本发明涉及一种钛金属植入物及其制备方法和用途。
背景技术：
在骨骼、软骨和肌肉等组织中产生的恶性肿瘤称为肉瘤。骨肉瘤(osteosarcoma，os)，是最常见的原发性恶性骨肿瘤，主要由出现的恶性间充质细胞产生类骨质或未成熟骨而形成。它占原发骨性肉瘤的30％-80％，主要影响10-30岁的儿童，青少年和年轻人，并且男性多于女性。最常见的os类型(即高级中心os)的发生率高峰是在青春期生长的第二个十年期间发生的。os可以手术治疗，放疗和化疗。通常，骨肉瘤的治疗是先手术切除肿瘤组织，然后植入外源性假体以重建患者的肢体功能。然而，有时候肿瘤细胞却不能完全清除。因此，需要一种能预防骨肉瘤发生或者复发并促进正常骨组织生长的外源性假体。
然而，当前作为植入物的外源性假体现有材料不具有抗肿瘤性能。例如，钛及其合金，由于其机械强度好，比重低，耐腐蚀性和生物相容性优异，不存在过敏反应和与骨形成良好的界面强度，被认为是生物医学应用的首选材料。并且钛已经作为优良的植入体材料，广泛用于各种假体及骨接触应用。而且对钛表面进行的表面形貌的修饰，生物学强化表面的(生物)化学表面修饰，药物涂层的(生物)化学表面修饰都显著提高了其性能。但是，钛表面这三个方面改性的主要应用，还是集中在减少愈合时间并加快整合到宿主组织，或者触发细胞选择性反应，抗细菌附着，降低炎症风险，提高材料可靠性和长期性能等方面。而对于预防肿瘤发生或者复发却没有阐述，因此需要一种药物涂层的(生物)化学表面修饰的钛植入假体来防止癌症发生。
decorin(dcn)是富含亮氨酸的小蛋白多糖家族的重要成员之一，主要由44-kd核心蛋白和硫酸皮肤素侧链组成。已经发现dcn具有显著的抗肿瘤作用(如肺癌，乳腺癌，肝癌，胰腺癌等)。由于dcn在正常和肿瘤组织的微环境中广泛表达，因此可能通过影响基质结构和调节与细胞增殖和存活相关的各种受体来影响肿瘤细胞的生物活性，从而进一步发挥抗肿瘤作用。尽管已经深入研究了dcn在各种肿瘤类型中的表达及其对肿瘤细胞增殖的抑制作用，但是关于底物结合dcn对癌症生长的影响的研究很少。因此，能否将dcn运用于钛的表面改性，从而获得一种抗骨肉瘤假体，是未来研究值得探索的一个方向。
技术实现要素：
为克服目前关节外科钛金属假体植入物材料不具有抗骨肉瘤功能，以及单独的decorin抗骨肉瘤效果不佳的的缺陷，本发明提供一种钛金属植入物，还该提供了钛金属植入物的制备方法和用途。
为实现上述目的，本发明所采取的技术方案：一种钛金属植入物，所述钛金属植入物具有纳米结构化钛表面，decorin通过介质结合于所述纳米结构化钛表面。
优选地，所述介质为聚多巴胺。
优选地，所述纳米结构化钛表面上decorin的浓度为3.78±0.02～15.2±0.01μg/cm2。
最佳地，所述纳米结构化钛表面上decorin的浓度为7.56±0.02μg/cm2。
本发明提供了上述所述的钛金属植入物的制备方法，包括以下步骤：
(1)通过化学氧化的方法在钛金属植入物上构建纳米结构化钛表面；
(2)在步骤(1)得到的纳米结构化钛表面添加多巴胺，多巴胺自聚合反应形成聚多巴胺并结合于所述步骤(1)得到的纳米结构化钛表面；
(3)在步骤(2)得到的纳米结构化钛表面添加decorin，decorin与所述纳米结构化钛表面的聚多巴胺结合，得到所述钛金属植入物。
本发明提供了上述所述的钛金属植入物在制备抗骨肉瘤的植入器械中的用途。
本发明提供了上述所述的钛金属植入物在制备抑制骨肉瘤细胞增殖的植入器械中的用途。
本发明提供了上述所述的钛金属植入物在制备抑制骨肉瘤细胞侵袭或迁移的植入器械中的用途。
本发明提供了上述所述的钛金属植入物在制备促进骨肉瘤细胞凋亡的植入器械中的用途。
本发明提供了上述所述的钛金属植入物在制备促进骨细胞增殖的植入器械中的用途。
本发明的有益效果在于：本发明以钛金属植入物作为底物，通过化学氧化的方法在亚微粒结构钛表面构建纳米结构化钛表面，利用多巴胺自聚合反应在纳米结构化钛表面构建钛-聚多巴胺-decorin复合结构，由此提供了一种具有抗骨肉瘤功能的钛金属假体植入物。本发明提供的钛金属植入物对骨肉瘤细胞具有极高的敏感性及特异性，不仅可以抑骨肉瘤细胞的增殖，还能抑制骨肉瘤细胞的侵袭能力、同时不影响成骨细胞与金属假体的骨整合，有望解决目前骨肉瘤领域金属机体植入物不具有抗肿瘤性能的缺陷，提高骨肉瘤病人术后的生存率。
附图说明
图1为cck-8法检测两种细胞在不同浓度ti-dopa-dcn表面培养3天后的增殖结果。a:saos-2，b:mc3t3-e1。初始接种密度为1×104cells/cm2。误差线表示n＝3时的平均值±标准差，*p<0.05，***p<0.001。
图2为cck-8法检测细胞各自接种在control,dcn,ti,ti-dopa,ti-dopa-dcn表面1，3，5，7天后的增殖结果。a:saos-2,b:mc3t3-e1。初始接种密度为1×105cells/cm2。误差线表示n＝5时的平均值±标准差,***p<0.001。
图3为transwell法检测细胞saos-2在不同底物表面培养3天后细胞侵袭与迁移能力的改变结果。a：control，b:dcn，c:ti，d:ti-dopa,e:ti-dopa-dcn。(a和b)transwell法检测不同底物表面处理后的细胞侵袭和迁移能力(结晶紫染色的为侵袭和迁移的细胞)；c:侵袭通过小室的细胞数目。d:迁移通过小室的细胞数目；初始接种密度为4×105cells/cm2。误差线表示n＝3时的平均值±标准差,*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，标尺:200μm。
图4为荧光显微镜下观察成骨细胞mc3t3-e1和骨肉瘤细胞saos-2在不同钛片底物上共培养24，48，72，96小时后的生长结果。mc3t3-e1用绿色荧光标记，saos-2用红色荧光标记。a:纯ti表面共培养细胞的荧光图片,b:ti-dopa-dcn表面共培养细胞的荧光图片,c:纯ti底物上成骨细胞mc3t3-e1和骨肉瘤细胞saos-2共培养24，48，72，96小时后的细胞计数，d:ti-dopa-dcn底物上成骨细胞mc3t3-e1和骨肉瘤细胞共培养24，48，72，96小时后的细胞计数.初始接种密度为4×103cells/cm2。误差线表示n＝3时的平均值±标准差,*p<0.05,**p<0.01，标尺:200μm。
图5为dapi染色法检测细胞saos-2在不同底物表面培养3天后凋亡的细胞核形态改变结果。a：control，b:dcn，c:ti，d:ti-dopa，e:ti-dopa-dcn。白色箭头示意形态改变的胞核，标尺:200μm。
图6为流式细胞术检测细胞saos-2在不同底物表面培养3天后细胞凋亡及周期分布改变的结果。a：control,b:dcn，c:ti，d:ti-dopa,e:ti-dopa-dcn。a:通过流式细胞技术分析确定凋亡的细胞数,被annexinv-fitc和pi染色的细胞认为发生了凋亡(图6a)。b:凋亡指数定义为凋亡细胞的百分比(图6b)。c:流式细胞法检测细胞周期的分布,用pi为细胞核染色计数各周期细胞的数目(图6c)。d:细胞周期分布的百分比(图6d)。初始接种密度为3×105cells/cm2。误差线表示n＝3时的平均值±标准差,*p<0.05，**p<0.01。
具体实施方式
为了更好地说明本发明的目的、技术方案和有益效果，下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。
实施例1
将100μl以10％fbs的高糖培养基悬浮的骨肉瘤细胞saos-2接种在24孔细胞培养板的两个孔板(其中一个孔中加入100ul(100ug/ml)的decorin蛋白)、10x10mm的纯钛片、聚多巴胺修饰的钛片以及100ug/ml的decorin蛋白修饰的聚多巴胺钛片(ti-dopa-dcn，即本发明钛金属植入物)上，然后将24孔培养板放入标准培养箱孵育4小时，待各组钛片上细胞黏附后，上述各孔加入适量的含10％fbs的高糖培养基，以使每孔溶液的体积达到1000ul，再将细胞置入标准培养箱培养。以此形成该实验所需要的control、dcn、ti、ti-dopa，ti-dopa-dcn100五个分组。每个实验组包括3个复孔。以此来检测saos-2与成骨细胞mec3t3-e1分隔培养时的细胞增殖活力，以及saos-2细胞经上述分组处理后的dapi染色、流式凋亡周期、侵袭/迁移的功能检测。并将骨肉瘤saos-2细胞与成骨细胞mec3t3-e1在钛片上共培养，以检测两种细胞接触共培养时的细胞活力。具体步骤如下：
1、cck-8实验检测saos-2与mec3t3-e1细胞活力
纳米结构化钛表面decorin最优浓度的确定：cck-8法检测骨肉瘤saos-2细胞和成骨细胞mec3t3-e1在不同浓度ti-dopa-dcn(dcn初始浓度分别为0ug/ml、25ug/ml、50ug/ml、100ug/ml和200ug/ml各0.1ml种植于钛片表面)表面培养3天后的增殖情况，从图1的结果表明，从ti-dopa-dcn50开始骨肉瘤saos-2的细胞活力受到抑制，在ti-dopa-dcn100时抑制效果达到最强，ti-dopa-dcn200与ti-dopa-dcn100对骨肉瘤saos-2的抑制作用没有明显区别(图1a)。而各种不同浓度dcn的ti-dopa-dcn对成骨细胞mc3t3-e1的细胞活力没有明显的影响(图1)。据此，ti-dopa-dcn50、ti-dopa-dcn100、ti-dopa-dcn200具有抗骨肉瘤功能，其中ti-dopa-dcn100为最优浓度。通过elisa法检测纳米结构化钛表面decorin的锚定浓度，具有抗骨肉瘤功能浓度的优选范围为3.78±0.02～15.2±0.01μg/cm2，其中最佳浓度为7.56±0.02μg/cm2。
control、decorin、ti、ti-dopa，ti-dopa-decorin100五个实验组中分别种植10000个saos-2细胞，放入培养箱中37℃培养1.3.5.7天。2)使用cck-8试剂盒评价细胞增殖/活力。在待测的时间点用500ul含有10％cck-8的完全培养基替换原来的培养基,然后将细胞在37℃下进一步孵育4小时。将100μl所得悬浮液转移到96孔板中，并使用酶标仪在450nm下测量吸光度。mec3t3-e1细胞用上述同样方法处理。实验重复3次。实验结果如图2所示，在培养1，3，5和7天后，在ti-dopa-dcn底物上培养的saos-2细胞显示出比纯ti底物明显更低的细胞活性(图2a)。生长在ti-dopa底物上的saos-2细胞仅表现出与纯ti底物相似的细胞活性。而在ti-dopa-dcn底物上培养的saos-2细胞显示出比dcn组和control组明显更低的细胞活性。结果表明固定在钛片上的dcn具有细胞毒性,并且这种毒性作用比dcn蛋白单纯散在溶液中的效果更明显。在本研究中观察到在ti，ti-dopa和ti-dopa-dcn底物上接种的成骨细胞mc3t3-e1的细胞活力没有明显改变(图2b)。钛-聚多巴胺-decorin复合结构可显著抑制骨肉瘤细胞saos-2的增殖，同时固定在钛片上的dcn的抗骨肉瘤作用比dcn蛋白单纯散在溶液中的效果更明显，且不影响正常成骨细胞mec3t3的细胞活力。
2、细胞侵袭/迁移实验检测骨肉瘤细胞saos-2侵袭/迁移能力
control、decorin、ti、ti-dopa，ti-dopa-decorin100五个实验组中分别种植50000个saos-2细胞，培养箱中37℃培养2天。制作侵袭小室，首先吸取150ulmatregel胶按1：3稀释，即加入无血清培养基450ul，得500ul稀释的基质胶。每个小室上层(24孔transwell，8um孔径小室)铺稀释胶100ul，共制成5个侵袭小室。然后将24孔transwell板放置于37℃孵育箱2小时使胶凝固。然后吸出小室内残余液体。每个小室加入100ul无血清培养基，置于37℃孵育箱30min水化基底膜(迁移实验不需要这一步骤)。胰酶消化已经处理2天的细胞，用无血清培养基调整细胞密度为1×105/ml，吸取200ul加入到上层小室内，每组细胞种3个小室。下室加入600ul含10％fbs的完全高糖培养基。常规培养24h后，用甲醇固定10min，小棉签擦去小室内侧面细胞，然后用结晶紫染色液染色15min，接着自来水清洗小室后于室温晾干，将小室朝下室侧置于显微镜下随机选取5个视野拍照，并计算侵袭细胞数。实验重复三次。实验结果如图3所示，结果显示，与纯ti底物相比，用ti-dopa-dcn底物处理的saos-2细胞，其侵袭能力受到非常显著的抑制。而且与control和dcn组比较同样具有明显的效果(图3a)。在迁移实验中，ti-dopa-dcn底物上细胞的迁移能力同样受到明显抑制，出现与侵袭实验类似的结果(图3b)。钛-聚多巴胺-decorin复合结构可显著抑制骨肉瘤细胞saos-2的侵袭/迁移能力。
3、saos-2与mec3t3-e1共培养实验
将成骨细胞mec3t3-e1和骨肉瘤细胞saos-2分别用荧光染料dio和did按说明书上的方法为其预染色，然后将两种分别标记好的细胞按细胞数1：1混匀，分别接种在ti和ti-dopa-decorin100上，放入标准细胞培养箱孵育4h后，加入含10％fbs的高糖培养基，放入标准细胞培养箱继续培养，然后分别在24h、48h、72h、96h四个时间点于荧光显微镜下观察细胞，并随机取5个场拍照，运用imagej软件进行荧光半定量计数。实验重复三次。图4共培养结果显示，在纯ti底物上，骨肉瘤细胞saos-2的密度随培养的时间增加而增长，而前成骨细胞mc3t3-e1的密度在不同时间点没有显著变化(图4a)。相反，在ti-dopa-dcn底物上共培养72和96小时后，与骨肉瘤细胞saos-2相比，观察到成骨细胞mc3t3-e1的密度显著增加，表明ti-dopa-dcn底物为成骨细胞mc3t3-e1提供更为有利的环境(图4b)。重要的是，在72小时后，ti-dopa-dcn上的骨肉瘤细胞sao-2的细胞形态发生明显变化。saos-2与成骨细胞共培养实验提示可抑制saos-2增殖同时促进成骨细胞增殖。
4、细胞核dapi染色
control、decorin、ti、ti-dopa，ti-dopa-decorin100五个实验组中分别种植10000个saos-2细胞，培养箱中37℃培养2天。培养两天后的细胞用pbs洗涤3次，并在室温下用4％多聚甲醛固定10分钟。将固定的细胞再用500uldapi工作液润洗一遍，然后在37℃下进一步用dapi工作液染色10分钟。染色完成后用pbs液润洗一遍，并用500ulbindingbuffer固定，然后在倒置荧光显微镜下观察细胞核形态，并随机选取3个区域拍照计算凋亡细胞的细胞核数目。实验重复三次。如图5所示，与纯ti和ti-dopa底物上的细胞相比，接种在ti-dopa-dcn底物上的细胞具有非常明显的核染色质凝聚和碎裂。在形态学检查中，发现在ti-dopa-dcn底物上培养的saos-2细胞表现出典型的凋亡形态变化，如细胞皱缩，核碎裂和凋亡小体形成。在ti-dopa-dcn上培养的saos-2细胞显示出比control组显示明显的细胞核形态改变，而在ti-dopa-dcn底物上培养的saos-2细胞显示出比dcn组和control组明显更多的细胞核碎裂和凋亡小体形成。这些结果证实，ti-dopa-dcn底物能够明显的诱导人骨肉瘤saos-2细胞的凋亡，并且这种诱导凋亡作用比dcn蛋白单纯散在溶液中的效果更明显。钛-聚多巴胺-decorin复合结构可诱导骨肉瘤细胞saos-2发生凋亡，可能是该涂层抑制骨肉瘤的机制之一。
5、流式细胞分析saos-2细胞凋亡及周期实验
control、decorin、ti、ti-dopa，ti-dopa-decorin100五个实验组中分别种植30000个saos-2细胞，培养箱中37℃培养2天。悬浮细胞：用不含edta的胰酶消化细胞3min，离心。pbs洗两次，同时保证细胞数量在10万以上。加入500μl的bindingbuffer悬浮细胞。加入5μl的annexinv-fitc混匀后，再加入5μl的propidiumlodidie，混匀，1小时内上机检测。进行fcm分析以检测细胞周期分布。
control、decorin、ti、ti-dopa，ti-dopa-decorin100五个实验组分别种植30000个saos-2细胞，培养箱中37℃培养2天。除去培养基，用胰酶消化细胞3min并收集，然后用pbs清洗两遍(2000转，5分钟)，然后用预冷的70％乙醇500ul固定，4℃保存。染色前除去固定液。然后加入100ulrnasea37℃水浴30min。再加入400ulpi染色混匀，4℃避光30min，然后通过facscaliburtm流式细胞仪(bdbiosciences，franklinlakes，us)分析细胞周期实验重复三次。结果如图6所示，如图6a所示在control组细胞中annexin-v-fitc/pi染色的facs散点图显示检测到只有极少死亡或凋亡细胞的细胞群。与纯ti底物相比，在ti-dopa-dcn底物上发现凋亡细胞显着增加，并且明显高于control和dcn组。这表明ti-dopa-dcn具有明显的诱导saos-2细胞凋亡的作用。如图6c所示，与纯ti底物上的细胞在g0/g1期细胞数量相比，ti-dopa-dcn底物上细胞在g0/g1期明显积累，并且与control和dcn组比较同样具有明显的效果，表明在ti-dopa-dcn底物上接种的saos-2细胞在g0/g1期生长停滞。结果提示钛-聚多巴胺-decorin复合生物涂层可显著增加saos-2细胞凋亡并使saos-2细胞增殖停留于g1期。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。