NIH3T3-MPH0SPH1-弁1)和模拟 (NIH3T3-模拟弁1)同步。停滞解除(release)后，在显示的时间点制备了细胞样 品。图面D显示了对NIH3T3-MPHOSPHl细胞实施的体内肿瘤生长测定的 结果。肿瘤的直径用测径器测定，肿瘤体积通过下式来确定0.5x(长径(larger diameter))x(短径(smaller diameter))2。采用非成对t检验来评价注射后第21 日的NIH3T3-MPHOSPH1与NIH3T3-模拟的差异(pO.001;非成对t检验)。
图5显示MPHOSPHl和PRC1的相互作用。图面A显示通过半定量 RT-PCR测定的膀胱癌病例的MPHOSPHl和PRC1的表达。使用GAPDH 表达作为定量对照。图面B显示了 MPHOSPHl和PRCl的共免疫沉淀。对 于用HA标签MPHOSPHl和myc标签PRCl蛋白转染的COS7细胞的细胞裂解物，使用抗HA或抗myc进行了免疫沉淀。对于免疫沉淀物，使用单 克隆抗HA抗体或抗myc抗体进行了免疫印迹。图面C显示了 UMUC3细 胞中内源性MPH0SPH1和外源性PRC1的亚细胞定位。内源性MPH0SPH1 蛋白(绿)与外源性PRC1蛋白(红)共定位。
图6显示MPH0SPH1中被确定与PRC1相互作用的区域。图面A为免 疫沉淀实验中使用的MPHOSPHl的片段和全长的模式图。图面B显示一系 列MPHOSPH1片段和PRC1的共免疫沉淀。对于用HA标签MPHOSPH1 和myc标签PRC1蛋白转染的COS7细胞的细胞裂解物，使用抗HA或抗 myc进行了免疫沉淀。对于免疫沉淀物，如图5的图例说明那样，使用单克 隆抗HA抗体或抗myc抗体进行了免疫印迹。
图7显示了膀胱癌细胞增殖中MPHOSPH1和PRC1的重要作用。图面 A显示了通过半定量RT-PCR (左上)、集落形成测定(左下)、MTT测定(右) 分析出的si-PRCl或对照siRNA (si-EGFP)对J82细胞的效应。图面B显示 了通过半定量RT-PCR (左上)、集落形成测定(左下)、MTT测定(右)分析出 的si-PRCl或对照siRNA (si-EGFP)对UMUC3细胞的效应。图面C显示了 用si-MPHOSPHl、 si-PRCl、或作为对照的si-EGFP转染的UMUC3细胞的 形态。对于用si-MPHOSPHl、 si-PRCl、或作为对照siRNA的si-EGFP转 染的UMUC细胞的形态，通过显微镜下观察(上图)、或免疫细胞化学(下图) 进行了评价。为了区分核与细胞质，使用DAPI和鬼笔环肽对用siRNA处 理的UMUC细胞进行了染色。
发明的
具体实施例方式
在微阵列分析检测出的在膀胱癌中上调的基因中，本发明注意到了在 绝大多数受检查的膀胱癌细胞中高度过表达的基因——M尸7/OSP/f 7 (M画phase phosphoprotein 1 ， M期磷酸蛋白1) (SEQ ID NO: 1) (NM—016195)。 Northern印迹分析显示，在除睾丸外的任何受检的正常人组织中均几乎检测 不到MPZ/OS尸///的表达。而且，使用抗MPHOSPHl多克隆抗体的免疫组 织化学染色实验明显表明膀胱癌细胞中MPH0SPH1(SEQ ID NO: 2)表达的 上调。这提示MPH0SPH1是癌症-睾丸抗原(Kanehira M et al., Cancer Res. 2007, 67(7): 3276-85)。综合起来，这些结果还提示，MPHOSPH1基因可能 是膀胱癌抗癌剂或癌肽疫苗开发的有价值的靶标。而且，免疫细胞化学染色实^r显示MPHOSPHl在间期定位于膀胱癌 细胞中的细胞核、在后期定位于中间区，在末期则定位于收缩环。而且， 已经证实利用siKNA敲低内源性MPHOSPHl,可诱导膀胱癌细胞的细胞质 分裂失败，结果使得多核细胞蓄积，并导致其后的细胞死亡。因此，通过 鉴定与MPHOSPHl相互作用的蛋白质，对膀胱癌细胞中MPHOSPHl的生 物学作用进行了研究。
发现了 MHPOSPH1与PRC1 (SEQ ID NO: 36所编码的SEQ ID NO: 37) (AF044588) (Protein regulator of Cytokinesis 1,胞质分裂蛋白调控因子1,) 相互作用，PRC1基因的表达也在膀胱癌中上调。由于它们功能相似且在膀 胱癌细胞中共同过表达，选择PRC1作为与MPHOSPHl相互作用的候选物 质。如图5所示，在膀胱癌细胞中，从间期至后期的期间，显示了 MPHOSPHl 和PRC1 (胞质分裂蛋白调控因子l)的体内相互作用和共定位，但在末期细 胞中，MPHOSPHl包围着定位在中间体中央的PRC1 (图5C)。因此，纺锤 体中MPHOSPHl和PRC1的相关性和共定位进一步支持了下述主张 MPHOSPHl是马达蛋白分子，其在细胞分裂期间沿着纺锤体移动PRCl。 它们在膀胱癌病例中的共反式激活(co-transactivation)提示(图5A)它们的相 互作用在膀胱癌发生过程中发挥着关键作用。
而且，使用特异性siRNA抑制M尸Z/OS尸//7或尸i 。中任一个的表达可 诱导多核细胞形成，其后发生细胞死亡。为了评价MPHOSPHl或PRC 1对 于膀胱癌细胞的生长或存活是否有作用，在显示高水平表达MPHOSPHl和 PRC1的膀胱癌细胞系——J82或UMUC3中用特异性siRNA敲低了内源性 MPHOSPHl或PRC 1中任一个的表达。各特异性siRNA显著抑制相应基因 的表达，其结果是对这些细胞产生显著的生长抑制，这表明MPHOSPHl和 PRC1这两者对于膀胱癌细胞的增殖都是必需的。而且，在UMUC3细胞中 敲低MPHOSPHl或PRC1表达引起多核细胞的显著增加。这些结果支持了 文献中向HeLa细胞显微注射抗PRC1抗体引起的PRC1抑制可能造成双核 细胞的增加的提议(Mollinari C et al.， J Cell Biol 2002， 157: 1175-86)。由于它 们之间相互作用的抑制可能最终诱导膀胱癌细胞细胞质分裂失败后细胞死 亡，因此，抑制它们的相互作用的作用剂作为针对膀胱癌的药物开发的靶 标可能是有价值的本发明人等提供的微阵列数据阐明了膀胱癌中的限定性MPH0SPH1过 表达。但是，被发现与MPHOSPH1相互作用的蛋白PRCl,不仅在膀胱癌 细胞中、而且在其它数种类型的人肿瘤中也过表达(数据未给出)。已报导 PRC1与数种有丝分裂事件特别是细胞质分裂相关分子例如KIF4或KIF14 相互作用(Kurasawa Y et al" EMBO J 2004, 23: 3237-48; Mollinari C et al., Mol Biol Cell 2005， 16: 1043-55),但根据本发明人等获得的膀胱癌表达才莫 式，KIF4和KIF14均不在膀胱癌中表达。这些结果提示，通过MPH0SPH1 与PRC1相互作用稳定化中间区微管束并容许细胞分裂完成而进行的细胞 分裂调节，是膀胱癌细胞中的特异性事件，虽然该相互作用对于细胞增殖 的贡献以及其它结合配偶体的存在尚待阐明。
最后，本文的发现提示，MPH0SPH1/PRC1途径可能在膀胱癌细胞中 具有致癌功能，并且可能成为膀胱癌抗癌剂开发的有潜力的分子靶标。抑 制或阻遏MPHOSPHl与PRC1的结合的作用剂的开发可能是膀胱癌治疗的 合理战略。虽然对MPHOSPHl与PRC1的结合还有必要进行进一步分析， 但本说明书中提供的认识有助于更深入理解膀胱癌癌症的发生以及开发膀 胱癌的新治疗方法。
除非另有说明，本说明书中使用的词语"一个"或"一种"或"该" 是指至少一个或至少一种。
对于物质(例如多肽、抗体、多核苷酸等)使用的术语"分离的"或"纯化的" 是指该物质基本上不含可能本包含在其天然供给源中的至少一种物质。因 此，"分离的"或"纯化的"抗体是基本上不含细胞物质(例如糖类、脂质或来 源于该蛋白(抗体)所由来的细胞或组织源的其它污染蛋白)的抗体，和/或在
不含细胞物质"包括多肽的制备物，其中该多肽与细胞(该多肽分离自该细胞 或者在该细胞中重组表达)的细胞组分分开。因此，基本上不含细胞物质的 多肽包括这样的多肽制备物，其中多肽制备物含异源蛋白(本说明书中也称 为"污染蛋白")少于约30%、 20%、 10%或5%(以干重计)。当多肽为重组产 生时，还优选其基本上不含培养基，包括培养基少于蛋白质制备物体积的 约20%、 10%或5%的多肽制备物。当多肽是由化学合成产生时，优选基本 上不含化学前体或其他化学物质，包括这样的多肽制备物，其中蛋白合成 中涉及的化学前体或其他化学物质少于蛋白质制备物体积的约30%、 20%、10%或5%(以干重计)。例如，对蛋白制备物进行十二烷基硫酸钠(SDS)-聚丙 烯酰胺凝胶电泳及凝胶考马斯亮蓝等染色后，出现单一条带，可以证明该 蛋白制备物含有分离的或纯化的多肽。在优选的实施方案中，本发明的抗 体或其片段是分离的或纯化的。
"分离的"或"纯化的"核酸分子，例如cDNA分子，当由重组技术产生时， 可基本上不含其它细胞物质或培养基，或者当其由化学合成时，其可基本 上不含化学前体或其它化学物质。在优选的实施方案中，编码本发明的抗 体或其片段的核酸分子是分离的或纯化的。
术语"多肽"、"肽"和"蛋白(质)"在本说明书中可互换使用，是指 氨基酸残基的多聚体。这些术语适用于其中一个或多个氨基酸残基是修饰 残基或非天然存在的氨基酸残基(例如相应的天然存在的氨基酸的人工化学 模拟物)的氨基酸多聚体，还适用于天然存在的氨基酸多聚体。
术语"氨基酸"指的是天然存在及合成的氨基酸，以及功能类似于天 然存在的氨基酸的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然存在的氨基酸是由 遗传密码编码的那些，以及在细胞内翻译后被修饰的氨基酸，(例如羟脯氨 酸(hydroxyproline) 、 y-叛基谷氨酸(y-carboxyglutamate)和0-磷酸丝氛酸 (O-phosphoserine))。短语"氨基酸类似物"指的是具有与天然存在的氨基酸 相同的基本化学结构(例如与氢、羧基、氨基和R基结合的a碳)但具有修饰 的R基或修饰的肽骨架的化合物(例如高丝氨酸(homoserine)、正亮氨酸 (norleucine)、曱硫氨酸亚砜(methionine sulfoxide)、曱硫氨酸甲基铳 (methionine methyl sulfonium))。短语"氨基酸模拟物"指的是具有与氨基酸 的一般化学结构不同的结构、但功能类似于天然存在的氨基酸的化合物。
在本说明书中氨基酸可用其通常公知的3个字母符号表示，或用 IUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commission(国际理论和应用化学联 合会-国际生物化学联合会生物化学命名委员会)推荐的单字母符号表示。
除非另外特别说明，术语"多核苷酸"、"寡核苷酸"、"核苷酸"、 "核酸"和"核酸分子"在可互换使用，而且，类似于氨基酸，也可以用 其通常公认的单字母代码表示。与氨基酸的情况类似，这其中包括天然的 核酸聚合物以及非天然存在的核酸聚合物这两者。
人M尸/ZOSP//7的核苷酸序列示于SEQ ID NO: 1 (GenBank登录号 NM_016195)。在本i兑明书中，短语"M尸7/OS尸/i7基因，，包括人以及其他动物的M尸/zas"/v/7基因，所述其他动物包括非人灵长类、小鼠、大鼠、狗、
猫、马和牛。但是，本发明不限于上述，还包括相应于M尸/ZOS尸/^基因的
等位突变体及在其他动物中发现的基因。
人M尸/fOS尸///基因编码的氨基酸序列示于SEQIDNO: 2(GenBank登 录号NP—057279.2)。说明书中的由M尸7/OS尸// 7基因编码的多肽称为 "MPHOSPH1",有时也称"MPHOSPHl多肽"或"MPHOSPH 1蛋白"。
人尸i C7基因的核苦酸序列示于SEQIDNO: 36。而且，已知其具有分 别包括15、 14和14个外显子的3个不同的转录变体。变体的核苦酸序列 和氨基酸序列可以在GenBank上检索(下文中，将GenBank登录号 NM—003981、 NM—199413、 NM—199414的变体的序列分别称为VI、 V2和 V3 ，对应的氨基酸序列可分别以GenBank登录号NM—003972.1 、 NP—955445.1、 NM—955446.1查得)。除去VI的外显子13和14中的可变变 异(alternative variation),其它全部外显子在3个变体中是共通的。V2变体 没有VI的外显子14,并在最后一个外显子内包含一个新的提前终止密码 子(early stopcodon)。 V3变体的外显子14完全缺失，V3的外显子13比VI 的3'末端短77bp，并在最后一个外显子中包含一个新的提前终止密码子。 变体V1、 V2和V3分别编码620、 606和566个氨基酸的蛋白质。
在本说明书中，短语"尸i C7基因"包括人以及其他动物的PRC1基因， 所述其他动物包括但不限于非人灵长类、小鼠、大鼠、狗、猫、马和牛， 还包括相应于尸i C7基因的等位突变体及在其他动物中发现的基因。
人户i C/基因编码的氨基酸序列示于SEQ ID NO: 37，在本说明书中， 将尸AC7基因编码的多肽称为"PRC1",有时称为"PRC1多肽"或"PRC1 蛋白"。
根据本发明的一个方面，功能等价物也被认为是"MPHOSPH1多肽" 或"PRC1多肽"。在本说明书中，蛋白质的"功能等价物"是具有与蛋白 质等价的生物活性，特别是结合活性的多肽。即，任何保留MPHOSPH1蛋 白针对PRC1蛋白的活性、或者PRC1蛋白针对MPHOSPH1蛋白的活性的 多肽都可以用作本发明中所述的功能等价物。所述功能等价物包括那些在 MPHOSPH1蛋白或PRC1蛋白天然存在的氨基酸序列中取代、缺失、添加 或插入一个或多个氨基酸而得到的多肽。通常已知蛋白质中1个或多个氨基酸的修饰不会对该蛋白质的功能造
成影响(Mark DF ef a/" Proc Natl Acad Sci USA 1984, 81: 5662-6; Zoller MJ & Smith M, Nucleic Acids Res 1982， 10: 6487-500; Wang A & <a/.， Science 1984, 224:1431-3; Dalbadie-McFarland G & a/" Proc Natl Acad Sci USA 1982, 79: 6409-13)。而实际上，已知经突变的蛋白或修饰的蛋白，具有通过在特定氨 基酸序列中取代、缺失、插入和/或添加一个或多个氨基酸残基而被修饰的 氨基酸序列的蛋白，保留原来的生物活性(Mark " a/.， Proc Natl Acad Sci USA 81: 5662-6 (1984); Zoller and Smith, Nucleic Acids Res 10:6487-500 (1982); Dalbadie-McFarland & a/" Proc Natl Acad Sci USA 79: 6409-13 (1982))。因此，本领域技术人员将承认本发明的上下文中涵盖氨基酸序列 的改变单个氨基酸或一小部分氨基酸的个别添加、缺失、插入或取代，或 者被认为是"保守修饰"的修饰，即氨基酸的改变导致产生具有类似功能 的蛋白质的修饰。
对于氨基酸突变的数目没有特殊限制，只要能够保持蛋白质的活性即 可。但是，通常改变数目优选为氨基酸序列的5%或以下。因此，在优选的 实施方式中，这样的突变体中发生突变的氨基酸的数目通常为30个氨基酸 或更少，优选20个氨基酸或更少，更优选10个氨基酸或更少，更优选6 个氨基酸或更少，更优选3个氨基酸或更少。
优选将待突变的氨基酸残基突变为保留氨基酸侧链性质的其他氨基酸 (该过程即公知的保守氨基酸取代)。氨基酸側链性质的例子包括疏水氨基酸 (丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、曱硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、色氨酸、酪 氨酸、缬氨酸)、亲水氨基酸(精氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、天冬酰胺、半 胱氨酸(cystein)、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、赖氨酸、丝氨酸、 苏氨酸)以及具有以下共有官能团或特性的侧链脂肪族侧链(甘氨酸、丙氨 酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸)；含羟基侧链(丝氨酸、苏氨酸、 酪氨酸)；含硫原子侧链(C、 M);含羧酸和酰胺侧链(天冬氨酸、天冬酰胺、 谷氨酸、谷氨酰胺)；含碱(base)侧链(精氨酸、赖氨酸、组氨酸)和含芳香族 侧链(组氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸)。给出功能上类似的氨基酸的保 守取代表是本领域公知的。例如，以下8组分别包含彼此互为保守取代的 氨基酸
1)丙氨酸(A)、甘氨酸(G);2) 天冬氨酸(D)、谷氨酸(E);
3) 天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q);
4) 精氨酸(R)、赖氨酸(K);
5) 异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、曱硫氨酸(M)、缬氨酸(V);
6) 苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W);
7) 丝氨酸(S)、苏氨酸(T);及
8) 半胱氨酸(C)、曱硫氨酸(M)(参见例如Creighton、 Proteins (l984))。 本发明的MPHOSPHl或PRC1蛋白中包括这样的保守修饰的多肽。但
本发明并不限于此，MPHOSPHl和PRC1蛋白还包括非保守性修饰，只要 它们保留原蛋白的结合活性。而且，修饰的蛋白不排除多态性变体 (polymorphic variants)、种间同源物、以及由这些蛋白的等位基因编码的蛋 白。
通过添加一个或多个氨基酸残基而修饰的蛋白的例子是融合蛋白。融 合蛋白是MPHOSPHl蛋白或PRCl蛋白与其他肽或蛋白质的融合物，也可 以用于本发明。融合蛋白可通过本领域技术人员公知的技术来制备，例如
通过将编码本发明的MPHOSPHl蛋白或PRCl蛋白的DNA与编码其他肽 或蛋白的DNA连接，使得读码框一致，然后将融合DNA插入表达载体并 在宿主中表达所述融合DNA。对于与本发明的MPHOSPHl蛋白或PRCl 蛋白融合的肽或蛋白没有限制，只要作为结果产生的融合蛋白保持用于相 互结合的原蛋白的活性即可。
可以用作与MPHOSPHl蛋白或PRC1蛋白融合的肽的已知肽包括例如 FLAG (Hopp等人，Biotechnology 6: 1204-10 (1988))、含有6个His (组氨酸) 残基的6xHis、 10xHis、流感病毒凝集素(HA)、人c-myc片段、VSP-GP 片段、pl8HIV片段、T7-标签、HSV-标签、E-标签、SV40T抗原片段、lck 标签、a-微管蛋白片段、B-标签、蛋白C片段等。可以与本发明的蛋白融 合的蛋白的例子包括GST (谷胱甘肽-S-转移酶)、流感病毒凝集素(HA)、免 疫球蛋白恒定区、P-半乳糖苷酶、MBP(麦芽糖-结合蛋白)等。
通过将编码上述融合肽或蛋白的可商购的DNA与编码MPHOSPHl或 PRC1蛋白的DNA融合，并表达所制备的融合DNA，即可制备出融合蛋白。
而且，修饰的蛋白不排除多态性变体、种间同源物、以及由这些蛋白 的等位基因编码的蛋白。此外，本领域公知的分离功能上等价的蛋白的可选方法为例如使用杂
交技术的方法(Sambrook等人，Molecular Cloning 2nd ed. 9.47-9.58, Cold Spring Harbor Lab. Press (1989))。本领域技术人员能够容易地分离出与编码 人MPHOSPHl蛋白或PRCl蛋白的Aff/ZOSP/W或T^C7 DNA序列(即SEQ ID NO: 1或36)的全部或部分具有高度同源性的DNA，并且由该分离的DNA 分离与人MPHOSPHl蛋白或PRC1蛋白功能上等价的蛋白。因此，本发明 使用的蛋白包括由与编码人MPHOSPHl蛋白或PRCl蛋白的DNA序列的 全部或部分在严格条件下杂交的DNA编码的、且在功能上等价于人 MPHOSPHl蛋白或PRCl蛋白的蛋白。这些蛋白包括对应于人源或小鼠源 蛋白的哺乳动物同系物(例如由猴、大鼠、兔和牛基因编码的蛋白)。在从动 物中分离与编码人MPHOSPHl蛋白的DNA高度同源的cDNA时，特别优 选使用来自睾丸或膀胱癌的组织。另一方面，在从动物中分离与编码人 PRCl蛋白的DNA高度同源的cDNA时，除来自睾丸或膀胱癌的组织外， 还可以使用来自乳腺癌的组织。
本领域技术人员可以按常规选择用于分离编码与人MPHOSPHl蛋白或 PRCl蛋白功能上等价的蛋白的DNA的杂交条件。短语"严格(杂交)条件" 指的是这样的条件，在此条件下核酸分子会与其靶标序列杂交，通常在核 酸的复杂混合物中，但不与其他序列发生可检测的杂交。严格条件是依赖 序列的，在不同环境下会不同。比较长的序列在较高的温度特异性杂交。 3十核酸杂交的全面指导可在 Tijssen， rec/w/^w&s a"<i Afo/ecw/ar 外6n.^fea/fow wzY/z iVwc/e/c /Vo6es， "Overview of principles
of hybridization and the strategy of nucleic acid assays" (1993)中4戈3'J 。 通常, 对于确定的离子强度pH下的特定序列而言，严格条件选择为比其热解链温
度Om)低约5-10°C。
Tm是这样的温度，在该温度下，达到平衡时，同靶点
互补的探针中有50%与靶标序列杂交(由于靶标序列过量存在，在Tm， 50% 的探针被占据)(在确定的离子强度、pH和核酸浓度下)。还可以通过加入去 稳定剂(例如曱酰胺)达到严格条件。对于选择性或特异性杂交，阳性信号为 背景的至少两倍，优选为背景杂交的10倍。示例性的严格杂交条件可以如 下述地获得在50。/。曱酰胺、5xSSC、 1% SDS中于42。C温育，或者在5xSSC、 1%SDS中于65。C温育，在0.2xSSC、 0.1% SDS中于50。C洗涤。
在本发明的语境中，本领域技术人员可以按常规选择用于分离编码与人MPHOSPHl蛋白或PRC1蛋白功能上等价的蛋白的DNA的合适杂交条 件。例如杂交可通过如下方式进行使用"Rapid-hyb緩冲液"(Amersham LIFE SC正NCE)于68。C进行预杂交30分钟或更长时间，加入标记的探针，并在 68。C保温1小时或更长时间。其后的洗涤步骤例如可以在低度严格条件下 进行。示例的低度严格条件为包括，例如，42°C、 2xSSC、 0.1%SDS，或优 选50。C、 2xSSC、 0.1% SDS。更优选使用高严格条件。示例的高严格条件 可包括，例如，室温下用2xSSC、 0.01。/。SDS洗涤3次，每次20分钟，然 后于37。C用lxSSC、0.1%SDS洗涤3次，每次20分钟，再于50。C用lxSSC、 0.1。/。SDS洗涤2次，每次20分钟。然而，几种因素，如温度和盐浓度会影 响杂交的严格度，本领域技术人员可适当选择这些因素以获得所需的严格 度。
可以采用基因扩增法，例如聚合酶链反应(PCR)法代替杂交来分离编码 与人MPH0SPH1蛋白或PRC1蛋白功能上等价的蛋白的DNA,所述基因扩 增法使用基于编码人MPH0SPH1蛋白或PRC1蛋白(SEQ ID NO:2或37)的 DNA的序列信息(SEQIDNO: 1, MPH0SPH1; SEQIDNO:36, PRC1)合成
的引物。
由通过上述杂交技术或基因扩增技术分离的DNA编码的、与人 MPH0SPH1蛋白或PRC1蛋白功能上等价的蛋白 一般与所述人MPHOSPH1 蛋白或PRC1蛋白的氨基酸序列具有高度同源性(又称序列同一性)。"高度 同源性"(或称"高度同一性")典型地指2个最适比对的序列(多肽或多核 苷酸序列中)之间的同一性程度。典型地，高度同源性或同一性是指同源性 为40%或更高，优选为60%或更高，更优选为80%或更高，更优选为85%、 90%、 95%、 98%、 99%或更高。2个多肽序列或多核香酸序列之间的同源 性或同 一性程度可例如依照"Wilbur and Lipman, Proc Natl Acad Sci USA 80: 726-30(1983)"中的算法确定。
可用于本发明语境中的蛋白可能在氨基酸序列、分子量、等电点、存 在或不存在糖链、或形式等方面有差异，这取决于用于产生所述蛋白的细 胞或宿主或者采用的纯化方法。无论如何，只要该蛋白保留等价于相应的 天然蛋白(MPH0SPH1 (SEQ ID NO: 1);或PRC1 (SEQ ID NO: 37))所具有的 结合活性，就可以用于本发明。
本发明还包括应用MPHOSPH1蛋白或PRC1蛋白的部分肽。部分肽具有MPH0SPH1或PRC1的蛋白的特有的氨基酸序列，并由少于约400个、 通常少于约200个、经常少于约100个，且至少约7个，优选由约8个或 更多，更优选由约9个或更多氨基酸组成。适用于本发明的筛选的 MPHOSPH1部分肽至少包含MPH0SPH1蛋白的PRC1结合位点；适用于 本发明的筛选的PRC1部分肽至少包含PRC1蛋白的MPHOSPH1结合位点。 短语MPH0SPH1蛋白或PRC1蛋白"功能等价物"也包括这样的部分肽。
本发明人等揭示了 SEQIDNO:2的第1188~1465位和第1662~1718位 氨基酸残基作为MPH0SPH1的PRC1结合区的功能。因此，要在本发明的 筛选中使用的MPHOSPH1部分肽至少应包含SEQ ID NO: 2的第1188-1465 位或第1662 1718位氨基酸残基。而且，根据本发明的优选实施方式，用 于所述筛选方法的MPHOSPH1蛋白至少包含SEQ ID NO: 2的第1188 1718 位氨基酸残基。
而且，在本发明的语境中，短语"M尸i/OSP//7基因"包括编码 MPHOSPH1蛋白或MPHOSPH1蛋白的任何功能等价物的多核苷酸。相似 地，短语"尸AC7基因"包括编码PRC1蛋白或PRC1蛋白的任何功能等价 物的多核苷酸。
在本发明的语境中，要用本发明的筛选方法鉴定的作用剂可以是任何 化合物和包含多种化合物的组合物。而且，根据本发明的筛选方法暴露于 细胞或蛋白质的受试作用剂可以是单一化合物或者化合物的组合。当本发 明中使用化合物的组合时，这些化合物可以依次或同时接触。
在本发明的筛选方法中可以使用任何受试作用剂，例如细胞提取物、 细胞培养上清、发酵微生物的产物、海洋生物提取物、植物提取物、纯化 或粗制蛋白、肽、非肽化合物、合成的微分子化合物(包括核酸构建物、如 反义RNA、 siRNA、核酶等)以及天然化合物。本发明的受试作用剂还可以 使用本领域已知的多种组合文库方法中的任一种获得，所述方法包括(1) 生物学文库，(2)空间可寻址平行固相或溶液相文库(spatially addressable parallel solid phase or solution phase libraries), (3)需要去巻积(deconvolution) 的合成文库法，(4)"一珠一化合物(one bead one compound)"文库法，和(5)使 用亲和层析选择的合成文库法。使用亲和层析选择的生物学文库法仅限于 肽文库，而其它四种方法适用于肽、非肽寡聚体或化合物小分子文库(Lam (1997) Anticancer Drug Des. 12: 145)。合成分子文库的方法的例子可见于本技术领域(DeWitt等人(1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6909-13; Erb等 人(1994)Proc.Nat1. Acad. Sci. USA, 1994, 91: 11422-6; Zuckermann等人J. Med. Chem. 37: 2678-85, 1994; Cho等人(1993) Science 261: 1303-5; Carell 等人(1994) Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33: 2059; Carell等人，Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 1994， 33: 2061; Gallop等人，J. Med. Chem. 1994， 37: 1233-51)。 化合物文库可存在于溶液中(参见Houghten, Bio/Techniques 1992, 13: 412-21) 或珠子(Lam， Nature 1991, 354: 82-4)、芯片(Fodor, Nature 1993, 364: 555-6)、 细菌(美国专利5,223,409),孢子(美国专利5,571,698; 5,403,484和 5,223,409)、质粒(Cull等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1992， 89: 1865画9)或噬菌 体(Scott and Smith Science 1990, 249: 386-90; Delvin Science 1990， 249: 404-6; Cwirla等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1990, 87: 6378-82; Felici J. Mol. Biol. 1990, 222: 301-10;美国专利申请2002103360)上。
何筛选方法筛选的化合物中的部分结构进行添加、缺失和/或取代而转变而 成的化合物。
而且，当被筛选的受试作用剂是蛋白时，为了获得编码该蛋白的DNA, 可以测定该蛋白的全氨基酸序列来推定编码该蛋白的核酸序列，或者可以 分析所得蛋白的部分氨基酸序列、基于该序列制备寡聚DNA作为探针，使 用该探针对cDNA文库进行筛选，从而得到编码该蛋白的DNA。所得DNA 确认了在制备作为治疗或预防癌症的候选物的受试作用剂中的有用性。
在本说明书描述的筛选方法中有用的受试作用剂可以是下述抗体，所 述抗体与MPHOSPH1蛋白或PRC1蛋白特异性结合，或者所述蛋白的丧失 了原蛋白体内生物活性的部分肽特异性结合。例如，可以试验抗体(例如多 克隆抗体)抑制MPHOSPH1蛋白与PRC1蛋白的结合的能力。
本说明书中使用的术语"抗体"是指具有特定结构的免疫球蛋白分子， 其仅与用于合成该抗体的抗原或该抗原的近缘抗原相互作用(即结合)。而 且，抗体可以是抗体片段或修饰的抗体，只要其结合M/WOS尸//7或尸7 C7 基因编码的蛋白。例如，所述抗体片段可以是Fab、 F(ab，)2、 Fv或将来自H 链和L链的Fv片段通过合适的接头连接而成的单链Fv (scFv) (Huston等人， ProcNatlAcadSci USA 1988， 85:5879-83)。更具体地，可以用酶如木瓜蛋 白酶或胃蛋白酶处理抗体以产生抗体片段。或者，可以构建编码抗体片段的基因，将其插入合适的表达载体，并在适合的宿主细胞中表达(参见例如
Co等人，J Immunol 1994, 152: 2968-76; Better and Horwitz， Methods Enzymol 1989, 178: 476-96; Pluckthun and Skerra， Methods Enzymol 1989, 178: 497-515; Lamoyi, Methods Enzymol 1986， 121: 652-63; Rousseaux等人,Methods Enzymol 1986, 121: 663-9; Bird and Walker, Trends Biotechnol 1991, 9: 132-7)。
抗体可以通过与各种分子如聚乙二醇(PEG)缀合来进行修饰。这样的修 饰抗体也可以用于本发明的语境中。可通过将抗体进行化学修饰来获得修 饰抗体。这些修饰方法是本领域常规的。或者，本发明的抗体可以是嵌合 抗体或人源化抗体的形式，所述嵌合抗体具有源自非人抗体的可变区与源 自人抗体的恒定区，所述人源化抗体具有源自非人抗体的互补决定区(CDR) 以及源自人抗体的框架区(FR)和恒定区。所述抗体可利用已知技术制备。人 源化可以通过下述方法进行用啮齿类的CDR序列取代人抗体的对应序列 (Verhoeyen等人，Science 1988， 239:1534-6)。由此，这样的人源化抗体是嵌
所取代。
除人框架区和恒定区外还包含人可变区的完整人抗体也是可以利用 的。这样的抗体可利用本领域已知的各种技术制备。例如，体外方法包括 使用在噬菌体上展示的人抗体片段的重组文库(例如，Hoogenboom & Winter, (1992) J. Mol. Biol. 227:381-8)。类似地，可通过将人免疫球蛋白基因座引入 转基因动物，例如内源性免疫球蛋白基因已经被部分或完全致失活的小鼠， 来制备人抗体。该方法描述于例如美国专利Nos. 6,150,584; 5,545,807; 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; 5，661，016。
虽然受试作用剂文库的构建是本技术领域公知的，下文中还是提供了 有关受试作用剂鉴定以及用于本筛选方法的这些作用剂的文库构建的进一 步指导。 (i)分子建才莫
对具有目标性质的化合物的分子结构和/或对待抑制靶分子即 MPHOSPH1和PRC1的分子结构的知识，方便了受试作用剂文库的构建。 预筛选适于进一步评估的受试作用剂的方法之一 ，是对受试作用剂与其靶 标的相互作用进行计算机建模。在本发明中，MPHOSPH1与PRC1相互作用的建模提供了对相互作用本身细节的认识，并提示了干扰该相互作用的 可能策略，包括潜在的相互作用分子抑制剂。
计算机建模技术为所选分子的三维原子结构的可视化以及与该分子相 互作用的新化合物的合理设计提供了可能。三维构建典型地依赖于从所选
分子的x-射线晶体分析或NMR成像而来的数据。分子动力学需要力场数 据。计算机图形系统为预测新化合物如何连接靶分子，以及实验操作化合 物和靶分子的结构以优化结合特异性提供了可能。为了预测当分子和化合 物之一或二者中产生细小改变时分子-化合物相互作用是什么样的，需要分 子力学软件和计算密集型计算机，它们通常关联着分子设计程序和用户之 间的用户友好的、菜单驱动的界面。
上文一般性描述的分子建模系统的一个实例包括CHARMm和 QUANTA程序，Polygen Corporation, Waltham, Mass。 CHARMm 4丸行能量最 小化和分子动力学功能。QUANTA执行构建、图形建模和分子结构分析。 QUANTA可帮助进行分子相互行为的分析、可视化、修饰和相互作用性构 建。
大量文献综述了与特定蛋白质相互作用的药物的计算机建模，例如 Rotivinen, a/.爿cto /Vzamwcewf/ca Fe"m'ca 97, 159-166 (1988); Ripka, iVew Sc/ew"M 54-57 (Jun. 16、 1988); McKinlay and Rossmann, ^www. Aev. /V2armoc0/. 7b:d"'o/. 29 , 111-122 (1989); Perry and Davies , Prog Clin Biol Res.291:189-93(1989); Lewis and Dean,i . 5bc.丄om/5所o/ 236, 125-40和141-62 (1989);以及关于核酸组分的4莫型受体，有Askew, da/., /力m. C7ze肌5bc. Ill, 1082-卯(1989)。
其他筛选和图形描述化学物质的计算冲几程序可以例如BioDesign Inc.， Pasadena, Calif" Allelix Inc., Mississauga, Ontario, Canada禾口 Hypercube Inc., Cambridge, Ontario等公司获得。见例如DesJarlais "a/. (1988) J. Med. Chem. 31:722-9; Meng & a/. (1992) J. Computer Chem. 13:505-24; Meng " a/. (1993) Proteins 17:266-78; Shoichet a/. (1993) Science 259:1445-50。
一旦鉴定了 MPHOSPH1/PRC1相互作用的假定抑制剂，就可以根据已 鉴定的假定抑制剂的化学结构使用组合化学技术构建任何数目的变体，如 下文所述。对于最终的假定抑制剂或"受试作用剂"文库可使用本发明的方法 进行篩选，以鉴定该文库中破坏MPHOSPHl/PRCl结合的受试作用剂。(ii)组合化学合成
受试作用剂的组合文库可作为合理药物设计程序的 一部分而产生，该 程序涉及了对于在已知MPHOSPH1/PRC1相互作用抑制剂中存在的核心结 构的知识。这种方法使文库保持合理的大小，便于高通量筛选。或者可通 过筒单合成组成该库的分子家族的全部排列构建简单的，特别是短的聚合 物分子文库。后一种方法的实例是由所有长度为6个氨基酸的肽组成的文 库。这种肽文库可包括每一个6氨基酸序列排列。这种类型的文库称作线 性组合化学文库。
组合化学文库的制备是本领域技术人员所公知的，并可通过化学或生 物合成产生。组合化学库包括，但不限于肽文库(见例如美国专利5,010,175， Furka， /尸ra/. 37:487-93 (199l)和Houghten ef a/., TV^we 354:84-6(1991))。也可以采用其他用于产生化学多样性库的化学。这类化学 包括，但不仅限于肽(例如PCT公开第WO 91/19735号)，被编码的肽(例 如WO 93/20242),随机生物寡聚体(例如WO 92/00091)，苯并二氮卓 (benzodiazepine)(例如美国专利第5,288，514号)，diversomers如乙内酰脲类 (hydantoins)， 苯并二氮卓类(benzodiazepines)和二肽(dipeptides) (DeWitt d a/.,尸rac.扁.Jc^/. 5W.园90:6909-13 (1993)),插蜂(vinylogous)多肽 (Hagihara " a/, / CTzew. 114:6568-70 (1992))，具有葡萄糖骨架的
非肽性肽才莫拟物(Hirschmann da/.， J! CTzem. Soc. 114:9217-8 (1992)),
小化合物文库的类似有机合成(Chen a/.， / ^證Oz昆116:2661 (1994))，寡聚氨基曱酸酯(oligocarbamates) (Cho " a/. ， 5We"ce 261:1303 (1993))，和/或肽基膦酸盐或酉旨(peptidylphosphonate) (Campbell W a/. ， /Og. CTzem. 59:658 (1994))，核酸文库(见Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology 1995 supplement; Sambrook et al" Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 1989， Cold Spring Harbor Laboratory, New York, USA),肽核酸文库 (见例如美国专利5,539,083)，抗体文库(见例如Vaughan d a/. ， A^ww B/ofec/z"o/ogy, 14(3):309-14 (1996)和PCT/US96/10287)，糖文库(见例如Liang efa/.、 5W置e， 274:1520-2 (1996)和美国专利5,593,853),小有机分子库(见 例如，苯并二氮卓，Gordon EM. Curr Opin Biotechnol. 1995 Dec 1; 6(6):624-31.;类异戊二烯，美国专利5,569,588;噻嗪烷酮类(thiazanones)和间 噻。秦烷酮类(metathiazanones),美国专利5,549,974;吡咯烷类，美国专利5,525,735和5，519，134;吗啉代化合物，美国专利5,506,337;苯并二氮卓、
5,288,514等)。
(iii)噬菌体展示
另一种方法使用重组噬菌体产生文库。使用"噬菌体方法"(Scott and Smith, 5We腳1990 249:386-90; Cwirla, W a/,尸rac.腺/. ^cad 5W, 1990, 87:6378-82; Devlin ^,5We"ce， 1990， 249:404-6)可以构建非常大的文库(例 如106 -108个化学实体)。另一种方法主要使用化学方法，其实例是Geysen 》'去(Geysen ef a/,, A/o/ecM/or /m附wwo/ogv 1986， 23:709-15; Geysen d a/. / /mmw"o/og/c MeAoof 1987, 102:259-74)和Fodor等人的方法(5Wewce 1991 251:767-73)。 Furka等(第14届国际生物化学会议，第5巻，摘要FR:013、 1988; Furka, /"f. /尸e/ "A尸rafe/" i 仏1991 37:487-493), Houghten (美国专 利No. 4，631,211)和Rutter等(美国专利No. 5，010,175)描述了产生能够作为激 动剂或拮抗剂加以测试的肽混合物的方法。
制备组合文库的设备可以商业获得(见例如357 MPS、 390 MPS、 Advanced Chem Tech, Louisville KY， Symphony, Rainin, Woburn, MA, 433AAppliedBiosystems， Foster City, CA, 9050 Plus, Millipore, Bedford, MA)。此外，大量组合文库本身也可商业获得(见例如ComGenex， Princeton, N丄，Tripos, Inc., St. Louis， MO, 3D Pharmaceuticals, Exton， PA， Martek Biosciences, Columbia, MD， 等)。
本发明提供抑制MPHOSPH1与PRC1之间的结合的作用剂的筛选方 法。抑制MPHOSPH1与PRC1之间的结合的作用剂可望抑制膀胱癌细胞的 增殖，从而可用于膀胱癌的治疗或预防。因此，本发明还提供抑制膀胱癌 细胞增殖的化合物的筛选方法和用于膀胱癌的治疗或预防的作用剂的筛选 方法。
更具体地，该方法包括以下步骤。
(a) 在作用剂的存在下使MPHOSPHl蛋白质与PRC1蛋白质接触；
(b) 检测MPHOSPH1与PRC1蛋白质间的结合水平；
(c) 将MPHOSPHl与PRC1蛋白质间的结合水平与不存在所述作用剂 的条件下检测到的水平相比较；(d)选择降低MPHOSPHl和PRC1蛋白质的结合水平的作用剂作为抑 制MPHOSPHl和PRCl蛋白质的结合的作用剂，即可用于抑制膀胱癌细胞 增殖和治疗或预防膀胱癌的作用剂。
在本发明的说明书中，对两个蛋白质之间的"结合(的)抑制"是指至少 降低所述蛋白质间的结合。因此，在有些情况下，样品的结合对的比例与 合适的对照(即未经受试作用剂处理的、或来源于非癌样品的、或来源于癌 样品的)相比较减少。与对照样品中的结合对相比，发生结合的蛋白质的量 的减少可以为90%、 80%、 70%、 60%、 50%、 40%、 25%、 10%、 5°/。、 1% 或其以下(即0%)。
在本说明书中，MPHOSPHl蛋白质和PRCl蛋白质包括前述蛋白质的 功能等价物。用于筛选的MPHOSPHl或PRCl蛋白质或者它们的功能等价 物可以按照本领域技术人员7>知的方法以重组蛋白或天然蛋白的形式来制 备。这些蛋白可以采用任何公知的用于产生多肽的基因工程方法来获得(例 ^口， Morrison J.， J Bacteriology 1977, 132: 349-51; Clark画Curtiss & Curtiss, Methods in Enzymology (Wu等人编)1983, 101: 347-62)。例如，可通过下述 方法制备重组蛋白将编码该蛋白的DNA (例如具有SEQ ID NO: 1或36的 核苷酸序列的DNA)插入适当的表达载体，将载体导入适当的宿主细胞，获 得提取物，然后对提取物进行层析以纯化多肽，所述层析例如离子交换层 析、反相层析、凝胶过滤或利用固定了针对本发明蛋白的抗体的层析柱的 亲和层析，或上述多于一种柱子的组合。
此外，当在宿主细胞(例如动物细胞和大肠杆菌)中将可用于本发明语境 中的蛋白表达成与谷胱甘肽S-转移酶蛋白的融合蛋白或添加多个组氨酸的 重组蛋白时，可以使用谷胱甘肽柱或镍柱来纯化所表达的重组蛋白。
纯化融合蛋白之后，通过用凝血酶(thrombin)或因子Xa切割融合蛋白 来除去目的多肽之外的区域也是可能的。
可以采用本领域技术人员公知的方法分离出天然蛋白，例如使结合有 可与前述的MPHOSPHl或PRCl蛋白结合的抗体的亲和柱与表达所述蛋白 的组织或细胞的提取物接触。所述抗体可以是多克隆抗体或单克隆抗体， 也可以是任何修饰抗体，只要其与MPHOSPHl或PRCl蛋白结合。
MPHOSPHl或PRCl蛋白或者它们的功能等价物也可以采用体外翻译 系统在体外产生。而且，MPHOSPH1蛋白和PRC1蛋白的部分肽也可以用于本发明，只 要它们保持相互结合的活性。通过基因工程、已知的肽合成法或用适当的 肽酶消化天然的MPHOSPH1蛋白和PRC1蛋白，均可以产生所述部分肽。 例如，肽合成可以采取固相合成或液相合成。可用于合成的常规肽合成法 包括
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可进一步将多肽或其片段与其他物质连接，只要多肽和片段保留其本 身相互结合的能力。可用的物质包括肽、脂质、糖和糖链、乙酰基、天 然和合成的多聚物等。可以进行这些种类的修饰来赋予额外的功能或稳定 多肽和片段。
要与受试作用剂接触的MPHOSPH1及PRC1多肽或它们的功能等价物 可以是例如纯化多肽、可溶性蛋白、或者与其它多肽相融合的融合蛋白。
本发明的筛选方法可高效而快速地鉴定针对具有较高的干扰 MPHOSPH1与其结合配偶体PRC1之间结合的可能性的受试作用剂。 一般 地，任何确定受试作用剂干扰MPHOSPHl与PRC1的结合的能力的方法均 适用于本发明。例如，可以采用ELISA样式的竟争性和非竟争性抑制测定。 应当进行对照实验以确定系统的最大结合能力(例如，使已结合的 MPHOSPH1与PRC1接触，并确定结合于MPHOSPH1的PRC1的量)。
作为鉴定抑制本发明的结合的作用剂的方法，可以采用本领域技术人 员公知的多种方法。这样的鉴定可以作为体外测定系统，如在细胞系统中 进行。更具体地，首先使MPHOSPHl蛋白或其结合配偶体PRC1结合在支 持物上，然后将另一种蛋白同受试作用剂一起添加。然后，对该混合物进 行温育并清洗，再对结合在支持物上的另一种蛋白进行检测和/或测定。可用于结合蛋白的支持物(support)的实例包括例如不溶性多糖，如琼脂 糖、纤维素和葡聚糖；及合成树脂，如聚丙烯酰胺、聚苯乙烯和硅；可优 选使用由上述材料制备的商业上可得到的珠子和板(例如多孔板，生物传感 器芯片等)。使用珠子时，可以将它们填入柱子。或者，磁珠的使用也是本 技术领域公知的，该方法可以借助磁力容易地将结合在珠子上的蛋白分离 出来。
蛋白质与支持物的结合可根据常规方法进行，这些方法例如化学结合 或物理吸附。或者，蛋白质可通过特异性识别它的抗体而与支持物结合。 此外，还可以利用相互作用性的多种分子，如抗生物素蛋白和生物素的组 合来进行多肽与支持物的结合。
蛋白间的结合可以在緩冲液中进行，緩冲液的例子包括但不限于磷酸 缓冲液和Tris緩沖液，只要緩沖液不抑制蛋白间的结合即可。
在本发明中，可以将利用表面等离子体共振现象(surface plasmon r6son肌C6 phenomenon)的生物传感器(biosensor)用作对结合的蛋白质进4亍检 测或定量的手段。当使用这类生物传感器时，只使用极少量的多肽且不需 标记，即可实时观察表现为表面等离子体共振信号的蛋白质之间的相互作 用(例如BIAcore， Pharmacia)。因此，可以使用生物传感器诸如BIAcore来 评价MPHOSPH1和PRC1之间的结合。
或者，还可以对MPHOSPHl或PRC1中的任一种进行标记，利用结合 的蛋白的标记来检测或测定结合的蛋白。具体地，预先对蛋白中的一种进 行标记，然后在受试作用剂的存在下使标记的蛋白与另一种蛋白接触，并 且在进行了洗涤后根据标记来检测或测定结合的蛋白。
本发明方法中用于标记蛋白质的标记物质可以使用放射性同位素(例如 3H、 14C、 32P、 33P、 35S、 125I、 131I)、酶(例如碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶、 卩-半乳糖苷酶、|3-葡糖苷酶)、荧光物质(例如异硫氰酸荧光素(FITC)、荧光 素、德克萨斯红、绿色荧光蛋白和罗丹明)、磁珠(例如DYNABEADSTM)、 量热标记物(如胶体金或者有色玻璃或塑料(例如聚苯乙烯、聚丙烯、乳胶等) 制的珠子)、以及生物素/抗生物素蛋白。教导这样的标记的使用的专利包括 美国专利3,817,837; 3，850，752; 3,939,350; 3,996,345; 4,275，149;和4,366,241。 但是，本发明并不限于此，任何可采用分光学、光化学、生物化学、免疫 化学、电学、光学或化学方法检出的标记均可以使用。当使用放射性同位素标记蛋白时，可以通过液体闪烁来进行检测或测定。或者，对于酶标记的蛋白可以这样;险测或测定添加酶的底物，使用 吸光光度计(absorptiometer)来检测底物的酶促变化如显色等。而且，当使用 荧光物质作为标记物时，可以使用荧光光度计来^r测或测定结合的蛋白。而且，本发明筛选方法中的结合，可以使用针对MPHOSPHl或PRC 1 的抗体来进行检测或测定。例如，在使固定在支持物上的MPHOSPHl与受 试化合物和PRC1接触后，对该混合物进行温育并清洗，然后可以使用针对 PRC1的抗体进行检测或测定。或者，可以将PRC1固定在支持物上，并可 4吏用针对MPHOSPHl的抗体作为抗体。当在本发明的筛选中使用抗体时，优选将抗体用上述标记物质中的任 一种进行标记，并基于标记物质进行检测或测定。或者，可以使用针对 MPHOSPHl或PRC1的抗体作为第一抗体，通过用标记物质标记的第二抗 体对该第一抗体进行检测。而且，本发明的筛选中，与蛋白质结合的抗体 可以使用蛋白G或蛋白A柱来进行才企测或测定。或者，在本发明的鉴定方法的另一实施方案中，可以使用利用细胞的 双杂交系统(two-hybrid system) ("MATCHMAKER双杂交系统"、"哺乳动物 MATCHMAKER双杂交测定试剂盒"、"MATCHMAKER单杂交系统" (Clontech); "HybriZAP双杂交载体系统"(Stratagene);参照"Dalton and Treisman, Cell 68: 597-612(1992)，，， "Fields and Sternglanz， Trends Genet 10: 286-92(1994)")。在双杂交系统中，例如，将MPHOSPHl与SRF-结合区或 GAL4-结合区融合，并在酵母细胞中表达。将PRCl与VP16或GAL4转录 活化区域(transcriptional activation region)融合。或者，可将PRClSRF-结合 区或GAL4-结合区融合，而将MPHOSPHl与VP16或GAL4转录活化区融 合。当受试作用剂不抑制MPHOSPHl与PRCl的结合时，这两者的结合激 活报道基因，使得阳性克隆能够被检出。就报道基因而言，除HIS3基因外， 还可以使用例如Ade2基因、lacZ基因、CAT基因、萤光素酶基因等。在本说明书中，MPHOSPHl与PRC1之间的结合水平也可以作为 MPHOSPHl与PRCl结合后发生的任何变化来加以测定。具体地，这样的 筛选可以通过使受试作用剂与表达MPHOSPHl与PRCl的细胞(诸如J82或 UNUC细胞)接触来进行。例如，可以检测细胞增殖的抑制来确定受试作用 剂在MPHOSPHl与PRCl的结合中的影响。1. 竟争性测定样式竟争性测定可用于筛选本发明的受试作用剂。作为实例，竟争性ELISA 样式可以包括与固体支持物结合的MPHOSPHl (或PRC1)。可将结合的 MPHOSPHl (或PRCl)与PRCl (或MPHOSPHl)及受试作用剂共温育。经过 足够的时间以容许受试作用剂和/或PRCl (或MPHOSPHl)结合MPHOSPHl (或PRC1)后，可清洗底物以除去未结合材料。然后确定与MPHOSPHl结 合的PRC1的量。这可以用本领域已知的多种方法中的任何一种来实现，例 如使用带有可检测标记物作为标签的PRCl (或MPHOSPHl)种类，或者使 经过清洗的底物与标记的抗PRCl (或MPHOSPHl)抗体接触。与 MPHOSPHl (或PRC1)结合的PRC1 (或MPHOSPHl)的量将与受试作用剂干 扰MPHOSPHl对PRC1的结合的能力成反比。关于蛋白质——包括但不仅限于抗体--的标记，如下面的文献所记载Harlow & Lane, Antibodies,A Laboratory Manual (1988)。在一种变化形式中，用亲和标签标记MPHOSPHl (或PRC1)。然后，将 标记的MPHOSPHl (或PRC1)与受试作用剂和PRC1 (或MPHOSPHl)—起温 育，然后进行免疫沉淀。然后用抗PRC1 (或MPHOSPHl)抗体对免疫沉淀 物进行Western印迹。与前面的竟争性测定样式一样，被发现与MPHOSPHl (或PRCl)结合的PRCl (或MPHOSPHl)的量与受试作用剂干扰PRCl与 MPHOSPHl结合的能力成反比。2. 非竟争测定形式对于构建样式不适于直接利用竟争性测定加以筛选的受试作用剂文库 (如本文所述的那些)而言，非竟争性结合测定作为初始筛选可能也是有用 的。上述文库的实例是噬菌体展示文库(见例如Barret， " a/. (1992) Anal, Biochem204， 357-364)。噬菌体文库有用之处在于能够快速产生可工作量的很多种不同重组 肽。噬菌体文库不适于本发明的竟争性测定，但是可以以非竟争样式高效 地进行筛选，确定何种重组肽受试作用剂结合MPHOSPHl或PRCl。然后 可以制备已鉴定为结合性的受试作用剂，并用竟争性测定样式加以筛选。 噬菌体和细胞展示文库的产生和筛选在本领域是公知的，在例如如下文献 中有讨论Ladner " a/.， WO 88/06630; Fuchs " a/. (1991) Biotechnology" a/. (1993) TIBS 18:136-40; Charbit W a/. (1986) EMBO J 5， 3029-37; Cull "a/. (1992) PNAS USA 89:1865-9; Cwirla, "a/. (19卯)Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87， 6378-82。示例性的非竟争性测定遵循与上述竟争性测定相似的程序，只是不添 加其中一种组分(MPHOSPHl或PRC1)。然而，由于非竟争样式确定的是受 试作用剂对MPHOSPH1或PRC1的结合，需要对于每个候选物确定受试作 用剂结合MPHOSPHl和PRC1 二者的能力。因此，例如，可通过下列步骤 确定受试作用剂与固定化的MPHOSPHl的结合清洗掉未结合的受试作用 剂；从支持物洗脱结合的受试作用剂，随后通过例如质谱，蛋白测定(Bradford 或Lowry测定，或280nm吸光度测定)对洗脱物进行分析。或者可以省略洗 脱步骤，通过监测支持物表面上有机层光语学性质的变化确定受试作用剂 的结合。监测表面光谱学性质的方法包括，但不限于吸光度、反射率、透 光度、双折射、折光率、衍射、表面等离子体共振、椭圆偏振测量、共振 镜(resonantmirror)技术、光栅耦合波导^t支术和多极共振光谱，所有这些对于 本领域技术人员而言是已知的。在测定中还可使用标记的受试作用剂，从 而省去洗脱步骤。在这种情况下，洗去未结合材料后与支持物结合的标记 的量与受试作用剂的结合成正比。已经开发了大量公知的机器人系统，用于溶液相化学。这些系统包括成装置，以及许多利用机器手的机器人系统(Zymate II、 Zymark公司、 Hopkinton, Mass.; Orca， Hewlett Packard, Palo Alto, Calif,)，它们才莫拟化 学技术人员的手工合成操作。上面的任何一种设备均适合于利用本发明。 为使其能够如本文所述地工作而对这些设备所作的修改(如果有的话)的性 质和实施，对于相关领域的技术人员而言是显而易见的。此外，大量的组 合文库本身可以商业获得(见例如ComGenex， Princeton、 N.J., Asinex, Moscow, Ru， Tripos, Inc., St. Louis, MO、 ChemStar， Ltd， Moscow, RU, 3D Pharmaceuticals, Exton， PA， Martek Biosciences, Columbia, MD，等)。根据本发明的一个方面，本筛选方法所必需的组分可以作为试剂盒来 提供，用于筛选抑制MPHOSPH1与PRC1的结合的作用剂、抑制膀胱癌细 胞增殖的作用剂、或者用于膀胱癌的治疗或预防的作用剂。本发明的试剂 盒可以包含，例如，MPHOSPH1多肽或其功能等价物和/或PRC1多肽或其功能等价物。而且，本试剂盒还可以包含对照试剂(阳性和/或阴性)、可检 测标记物、细胞培养基或緩沖液、筛选所必需的容器、用于实施本方法的说明书(例如书面文件、磁带、VCR、 CD-ROM、其它)等等。组分和试剂可 以分别包装在不同的容器中。通过本发明的任何方法分离得到的作用剂，可以作为药物施用，或者 可以用于制备药物(治疗性或预防性)组合物，用于人及其它哺乳动物如小 鼠、大鼠、豚鼠(guinea-pig)、兔、猫、狗、绵羊、猪、牛、猴、狒狒(baboon) 和黑猩猩(chimpanzee))来治疗或预防膀胱癌。本说明书中，术语"预防"是指为了延緩或抑制肿瘤的形成、或者延 緩、抑制或减轻癌症的至少一种临床症状，而预防性地施用作用剂。对受 试者中胂瘤状态的评价可以采用标准临床规程来进行。预防性施用可以在 显现明显的疾病的临床症状之前进行，以预防疾病或疾患和/或延迟它的进 展。在本发明的语境中，"预防"包括减少疾病的死亡率或罹患率负担的 一切活动。预防可以在初级、次级或三级预防水平上进行。初级预防避免 疾病的发生(development),而次级和三级预防水平包括以防止疾病进展和症 状出现为目的的活动，还包括以通过恢复功能和减少疾病相关的并发症来 减少既发疾病的负面影响为目的的活动。本发明包括多种多样的以减轻癌 症特别是膀胱癌的严重程度为目的的预防疗法。分离的作用剂可以直接给药，或者可以利用已知的药物制备方法配制 成剂型。药物制剂可包括适于口服、直肠、鼻、局部(包括颊或舌下)、阴道 或非消化道(包括肌内、皮下和静脉内)施用的制剂，以及适于通过吸入或吹 入(insufflation)施用的制剂。例如，4艮据需要，作用剂可以作为糖衣片剂、 胶嚢剂、酏剂和微胶嚢口服施用；或者用水或任何其它药学可接受的液体 配制成无菌溶液或悬浮液，以注射剂的形式非口服施用。例如，可以将作 用剂与药理学可接受的载体或介质 一起混合成通常接受的药物配制方式 (drug implementation)所要求的单位剂型，所述载体或介质具体为无菌水、 生理盐水、植物油、乳化剂、悬浮剂、表面活性剂、稳定剂、调味剂、赋 形剂(excipient)、溶媒(vehicle)、防腐剂、粘合剂等。这些制剂中活性成分的 量构成(make)可获得的指定范围内的合适剂量。能够混合到片剂和胶嚢中的添加剂的例子有粘合剂如明胶、玉米淀 粉、黄蓍胶(tragacanthgum)和阿拉伯胶；赋形剂例如结晶纤维素；溶胀剂例如玉米淀粉、明胶和海藻酸(alginic acid);润滑剂例如硬脂酸镁；增甜剂例 如蔗4唐、乳4唐或并唐4青；调p未剂例长口薄荷(peppermint)、 Gaw/Aen'a at/e"of/zn'x 油和樱桃。当单位剂型为胶嚢剂时，上述成分中还可以包括液体载体，例 如油。注射用无菌组合物可以使用溶媒例如注射用蒸馏水按照标准的药物 配制方式进行配制。生理盐水、葡萄糖以及包含辅料(adjuvants)如D-山梨醇、D-甘露糖、 D-甘露醇和氯化钠的其它等渗液体，可用作注射用水溶液。这些可以与合 适的增溶剂组合使用，所述增溶剂例如醇，特别是乙醇、多元醇例如丙二 醇和聚乙二醇，非离子表面活性剂，例如Polysorbate 80 (TM)和HCO-50。芝麻油或大豆油可以作为油质液体使用，并且可以与苯曱酸千酯或苯 曱醇组合使用作为增溶剂，还可与緩冲剂，如磷酸盐緩沖剂和乙酸钠緩沖 剂；镇痛剂，如盐酸普鲁卡因；稳定剂，如苯曱醇、苯酚；以及抗氧化剂 一起配制。制备好的注射剂可以装入到合适的安瓿(ampoule)中。适于口服施用的药物制剂可便宜地作为离散单位提供，所述离散单位 例如胶嚢剂、扁嚢剂(cachet)或片剂，每个单位含有预定量的活性成分； 作为粉末或颗粒；或作为溶液，悬浮液或作为乳液。活性成分还可以以大 丸剂(bolus)、药糖剂(electuary)或糊剂(paste)的形式提供，以及纯的形式，即 没有载体。用于口服给药的片剂和胶嚢剂可含有常规赋形剂诸如结合剂、 填充剂、润滑剂、崩解剂或湿润剂。片剂可通过压缩或模制来制备，其中 任选含有一种或多种配方成分。压缩片剂可通过如下方法制备将活性成 分以自由流动的形式(如粉末或颗粒)任选地与粘合剂、润滑剂、惰性稀释剂、 润滑剂、表面活性剂或分散剂混合，并在适当的机器中进行压缩。模制片 剂可通过如下方法制备在适当的机器中对利用惰性液体稀释剂湿润过的 粉末化合物的混合物进行模制。所述片剂可根据本领域已知的方法进行包 覆(coated)。 口服液体制备物可以是例如水性或油性的悬浊液、溶液、乳液、 糖浆或酏剂的形式，或者也可以作为干燥产物提供，以便在使用前用水或 其它适宜溶媒加以构成。所述液体制备物可含有常规添加剂诸如悬浮剂， 乳化剂，非水性溶媒(可包括食用油)或防腐剂。片剂可任选地配制以提供其 中活性成分的緩释或控释。供非消化道施用的制剂包括水性和非水性的无菌注射溶液，其可含有 抗氧化剂、緩沖剂、抑菌剂(bacteriostat)和使得制剂与目标受者的血液等张(isotonic)的溶质；以及水性和非水性的无菌悬浮液，其可含有悬浮剂和增稠 剂。所述制剂可以以单位剂量或多剂量容器提供，例如密封的安瓿和小瓶； 还可以在冷冻-干燥(冻干的)条件下保存，这样仅需要在即将使用前添加无 菌液体载体例如盐水、注射用水。或者，可提供所述制剂用于连续输注 (continuous infUsion)。可由前述的无菌粉末、颗粒及片剂的类型制备即配即 用的注射溶液和悬浮液。适于直肠给药的制剂可提供为含有常用载体如可可脂或聚乙二醇的栓 剂(suppository)。用于口内局部给药，例如颊(buccal)或舌下给药的制剂包括 锭剂(lozenge)和软锭剂(pastille),其中锭剂在调味基质，如蔗糖和阿拉伯胶 (acacia)或黄蓍胶中包含活性成分，而软锭剂在基质，如明胶和甘油或蔗糖 和阿拉伯胶中包含活性成分。鼻内给药时，通过本发明得到的化合物可以 用作液体喷雾剂或可分散粉末，或采取滴剂(drop)的形式。滴剂可用水性或非水性基质配制，该基质中也含有一种或多种分散剂、增溶剂或悬浮剂。 液体喷雾剂便宜地从加压包装中递送。吸入给药时，可以由吹入器、雾化器、加压包装(pressurized pack)或其它输送气溶胶喷雾的便利装置方便地输送化合物。加压包装可含有适宜的 推进剂，如二氯二氟曱烷、三氯氟曱烷，二氯四氟乙烷、二氧化碳或其它 适宜气体。在加压气溶胶的情况下，可通过提供输送计量量(metered amount) 的阀门来确定剂量单位。或者，通过吸入或吹入给药时，化合物可以是干粉组合物的形式，例 如该化合物与适宜粉末基质(如乳糖或淀粉)的粉末混合物。粉末组合物可以 以单位剂型提供，这些剂型例如胶嚢、药筒(cartridge)、凝胶(gelatin)或发泡 包(blisterpack)，借助吸入器或吹入器，可由上述剂型施用所述4^分末。需要时，可以采用经过改造而适于緩释活性成分的上述制剂。药物组 合物中还可以含有其它活性成分，诸如抗微生物剂，免疫抑制剂或防腐剂。优选的单位剂型包含以下列举的有效量、或活性成分的适宜部分。可以采用本领域技术人员公知方法将采用本发明的方法鉴别出的作用 剂施用于患者，所述方法例如动脉注射、静脉注射、皮内注射的形式，以 及作为鼻腔内给药、经支气管给药、肌肉给药或口服给药的形式。施用剂 量和施用方法因患者的体重和年龄、以及施用方法而有变化，但本领域^支 术人员能够按常规对它们进行选择。若该作用剂可^皮DNA编码，则可以将该DNA插入基因治疗用载体，并施用该载体来实施治疗。施用剂量和施用 方法因患者的体重、年龄和症状而有变化，但本领域技术人员能够适当地 对它们进行选择。采用本发明的方法鉴别出的作用剂的用量依赖于症状等，对于成人而 言，其组合物可在0.1-约250mg/kg每天的范围内施用。成人的剂量范围通 常为约5 mg-约17.5 g/天，优选为约5 mg-约10 g/天，更优选为约100 mg-约3 g/天。片剂或其它以离散单位提供的包装规格的单位剂量形式可以方便 地包含在该剂量有效的量，或是作为多个这样的剂量有效的量，例如，含 有约5 mg至约500 mg，通常为约100 mg至约500 mg的单位。当以注射剂形式向标准成年人(体重60 kg)非胃肠道给药时，虽然根据患 者、靶器官、症状和给药方法存在一些差异，但便宜地静脉内注射约O.Ol mg-约30mg每天，优选约O.l mg-约20mg每天，更优选约O.l mg-约10 mg每天的 剂量。而且，在其它动物的情况下，可以按换算为60kg体重的量施用。作用剂优选通过口服或注射(静脉内或皮下)来施用，给患者施用的确切 的量将由主治医师在考虑包括患者年龄和性别、治疗的确切疾患及其严重 程度在内的多种因素的基础上，在其职权范围内确定。或者，施用途径也 可能因病情或其严重程度而不同。通过施用，可以实现对患有MPH0SPH1蛋白与PRC1蛋白的结合相关的疾 病、或者存在患病风险(或可能性)的患者中的疾病进行预防或治疗。该方法 中包括减少膀胱癌细胞中MPHOSPH1与PRC1的结合。通过施用采用本发 明的筛选方法获得的作用剂，可以抑制其功能。除非另有说明，本文使用的全部技术和科学术语与本发明所属领域普 通技术人员通常所理解的意思相同。如有冲突，以本说明书中包含的定义 为准。以下，更具体地描述本发明的实施例。但是，以下的材料、方法、实 施例仅仅是对发明的方面进行说明，而不是对本发明范围的限定。因此， 与本说明书中描述的方法和材料类似或等同的方法和材料也可以用于本发 明的实施或测试。实施例
1.材冲+和方法
(1) 膀胱癌细胞系和组织样品
人膀胱癌细胞系HT1197、 UM-UC-3、 J82、 HT1376、 SW780和RT4购
自美国典型培养物中心(America Type Culture Collection)(ATCC; Rockville，
MD)。所用膀胱癌细胞系COS7和NIH3T3细胞均在合适的培养基中进行单
层培养，即对于HT1197、 UMUC3、 J82和HT1376使用含0.1 mM必需氨
基酸(Roche)、 1 mM丙酮酸钠(Roche)的EMEM(Sigma、 St. Louis， MO);对
于SW78(H吏用L-15;对于RT-44吏用McCoy，s5a(sigma);对于COS7和NIH3T3
使用Dulbecco改进的Eagle培养基(Invitrogen、 Carlsbad， CA)。各培养基中
添加了 10Q/。胎牛血清(Cansem)和1。/。抗生素/抗真菌溶液(Sigma)。 SW 780细
胞在不含C02的湿润空气气氛中于37。C维持。其它细胞系在含5% C02的
湿润空气气氛中于37'C维持。
外科切除的浸润性或浅表性膀胱癌组织样品以及它们的相应临床信息 是在取得各患者书面知情同意后获得的。
(2) 半定量RT-PCR分析
使用RNeasy微试剂盒(Qiagen， Valencia, CA)从培养细胞和临床组织提 取总RNA。提取的RNA和正常人组织PolyA十RNA用DNase I (Nippon Gene、东京、日本)处理，然后使用寡聚(dT)引物和Superscript II逆转录酶 (Invitrogen， Carlsbad, CA)进行逆转录。半定量逆转录PCR (RT-PCR)实验使 用以下MP7/OSPT^特异性引物或作为内部标准的04户D7/特异性引物实 施；即， MPHOSPH1
5'-CCGGGAAAGTAAACTGACTCAC-3' (SEQ ID NO: 3)和 5'-TTCTAGCTCCTCAACCAAATCCT-3' (SEQ ID NO: 4);以及 GADH
5'-CGACCACTTTGTCAAGCTCA-3' (SEQ ID NO: 5)和
5'-GGTTGAGCACAGGGTACTTTATT-3' (SEQ ID NO: 6)。
PCR反应中循环数经过最优化以保证对产物强度在扩增的线性范围内。
(3) Northern印迹分才斤将由6个膀胱癌细胞系和8个正常人器官的mRNA组成的膀胱癌细胞 印迹以及人多组织部印迹(Takara Clontech、 Palo Alto, CA)与32P标记的 M尸/70S尸//7 cDNA进行了杂交。探针即MPHOSPHl cDNA是使用引物 5'-TGCTGGTTCAGAACGAACTATG-3' (SEQ ID NO: 7) 和 5'画TCCTCGTGGCTAATGAAAGC-3' (SEQ ID NO: 8)通过RT-PCR制备的。预 杂交、杂交和清洗按厂商的推荐进行。印迹的放射自显影使用增感屏在-8(TC 进行14曰。 (4)表达载体的构建
和尸i C/的开放阅读框序列是使用KOD-Plus DNA聚合酶 (东洋纺、大阪、日本)和以下引物通过PCR扩增的
5'-ATAAGAATGCGGCCGCAATGGAATCTAATTTTAATCAAGAGG-3'(SEO ID NO: 9)和
反向5'-ATAAGAATGCGGCCGCTTTGGCTGTTTTTGTTCGA-3' (SEQ ID NO: 10)(下划线为限制酶位点)；以及 尸7 C7，正向
5 ，-CCGGAATTCTCCGCCATGAGGAGAAGTGA-3， (SEQ ID NO: 11)(下划 线部为￡coRI限制酶位点)和
反向5，-TTGCCGCTCGAGGGACTGGATGTTGGTTGAA-3' (SEQ ID NO: 12) (下划线部为Iol限制酶位点)。
将M尸7/OS尸///和尸i C7的PCR产物分别插入HA标签pCAGGS表达 载体的位点和FLAG标签pCAGGS的五coRI和屈ol位点。通过DNA 序列测定确证了这些构建体的DNA序列。用于扩增截短的M尸/ZOS尸///的 序列的引物如下所示
1182至1302
正向
C-3，(SEQIDNO: 13)和
反向5，-ATAAGAATGCGGCCGCACCTGAATGGTTCGCTGTTTCAT-3 ， (SEQ ID NO: 14);以及
1295至1465正向5，國CCGGAATTCATGAAACAGCGAACCATTCAG-3, (SEQ ID NO:
15)
和
反向
5 ，-ATAAGAATGCGGCCGCTGTGTCAGTATTTCCATTTCATTCTGTT-3 ，(SE Q ID NO: 16);以及 1456至1662
正向5 ，-CCGGAATTCATGAAGCAACAGAATGAAATGGAAATACT-3, (SEQIDNO: 17)和
反向5，國ATAAGAATGCGGCCGCTCTGGACGTATGGCAACCTTTT隱3， (SEQIDNO: 18);以及
1655至1725
正向
5，-ATAAGAATGCGGCCGCTATGGAACAAAAGGTTGCCATACGTC-3' (SEQIDNO: 19)和 反向
5 ，-ATAAGAATGCGGCCGCTGTGCTTCTACATTTGAGAGCTTTGA-3 ， (SEQ ID NO: 20);以及 1718至1780
正向5，-CCGGAATTCATGTCAAAGCTCTCAAATGTAGAAGCA-3' (SEQ ID NO: 21)和
反向5，-ATAAGAATGCGGCCGCTTTGGCTGTTTTTGTTCGA-3， (SEQ ID NO: 10)(下划线分为或五coi I限制酶位点)。
(5)抗MPHOSPHl特异性多克隆抗体
使用pET21载体(Novagen、 Madison, WI)制备了下述质粒，所述质粒净皮 设计成表达在C末端具有His标签表位的MPHOSPHl部分(第1612 1780 位氨基酸)或PRC1部分(第234 360位氨基酸)。在大肠杆菌BL21 codon-plus 抹(Stratagene、 La Jolla, CA)中分别表达这些重组肽，使用Ni-NTA树脂琼脂 糖(Qiagen)和TALON(Takara Clontech)按厂商的规程进4亍纯化。将纯化的重 组蛋白接种于兔，按标准方法用亲和柱纯化了免疫血清。将亲和纯化的抗MPHOSPHl抗体和抗PRC1抗体用于下文所述的western印迹、免疫沉淀法 和免疫细胞化学染色中。通过western印迹分析确认了这些抗体在UMUC3 膀胱癌细胞中特异性识别内源性PHOSPHl。
(6) 同步化和流式细胞术分析
转染24小时后，用阿非迪霉素(2 ng/ml)进一步作用，使细胞停滞在G1 期16个小时。通过用PBS(-)清洗5次解除细胞周期停滞。解除细胞周期停 滞后，在所示的时间点回收细胞。为了进行FACS分析，将400 (al等4分的 同步化的贴壁细胞和脱壁细胞混合，4。C用70%乙醇进行固定。用PBS(-)清 洗后，将细胞与含RNase I 1 mg的PBS 1 ml —起在37。C温育30分钟。然 后将细胞在含碘化丙锭(PI) 50 mg的PBS 1 ml中进行染色。使用流式细胞4义 (FACScalibur; Becton Dickinson、 San Diego， CA)测定至少10000个细月包中 细胞周期各阶段的部分的比例。为了进行免疫细胞化学分析，在所示时间 点对同步化细胞进行固定，并如下述地进行了染色。
(7) 免疫细胞化学分析
以lxl(^个细胞每孔接种了 UMUC3细月包。24小时后，4吏用含4°/。多聚 曱醛(paraformaldehyde)的PBS固定细胞，并用含0.1% Triton X-100的PBS 于室温处理2分钟以使细胞可通透。接下来，于4。C用含3% BSA的PBS 覆盖细胞12小时，以阻断非特异性抗体结合位点。接着，再将细胞与用封 闭液1:100稀释的亲和纯化的抗MPHOSPHl特异性多克隆抗体一起温育。 用PBS清洗后，将UMUC3细胞用1:1000稀释的Alexa 488-偶联抗兔第二 抗体(Molecular Probe)染色。用4'， 6'-二脒基-2'-苯基吲哚二盐酸(DAPI)对细 胞核进行了复染。在显微镜(Leica， Tokyo, Japan)下获取了荧光影像。
(8) 免疫组织化学分析
从外科标本获得了常规石蜡包埋膀胱癌组织切片。为了研究临床材料 中的MPHOSPHl蛋白表达，将组织切片脱石蜡后用高压灭菌器在高pH抗 原修复溶液(DAKO)中于108。C处理15分钟进行抗原修复，然后用 ENVISION+ Kit/HRP (DakoCytomation, Glostmp, Denmark)进行染色。在封 闭内源性过氧化物酶和蛋白质后，将这些切片与1:80稀释的抗MPHOSPHl 多克隆抗体一起温育。使用过氧化物酶标记抗兔免疫球蛋白(EnvisionKit, Dako Cytomation， Carpinteria， CA)进行了免疫检测。最后，将反应物用3,3，-二氨基联苯胺(Dako)显色，将细胞用苏木精进行复染。(9)小分子干扰RNA测定
基于载体的RNA干扰(RNAi)系统——psiU6BX3.0是以前建立的，该系 统被设计成在哺乳动物细胞中合成小分子干扰RNA (Shimokawa T et al.， Cancer Res 2003, 63: 6116-20)。通过将双链寡核苦酸克隆到psiU6BX栽体 中，制备了设计为表达siRNA的质粒。分别按厂商的推荐使用 Lipofectamine2000 (Invitrogen)或FuGENE6 (Roche),用siRNA表达载体转 染了 J82或UMUC3细胞。将转染细胞分别在0.6或1.0 mg/ml遗传霉素 (G418)存在下培养28日或21日，采用Giemsa染色分别测定了集落数。处 理后28日或14日，采用MTT测定评价了细胞存活力。
为了确认MPH0SPH1蛋白表达的抑制，使用亲和纯化的抗MPHOSPHl 特异性多克隆抗体进行了 western印迹分析，并且按标准的规程进行了半定 量RT-PCR。而且，使用特异性引物通过半定量RT-PCR确认了 PRC1特异 性siRNA的敲低效果。作为内部对照的G^PD/HI物同前。尸i C7特异性引 物如下。5'-GTTTGTCCCTTGGCTCTCATC-3' (SEQ ID NO: 22)和
5'陽AGTCCACACTGGTAAGCTTTTGA-3'(SEQ ID NO: 23)。 RNAi用合成 寡核苷酸的靶标序列如下。作为对照的EGFP: 5'-GAAGCAGCACGACTTCTTC画3'(SEQ ID NO: 24); siRNA-MPHOSPHl: 5'-GTGAAGAAGTGCGACCGAA-3'(SEQ ID NO: 25); siRNA-MPHOSPHl错酉己5'-TTGTAGAAGTGCGACCGAG-3'(SEQ ID NO: 26);
siRNA-PRC 1# 1 5'-GGAAAGACTCATCAAAAGC-3'(SEQ ID NO: 27); siRNA-PRCl#2 5'-GCATATCCGTCTGTCAGAAT-3'(SEQ ID NO: 3 l)和 siRNA-PRCl#2错配 5'-TCATATCCCTCTGTAAGAT-3'(SEQ ID NO: 35)。
(10)稳定表达MPHOSPHl的NIH3T3细胞的建立
使用FUGENE6,如上述地用MPHOSPH1表达载体或才莫拟载体转染 NIH3T3细胞。将转染后的细胞在含0.9 mg/ml遗传霉素(G418) (Invitrogen) 的培养基中温育。采用有限稀释法对克隆的NIH3T3细胞进行了亚克隆。通 过使用抗HA单克隆抗体的western印迹分析评价了 HA标签MPHOSPH1 的表达。最后，建立了数个克隆并命名为MPH0SPH1-NIH3T3。为了研究体外的MPHOSPHl生长促进效果，接种了 3种独立的 MPH0SPH1-NIH3T3细胞和3种独立的模拟-NIH3T3细胞各5000个，在5 日内每日通过MTT测定法测定了细胞数。
体内实验是按照机构指导方针(institutional guidelines)在动物设施内进 行的。为了进一步研究MPHOSPHl对棵小鼠中肿瘤生长的效果，对于16 只BALB/cA Jcl-nu小鼠(雌、7周龄)皮下注射NIH3T3-MPHOSPHl-#l、 NIH3T3-MPHOSPHl-#3、 NIH3T3-模拟-弁l或NIH3T3-模拟-弁3(5x106个细 胞)。在3周内，每3日对肿瘤进行测定，用以下公式估算其体积0.5x(长 径(longer diameter))x(短径(shorter diameter))2, 如前所述。
(11) 免疫沉淀法和western印迹
将细胞用裂解緩冲液(50 mM Tris-HCL(pH8.0)、 150 mM NaCl、 0.5% NP-40、蛋白酶抑制剂合剂组(Calbiochem、 SanDiego, CA))裂解。将相等量 的总蛋白与大鼠抗HA抗体(Roche)或小鼠抗c-myc抗体(Sigma) 2吗 一起于 4。C温育2小时。将免疫复合物与蛋白G Sepharose (Zymed Laboratories, South SanFrancisco, CA)—起温育2小时，其后，用裂解緩沖液清洗。对于共沉淀 的蛋白，用SDS-PAGE进行了分离。
将用SDS-PAGE分离的蛋白质转印到硝酸纤维素膜上，其后，与小鼠 抗c-myc抗体(Sigma)或大鼠抗HA抗体(Roche)—起温育。接着，与HRP偶 联的第二抗体一起温育，然后用ECLKit (Amersham Biosciences)使信号可视 化。
(12) MPHOSPHl和PRC1对细胞生长的敲低效果
使用FuGENE6(Roche),用下述质粒转染了 UMUC3细胞，所述质粒净皮 设计成表达si-EGFP (阴性对照)、si-MPHOSPHl或si-PRC 1 (参照上述的 siRNA测定)，然后，在4日内考察细胞形态。转染后第4日，用Alexa594 鬼笔环肽(Molecular probes)和DAPI对细胞进行了免疫细胞化学染色。在共 聚焦显微镜(Leica,日本，东京)下获得了焚光影像。为了研究siRNA对 MPHOSPHl表达的抑制效果，使用亲和纯化的抗MPHOSPHl抗体按标准 规程进行了 western 印迹分析。 2.结果
n)鉴定MP/7asP7/7作为膀胱癌中的上调基因为了鉴定可能适用于新治疗剂的靶标的分子，先前使用代表27,648个 基因或EST的cDNA微阵列进行了 26个浸润性膀胱癌的病例的全基因组表 达才莫式分析(Takata R et al.， Clin Cancer Res April 1, 2005， 11(7): 2625-36)。
通过该分析，鉴定出了 一组在所研究的大多数膀胱癌细胞中表达上调 的基因。这其中，M/WOSP/W (M期磷蛋白l)基因在临床膀胱癌病例中与 膀胱癌细胞系中(数据未给出)通过半定量RT-PCR分析确认都有上调(图 1A)，而其表达在除睾丸外的任何被检查的正常器官中均未检出，因此，选 择该基因用于进一步研究。随后的Northern印迹分析中证明，约7kb的 MPHOSPH1基因转录物在测试的6个膀胱癌细胞系中全部上调，而在除睾 丸外的被检查的正常器官中不表达(图1B、 IC)。
然后，开发了针对MPHOSPHl的多克隆抗体以考察膀胱癌组织中该蛋 白质的表达(参照"材料和方法")。
利用亲和纯化的抗MPHOSPH1多克隆抗体进行的免疫组织化学分析， 在被检的临床浸润性膀胱癌组织切片的膀胱癌细胞中显示阳性染色，但在 被检的正常膀胱组织中未检出(图1D)。而且，在被检的初期阶段的膀胱癌 中检出了 M/WOS尸/W的上调表达(图ID),尽管M/W(9S/W/的上调最初是 通过浸润性膀胱癌表达模式分析而鉴定的，上述事实提示MPHOSPHl与膀 胱癌的发生而不是进展相关。
(2) 膀胱癌细胞中MPHOSPH1的细胞定位
为了进一步阐明iWPi/OS尸/i7基因的性质，通过4吏用抗MPH0SPH1抗 体的免疫组织化学分析研究了膀胱癌细胞系UMUC3中的内源性 MPHOSPH1的细胞定位。内源性MPHOSPH1在间期主要定位在细胞核， 但在核膜消失后的M期细胞中见于整个细胞质。由于免疫细胞化学分析显 示MPHOSPHl的表达图式依赖于细胞周期，因此用阿非迪霉素使UMUC3 细胞同步化以研究细胞周期中不同点上的MPH0SPH1定位。如图2所示， 内源性MPHOSPHl定位在前期、中期和早后期的细胞质。且该蛋白质于晚 后期蓄集在细胞的中间区，最后于末期浓缩到收缩环。这些认识提示 MPH0SPH1在细胞质分裂中的重要功能。
(3) MPHOSPHl的致癌活性
为了评价M尸/ZOSPH7的致癌功能，在显示MPHOSPHl高表达水平的 膀胱癌细胞系J82和UMUC3中，采用基于哺乳动物载体的RNA干扰(RNAi)技术，敲低了 M户7/OS73//7内源表达(参照"材料和方法")。通过半定量 RT-PCR和western印迹分析考察了 MPHOSPHl表达水平，结果发现，与对 照siRNA构建体(si-EGFP)相比，MPHOSPHl特异性siRNA (si-MPHOSPHl) 显著抑制了该基因表达(图3A)。使用siRNA构建体进行的集落形成测定和 MTT测定显示MPHOSPHl特异性siRNA的导入抑制了 J82和UMUC3 细胞的生长(图3B 、 3C)。而且，构建了 si-MPHOSPHl的含3个碱基替换 的siRNA(si-MPHOSPHl错配、参照材料和方法)并进行实验，结果发现其 其不具有对MPHOSPHl表达或膀胱癌细胞生长的抑制效果(图3A)。
为了进一步确认M尸/ZOSP//7的生长促进效果，建立了稳定表达外源性 M尸7/OS75//7的NIH3T3衍生细胞(NIH3T3-MPH0SPH1-1 、' 2和3细胞)。在 western印迹显示3个衍生克隆具有高水平的外源性MPHOSPHl蛋白(图 4A)。其后的MTT测定显示与转染了模拟质粒的细胞(NIH3T3模拟-1、 2、 3细胞)相比，3个衍生细胞系NIH3T3-MPH0SPH1-1、 2、 3生长快得多(图 4B),这暗示MPHOSPHl表达很可能提高细胞生长。然后，进行了 FACS 分析以考察表达外源性MP/fOS7W7的NIH3T3衍生细胞是否加快细胞周期 的运行。如图4C所示，NIH3T3-MPH0SPH1细胞的细胞周期运行在全部时 间点，特别是G2/M期细胞(6小时)中，比NIH3T3-模拟细胞更快(MPH0SPH1: 模拟=35.71%:22.10%)。最终NIH3T3-模拟细胞在12小时时基本上回到 G0/G1期，而NIH3T3-MPHOSPH1细胞在12小时时经过G0/G1期移至了 S 期(图4C)。
为了考察M尸/^OSP//7 的体内功能，通过皮下注射将 NIH3T3-MPHOSPH1细胞或NIH3T3-模拟细胞移植到BALB/cA Jcl-nu小鼠 (雌性，7周龄)中。与移植了 NIH3T3-模拟(-弁l或-#2)细胞的小鼠相比较，移 植了 NIH3T3-MPHOSPHl纟田胞(-#1或-#2)的全部12只小鼠，在棵小鼠中显 著更迅速地形成了更大的肿瘤(图4D)。该认识显示了 MPHOSPHl体内和体 外在膀胱癌形成中的致癌功能。 (4)MPHOSPHl与PRC1的相互作用
为了进一步研究膀胱癌细胞中MPHOSPHl的功能，考察了与 MPHOSPHl相互作用的蛋白质。搜寻的结果是鉴定了胞质分裂蛋白调控因 子1 (protein-regulating cytokinesis 1, PRCl)作为与MPHOSPHl相互作用的 可能候选，因为已知该蛋白于晚后期或末期细胞中定位在中间体中或收缩环附近，并在中间区形成(midzone formation)和细胞质分裂中发挥功能。而且，已经报道PRC1与数个驱动蛋白家族蛋白质相互作用(BanRetal.， JBiolChem 2004， 279: 16394-402; Kurasawa Y et al" EMBO J 2004， 23: 3237-48;Zhu C & Jiang W， Proc Natl Acad Sci USA 2005， 102: 343-8; Gruneberg U et al.,J Cell Biol 2006, 172: 363-72)。
利用半定量RT-PCR进行的膀胱癌病例PRC1表达图式分析发现在膀胱癌病例中PRC1与MPHOSPH1均上调(图5A)。然后，使用HA标签MPHOSPH1和FLAG标签PRC1共转染COS7细胞，进行了共免疫沉淀实验。在使用抗FLAG抗体或抗HA抗体时，发现HA标签MPHOSPH 1与FLAG#签PRC1共沉淀，或者，也发现FLAG标签PRC1相反地与HA标签MPHOSPH1的共沉淀(图5B),这显示了这2种蛋白的相互作用。随后的细胞免疫化学分析显示在UMUC细胞的间期，外源性PRC1定位于被染色的纤维阵列丝(fiber array filament),并且与内源性MPHOSPH1共定位(图5C)。
而且，观察到这些蛋白在M期、特别是晚后期中共定位，转移至纺锤体中间区，在中间区以一组狭长的微管束条的形式共定位。但是，令人感兴趣的是，2种蛋白质在末期细胞中的定位却是分离的。PRCl(红)如前述地定位在中间体的中央，而MPHOSPHl(绿)存在于微小管的正向末端(plusend)附近。该发现强烈地提示，除膀胱细胞末期外，MPHOSPH1在细胞周期期间都与PRC1相互作用。
(5) MPHOSPHl与PRC1的相互作用的鉴定
为了鉴定与PRC1相互作用的MPHOSPH1区域，使用一系列带HA标签的MPHOSPH1截短型与带FLAG标签的全长PRC1共转染COS7细月包，进行了共免疫沉淀实验(图6A)。使用抗FLAG或抗HA抗体进行的免疫印迹分析显示2个MPHOSPHl构建体(第1188-1456位和第1662-1718位的氨基酸)结合于PRC1，这提示MPHOSPH1通过MPHOSPHl的茎柄(stalk)区域的C末端和尾部(tail)区域这2个结合区域与PRC1相互作用(图6B)。
(6) 膀胱癌中PRC1特异性siRNA的生长抑制效果
为了进一步确认膀胱癌发生过程中PRC1的生物学作用，构建了 PRC1特异性siRNA表达载体，用于考察过表达PRC1的膀胱癌细胞系J82和UMUC3中各构建体的敲低效果。在半定量RT-PCR中，si-PRCl#l与si-PRC 1-#2显著地敲低了 PRC1表达，而si-PRCl#l的包含3个碱基取代的si-PRCl错配构建体或阴性对照si-EGFP完全或者基本上未显示出敲低效果。将si-PRCl#l或si-PRCl#2导入J82和UMUC3细胞，结果集落数与细胞存活率显著减少，而对照siRNA和si-PRCl错配对集落形成与细胞存活力完全或基本上没有效果(图7A和7B)。这些发现提示PRCl在膀胱癌细胞的生长中具有重要功能。
而且，如图7C所示，实施了免疫细胞化学分析来考察癌细胞中MPHOSPH1和PRCl的敲低对细胞质分裂的效果。分别用MPHOSPH1或PRCl特异性siRNA表达载体转染UMUC3细胞，在转染后4天的时间内对细胞形态进行观察。令人感兴趣的是，在转染后第4天，在转染2种siRNA中的任一种的细胞中均观察到多核形成(图7C)。该发现提示，MPHOSPH1或PRC1的缺失导致细胞质分裂失败，结果形成多核细胞，最终诱导细胞死亡。
工业实用性
本发明涉及通过检测抑制MPHOSPH1蛋白与PRCl的结合的化合物来鉴定和筛选用于治疗和预防癌症特别是膀胱癌的作用剂的方法。根据本发明证明，通过敲低MPH0SPH1和PRC1，观察到细胞质分裂失败以及多核形成。因此，本筛选方法将会可望帮助开发膀胱癌治疗或预防的新治疗战略。
本说明书中报告的数据加深了对膀胱癌的整体认识，为鉴定用于治疗用药物和预防剂的分子靶标提供了线索。这种信息为更深入理解癌发生作出了贡献，为面向膀胱癌的治疗以及最终的预防的新战略的开发提供了指标。
本说明书提及的所有专利、专利申请和出版物皆以提述方式全文并入本i兌明书。
另外，尽管已经详细地并且参考本发明的具体实施方案描述了本发明，但可理解的是上述说明书实际上是例示性和解释性的，意欲阐明本发明及其优选实施方案。通过常规的实验，本领域技术人员将容易地想到，可对本发明进行各种变化和修饰而不背离本发明的精神和范围。因此，本发明并不意^:受到上述说明的限定，而由如下权利要求及其等同物限定。
权利要求
1.一种鉴定抑制MPHOSPH1与PRC1之间的结合的作用剂的方法，该方法包括下述步骤a)使第一多肽与第二多肽在作用剂的存在下相接触；其中，所述第一多肽选自下组i)包含SEQ ID NO2的氨基酸序列的多肽；ii)包含添加、取代、缺失或插入了一个或多个氨基酸的SEQ ID NO2的氨基酸序列的多肽，条件是该多肽具有与由SEQ ID NO2的氨基酸序列构成的多肽等价的对PRC1的结合活性，iii)包含与SEQ ID NO2至少约80％同源的氨基酸序列的多肽，条件是该多肽具有与由SEQ ID NO2的氨基酸序列组成的多肽等价的对PRC1的结合活性，和vi)与由SEQ ID NO1的核苷酸序列组成的多核苷酸在严格条件下杂交的多核苷酸所编码的多肽，条件是该多肽具有与由SEQ ID NO2的氨基酸序列组成的多肽等价的对PRC1的结合活性；所述第二多肽选自下组i)包含SEQ ID NO37的氨基酸序列的多肽；ii)包含添加、取代、缺失或插入了一个或多个氨基酸的SEQ ID NO37的氨基酸序列的多肽，条件是该多肽具有与由SEQ ID NO37的氨基酸序列组成的多肽等价的对MPHOSPH1的结合活性；iii)包含与SEQ ID NO37至少约80％同源的氨基酸序列的多肽，条件是该多肽具有与由SEQ ID NO37的氨基酸序列组成的多肽等价的对MPHOSPH1的结合活性；和vi)与由SEQ ID NO36的核苷酸序列组成的多核苷酸在严格条件下杂交的多核苷酸所编码的多肽，条件是该多肽具有与由SEQ ID NO37的氨基酸序列组成的多肽等价的对MPHOSPH1的结合活性；b)检测所述第一多肽与第二多肽之间的结合水平；c)将所述第一和第二多肽的结合水平与不存在作用剂的条件下检出的所述第一和第二多肽的结合水平相比较；以及d)选择降低所述第一与第二多肽之间的结合水平的作用剂。
2. 权利要求l的方法，其中所述第一多肽包含SEQIDNO:2的第1188 1718位的氨基酸残基。
3. —种鉴定抑制膀胱癌细胞增殖的作用剂的方法，该方法包括下述步骤a) 使第一多肽与第二多肽在作用剂的存在下相接触；其中，所述第一多肽 选自下组i) 包含SEQ ID NO: 2的氨基酸序列的多肽；ii) 包含添加、取代、缺失或插入了一个或多个氨基酸的SEQIDNO: 2的 氨基酸序列的多肽，条件是该多肽具有与由SEQ ID NO: 2的氨基酸序列 组成的多肽等价的对PRC1的结合活性；iii) 包含与SEQ ID NO: 2至少约80%同源的氨基酸序列的多肽，条件是该 多肽具有与由SEQ ID NO: 2的氨基酸序列组成的多肽等价的对PRC1的 结合活性；和vi)与由SEQ ID NO: 1的核苷酸序列组成的多核苦酸在严格条件下杂交的 多核苷酸所编码的多肽，条件是该多肽具有与由SEQIDNO:2的氨基酸 序列组成的多肽等价的对PRC1的结合活性； 所述第二多肽选自下组i) 包含SEQ ID NO: 37的氨基酸序列的多肽、ii) 包含添加、取代、缺失或插入了一个或多个氨基酸的SEQIDNO:37的 氨基酸序列的多肽，条件是该多肽具有与由SEQ ID NO: 37的氨基酸序列 组成的多肽等价的对MPHOSPHl的结合活性，iii) 包含与SEQ ID NO: 37至少约80%同源的氨基酸序列的多肽，条件是 该多肽具有与由SEQ ID NO: 37的氨基酸序列组成的多肽等价的对 MPHOSPH1的结合活性，和vi)与由SEQ ID NO: 36的核苷酸序列组成的多核苷酸在严格条件下杂交 的多核苷酸所编码的多肽，条件是该多肽具有与由SEQ ID NO: 37的氨基 酸序列组成的多肽等价的对MPHOSPH1的结合活性；b) 检测所述第一多肽与第二多肽之间的结合水平；c) 将所述第一和第二多肽的结合水平与不存在作用剂的条件下检出的所述 第一和第二多肽的结合水平相比较；以及d) 选择降低所述第一与第二多肽之间的结合水平的作用剂作为抑制膀胱癌 细胞增殖的作用剂。
4. 权利要求3的方法，其中所述第 一多肽包含SEQ ID NO: 2的第1188~1718位的氨基酸残基。
5. —种筌定用于治疗或预防膀胱癌的作用剂的方法，该方法包括下述步骤a) 使第一多肽与第二多肽在作用剂的存在下相接触；其中，所述第一多肽 选自下组i) 包含SEQ ID NO: 2的氨基酸序列的多肽；ii) 包含添加、取代、缺失或插入了一个或多个氨基酸的SEQ ID NO: 2的 氨基酸序列的多肽，条件是该多肽具有与由SEQ ID NO: 2的氨基酸序列 组成的多肽等价的对PRC1的结合活性；iii) 包含与SEQIDNO:2至少约80%同源的氨基酸序列的多肽，条件是该 多肽具有与由SEQ ID NO: 2的氨基酸序列组成的多肽等价的对PRC1的 结合活性；和iv) 与由SEQ ID NO: 1的核酸序列组成的多核苦酸在严格条件下杂交的多 核苷酸所编码的多肽，条件是该多肽具有与由SEQ ID NO: 2的氨基酸序 列组成的多肽等价的对PRC1的结合活性；所述第二多肽选自下组i) 包含SEQ ID NO: 37的氨基酸序列的多肽、ii) 包含添加、取代、缺失或插入了一个或多个氨基酸的SEQ ID NO: 37的 氨基酸序列的多肽，条件是该多肽具有与由SEQ ID NO: 37的氨基酸序列 组成的多肽等价的对MPHOSPHl的结合活性，iii) 包含与SEQ ID NO: 37至少约80%同源的氨基酸序列的多肽，条件是 该多肽具有与由SEQ ID NO: 37的氨基酸序列组成的多肽等价的对 MPHOSPH1的结合活性，和vi)与由SEQ ID NO: 36的核苷酸序列组成的多核苷酸在严格条件下杂交 的多核苷酸所编码的多肽，条件是该多肽具有与由SEQ ID NO: 37的氨基 酸序列组成的多肽等价的对MPHOSPH1的结合活性；b) 检测所述第一多肽与第二多肽时间的结合水平；c) 将所述第一和第二多肽的结合水平与不存在作用剂的条件下检出的所述 第一和第二多肽的结合水平相比较；以及d) 选择降低第一与第二多肽之间的结合水平的作用剂作为用于预防或治疗 膀胱癌的作用剂。
6.权利要求5的方法，其中所述第一多肽包含SEQIDNO:2的第1188~1718 位的氨基酸残基。
全文摘要
本发明提供用于鉴定阻碍或抑制MPHOSPH1与PRC1的结合的作用剂的方法。这样的作用剂预期可作为抑制表达MPHOPH1和PEC1的细胞的增殖、以及预防或治疗癌症特别是膀胱癌的药物发挥作用。
文档编号G01N33/574GK101558307SQ20078003992
公开日2009年10月14日 申请日期2007年8月23日 优先权日2006年8月25日
发明者中村佑辅, 中鹤修一, 片桐丰雅 申请人:肿瘤疗法科学股份有限公司