本发明涉及水凝胶制备技术领域，特别涉及一种温敏型肾脏细胞外基质水凝胶的制备方法。
背景技术：
干细胞移植已成为肾脏损伤修复的一种重要手段，主要包括两种方式：经外周血管注射移植和局部注射移植。经外周血管注射移植虽然操作方便，但能够达到靶器官的干细胞数量较少，且可能导致全身不良反应；局部注射移植虽然可保证较高的靶器官干细胞移植率，但干细胞的存活率较低，且部分会随血流移出靶器官
细胞外基质(ecm)水凝胶可显著提高干细胞的滞留率和存活率，增强干细胞的组织修复能力。但现存的细胞外基质获得方法，多洗脱不充分或对ecm损伤较大，且肾脏源性ecm水凝胶的制备，目前尚没有报道。因此，发明一种温敏型肾脏细胞外基质水凝胶的制备方法来解决上述问题很有必要。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种温敏型肾脏细胞外基质水凝胶的制备方法，以解决上述背景技术中提出的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种温敏型肾脏细胞外基质水凝胶的制备方法，包括以下具体制备步骤：
一、肾脏ecm的制备：
步骤一：肾脏初步处理：取动物肾脏，保留肾蒂结构，并且进行肾动脉置管，然后予以500ml双蒸水快速灌注冲洗2h，以去除肾脏血管中残留的血液成分；
步骤二：肾脏脱细胞灌注：当冲洗结束后，利用1000ml的tritonx-100快速灌注4h后，再用1000ml的tritonx-100持续缓慢灌注12h，当tritonx-100灌注完成后，利用50u/mltypeidnasei液快速灌注4h；
步骤三：肾脏冲洗：当漂洗结束后，用双蒸水灌注冲洗2h，去除肾脏内残余tritonx-100和typeidnasei液；
二、肾脏ecm水凝胶的制备：
步骤一：脱水灭菌：当肾脏ecm的制备完成之后，将肾脏在冷冻干燥机中脱去水分，并且剪碎呈粉末状，同时导入环氧乙烷气体进行灭菌；
步骤二：将粉末状的肾脏ecm溶于含胃蛋白酶的0.1m盐酸中，并且在室温条件下搅拌消化；
步骤三：成胶：当步骤二完成之后，向内加入1/9溶液总体积的灭菌10xpbs，并且利用灭菌1xpbs调整最终ecm水凝胶浓度为15mg/ml。
优选的，肾脏ecm的制备的步骤一中动物肾脏为新鲜肾脏，且从动物体内取出时间为10min～60min。
优选的，肾脏ecm的制备的步骤二中tritonx-100浓度设置为0.5％～1.5％，50u/mltypeidnasei液是由10mmtris-base、2mmmgcl2、2mmcacl2和150mmnacl混合而成，且typeidnasei液ph值呈7.6。
优选的，肾脏ecm水凝胶的制备步骤一中冷冻干燥机温度保持在-30℃～-50℃之间。
优选的，肾脏ecm水凝胶的制备步骤二中搅拌消化时间设置为48h，并且消化结束后，加入1m的naoh调整溶液的ph值至7.4。
优选的，肾脏ecm水凝胶的制备步骤三进行时，需始终保持在冰上进行。
优选的，肾脏ecm的制备和肾脏ecm水凝胶的制备在进行时，整个流程都需要在超净台中完成，而且加入的溶液必须经过灭菌或细菌过滤器过滤。
本发明的技术效果和优点：
1、本发明利用灌注法通过肾动脉置管进行冲洗脱细胞，根据血管的分布，脱细胞液能够达到几乎每一处肾脏组织，使得脱细胞更加充分。且细胞破裂后的成分可随着液体流动，及时排出，脱细胞效率更高，大大减少可能的细胞内成分的残留；
2、本发明使用tritonx-100和typeidnasei联合灌注，既对细胞核成分进行充分洗脱，也最大限度保留了肾脏ecm的生物活性成分，使其能够发挥更好的生物学作用；
3、本发明的肾脏ecm水凝胶包含胶原纤维，在人体体温环境下(37℃左右)可迅速变成胶状，形成纵横交错的多孔结构，有利于干细胞浸入，并可防止干细胞的流失，并且肾脏ecm水凝胶可减轻氧化应激损伤，提高干细胞的存活率；
4、本发明的肾脏ecm水凝胶可提高干细胞的旁分泌能力，与单纯干细胞相比，复合水凝胶的干细胞可分泌更多的生物活性因子，增强对损伤组织的修复能力；
5、本发明的肾脏ecm水凝胶中富含硫酸糖胺聚糖等，可与bfgf、hgf等生长因子有效结合，具有缓释的特点，可发挥持久的修复作用。
附图说明
图1为本发明的制备步骤示意图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1：一种温敏型肾脏细胞外基质水凝胶的制备方法，包括以下具体制备步骤：
一、肾脏ecm的制备：
步骤一：肾脏初步处理：取动物新鲜肾脏，且从动物体内取出时间为10min～60min，保留肾蒂结构，并且进行肾动脉置管，然后予以500ml双蒸水快速灌注冲洗2h，以去除肾脏血管中残留的血液成分；
步骤二：肾脏脱细胞灌注：当冲洗结束后，利用浓度为0.5％的1000mltritonx-100快速灌注4h后，再用1000ml的tritonx-100持续缓慢灌注12h，当tritonx-100灌注完成后，利用10mmtris-base、2mmmgcl2、2mmcacl2和150mmnacl混合而成的50u/mltypeidnasei液快速灌注4h，并且typeidnasei液ph值呈7.6；
步骤三：肾脏冲洗：当漂洗结束后，用双蒸水灌注冲洗2h，去除肾脏内残余tritonx-100和typeidnasei液；
二、肾脏ecm水凝胶的制备：
步骤一：脱水灭菌：当肾脏ecm的制备完成之后，将肾脏在-30℃～-50℃的冷冻干燥机中脱去水分，并且剪碎呈粉末状，同时导入环氧乙烷气体进行灭菌；
步骤二：搅拌消化：将粉末状的肾脏ecm溶于含胃蛋白酶的0.1m盐酸中，并且在室温条件下搅拌消化48h，在消化结束后，加入1m的naoh调整溶液的ph值至7.4；
步骤三：成胶：当步骤二完成之后，向内加入1/9溶液总体积的灭菌10xpbs，并且利用灭菌1xpbs调整最终ecm水凝胶浓度为15mg/ml，步骤三进行时，需始终保持在冰上进行；
肾脏ecm的制备和肾脏ecm水凝胶的制备在进行时，整个流程都需要在超净台中完成，而且加入的溶液必须经过灭菌或细菌过滤器过滤。
实施例2：一种温敏型肾脏细胞外基质水凝胶的制备方法，包括以下具体制备步骤：
一、肾脏ecm的制备：
步骤一：肾脏初步处理：取动物新鲜肾脏，且从动物体内取出时间为10min～60min，保留肾蒂结构，并且进行肾动脉置管，然后予以500ml双蒸水快速灌注冲洗2h，以去除肾脏血管中残留的血液成分；
步骤二：肾脏脱细胞灌注：当冲洗结束后，利用浓度为1.0％的1000mltritonx-100快速灌注4h后，再用1000ml的tritonx-100持续缓慢灌注12h，当tritonx-100灌注完成后，利用10mmtris-base、2mmmgcl2、2mmcacl2和150mmnacl混合而成的50u/mltypeidnasei液快速灌注4h，并且typeidnasei液ph值呈7.6；
步骤三：肾脏冲洗：当漂洗结束后，用双蒸水灌注冲洗2h，去除肾脏内残余tritonx-100和typeidnasei液；
二、肾脏ecm水凝胶的制备：
步骤一：脱水灭菌：当肾脏ecm的制备完成之后，将肾脏在-30℃～-50℃的冷冻干燥机中脱去水分，并且剪碎呈粉末状，同时导入环氧乙烷气体进行灭菌；
步骤二：搅拌消化：将粉末状的肾脏ecm溶于含胃蛋白酶的0.1m盐酸中，并且在室温条件下搅拌消化48h，在消化结束后，加入1m的naoh调整溶液的ph值至7.4；
步骤三：成胶：当步骤二完成之后，向内加入1/9溶液总体积的灭菌10xpbs，并且利用灭菌1xpbs调整最终ecm水凝胶浓度为15mg/ml，步骤三进行时，需始终保持在冰上进行；
肾脏ecm的制备和肾脏ecm水凝胶的制备在进行时，整个流程都需要在超净台中完成，而且加入的溶液必须经过灭菌或细菌过滤器过滤。
实施例3：一种温敏型肾脏细胞外基质水凝胶的制备方法，包括以下具体制备步骤：
一、肾脏ecm的制备：
步骤一：肾脏初步处理：取动物新鲜肾脏，且从动物体内取出时间为10min～60min，保留肾蒂结构，并且进行肾动脉置管，然后予以500ml双蒸水快速灌注冲洗2h，以去除肾脏血管中残留的血液成分；
步骤二：肾脏脱细胞灌注：当冲洗结束后，利用浓度为1.5％的1000mltritonx-100快速灌注4h后，再用1000ml的tritonx-100持续缓慢灌注12h，当tritonx-100灌注完成后，利用10mmtris-base、2mmmgcl2、2mmcacl2和150mmnacl混合而成的50u/mltypeidnasei液快速灌注4h，并且typeidnasei液ph值呈7.6；
步骤三：肾脏冲洗：当漂洗结束后，用双蒸水灌注冲洗2h，去除肾脏内残余tritonx-100和typeidnasei液；
二、肾脏ecm水凝胶的制备：
步骤一：脱水灭菌：当肾脏ecm的制备完成之后，将肾脏在-30℃～-50℃的冷冻干燥机中脱去水分，并且剪碎呈粉末状，同时导入环氧乙烷气体进行灭菌；
步骤二：搅拌消化：将粉末状的肾脏ecm溶于含胃蛋白酶的0.1m盐酸中，并且在室温条件下搅拌消化48h，在消化结束后，加入1m的naoh调整溶液的ph值至7.4；
步骤三：成胶：当步骤二完成之后，向内加入1/9溶液总体积的灭菌10xpbs，并且利用灭菌1xpbs调整最终ecm水凝胶浓度为15mg/ml，步骤三进行时，需始终保持在冰上进行；
肾脏ecm的制备和肾脏ecm水凝胶的制备在进行时，整个流程都需要在超净台中完成，而且加入的溶液必须经过灭菌或细菌过滤器过滤。
通过实施例1～3可得出如下数据
通过上述表格数据可知，当tritonx-100浓度为1.0％时，对动物肾脏细胞洗脱效果更加充分，且对动物肾脏有效成分破坏最小，从而保证了制得的肾脏ecm水凝胶质量达到最优。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。