本发明属于组织工程和再生医学可植入人体中的医用生物材料领域，具体涉及一种用于可修复组织损伤的表面具有微纳纳米拓扑几何结构的组织工程移植物的制备方法。
背景技术：
组织工程移植物表面微纳拓扑结构可以从空间上较好地模拟组织或器官体内再生的物理微环境，对组织或器官的损伤修复具有重要的促进作用。目前，借助各种物理化学加工手段能够较好地实现在各种无机金属或非金属生物材料表面的微纳拓扑结构的加工，但是在天然或者合成生物材料表面的微纳图形制备仍存在一定难度。传统的用于天然或合成生物材料表面微纳拓扑制备方法主要涉及微接触印刷、微模塑、静电纺丝以及3d打印技术。其中，静电纺丝技术对于制备取向性分布且呈疏松结构的天然或者合成生物材料支架具有较好的优势，而且静电纺丝制备的各种生物材料支架的力学性能相对较好。采用静电纺丝法制备的各种生物材料支架已被广泛研究以期用于对不同组织和器官的修复及再生。但是，采用静电纺丝法制备取向性生物材料支架的过程中仍存在一些不足，比如往往需要借助另外预置的可导电的金属框架作为接收器，金属框架的合适尺寸需要经过多次实验摸索才能确定，而且不易随意变动。另外，采用金属框架接收器收集到的取向性纤维仍然存在不完全平行的现象，部分纤维取向杂乱，势必影响其在生物体内对组织再生的作用。因此，构建表面具有均匀一致微纳拓扑结构的天然或合成生物材料支架仍然存在难度，特别是对于非导电的各类生物材料。为了得到具有更为复杂的微纳米图案化结构，人们试着通过静电纺丝的方法在玻璃片上得到取向或者杂乱的纳米纤维，然后通过软光刻及pdms翻模得到表面具有微图案的琼脂，将琼脂浸泡于相应的刻蚀溶剂中后与纳米纤维接触，接触部分刻蚀脱落(溶剂浓度高)或者成膜(溶剂浓度低)，未接触部分保留丝的结构，从而实现纳米纤维的图案化(《静电纺丝纳米纤维微图案化的构建及其与细胞的相互作用研究》，华南理工大学硕士学位论文，2016)。然而这种方法存在制备工艺繁琐，耗时且纳米纤维微图案均匀性性较差等问题，从而极大的限制了该技术在大规模制备纳米纤维微图案方面的应用。另外，上述方法仅可以用于二维制备微纳米微图案，无法实现三维微纳米微图案的制备，而人体的很多组织比如血管、神经和肌腱等多为三维结构，因此亟需开发可以制备三维微纳米图案的技术。
技术实现要素：
本发明目的是，针对现有技术不足，提供了一种表面具有微纳米拓扑几何结构的组织工程移植物的制备方法。
本发明具体技术方案如下：一种表面具有微纳米拓扑几何结构的组织工程移植物的制备方法，包括如下步骤：
(1)采用微模塑方法制备表面具有微纳米拓扑(立体)几何结构图案的硅橡胶(如pdms聚二甲基硅氧烷)(由模塑决定的)印章；
(2)采用离子溅射法在硅橡胶(pdms等)印章表面喷涂一层厚度约为50-100nm的导电金属纳米涂层，该厚度范围内的涂层不会影响硅橡胶(pdms)印章表面微纳拓扑结构的基本形貌；
(3)采用静电纺丝技术将天然或合成生物材料溶液电纺到硅橡胶(pdms)印章表面，形成生物材料支架；
(4)将纺好的生物材料支架剥离pdms印章，获得表面具有微纳米拓扑几何结构的组织工程移植物。
本发明所述的表面具有微纳米拓扑几何结构的组织工程移植物为微米尺度的拓扑几何结构，而拓扑几何结构又由纳米尺度的生物材料纤维分布构成。优选的，所述步骤(1)微纳米拓扑几何结构为微纳米沟脊、微米纳米突起阵列或微纳米凹坑阵列中的一种或几种的组合。进一步优选，所述微纳米拓扑几何结构为微纳米沟脊，沟的宽度5-50微米，脊的宽度为5-50微米沟，沟的表面为凹面，脊的表面为凸面，沟的表面与脊的表面之间的垂直距离为5-10微米。
本发明所述组织工程移植物由电纺纳米纤维组成，优选纤维直径为50-500纳米。
本发明所述pdms可以由体积比为10:1的二甲基硅氧烷单体和交联剂溶液配制后制得。
本发明所述步骤(2)导电纳米涂层材料选自钛、铝、金、铜或其合金。
本发明所述步骤(3)可采用导电胶或胶体金将pdms印章粘贴到接收板后进行静电纺丝。电纺时间为2-48h。
本发明步骤(3)所述天然或合成生物材料选自壳聚糖、胶原、丝素蛋白、pcl、plga、pla中的至少一种。
本发明静电纺丝技术可采用静电喷涂方式及装置(仪器)。
有益效果，本发明的制备方法和制备得到的组织工程移植物具有以下优点：
1、所述人工神经移植物的制备材料可以是非导电的天然生物材料或合成生物材料；
2、表面具有规则完整的微纳拓扑条纹图案，有利于细胞粘附、生长和组织再生；
3、移植物壁为疏松多孔结构，利于营养物质的运输和细胞的新陈代谢物的交换，另外也为负载促神经再生的各种生长因子提供了很好的平台；
4、移植物可以很容易地从pdms印章上剥离，微纳纤维图案结构保留完整，而电纺到其它基底如金属，玻璃或者培养皿上的微纳纤维图案在剥离过程中容易损坏。
5、移植物制备方法简单易行、适合规模化生产。
6、本发明除了可以用于制备具有二维微纳纤维图案的生物材料支架外，还可以很方便的用于制备具有三维微纳纤维图案的生物材料支架或导管。
附图说明
图1为本发明所述表面具有微纳米拓扑几何结构的组织工程移植物的制备流程。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1
(1)具有取向微纳拓扑图形的pdms印章的制备和表征：
将室温下配制好的pdms(单体：交联剂＝10：1(体积比))浇铸到具有一定微图形尺寸(图形尺寸：沟/脊宽度为5μm/5μm,10μm/10μm,20μm/20μm,30μm/30μm，50μm/50μm,图形深度为1μm,2μm,4μm,6μm,10μm。)的硅片上，然后将其放入真空干燥箱中抽真空排除气泡，并进行干燥固化，最后进行固化后剥离即得到具有沟脊状微图形分布的pdms印章。采用扫描电镜对pdms印章的沟脊图形尺寸和深度进行检测。
(2)表面具有微纳拓扑复合取向性结构的pcl组织工程移植物的制备：
首先将表面具有微纳拓扑结构的pdms印章进行喷涂一层金(粉)，喷涂厚度为50nm，并用导电胶带将pdms印章粘贴到静电纺丝接收端。随后将用二氯甲烷配制的2ml10％浓度的pcl溶液注入静电纺丝专用注射器中，电纺参数为电压：15-21kv，针头到pdms印章距离：20cm，流速：0.03ml/h，纺丝时间：12h。电纺结束后将pcl支架从pdms印章上剥离，然后放在真空干燥箱中进行干燥，获得表面具有微纳拓扑复合取向性结构的pcl组织工程移植物。
(3)表面具有微纳拓扑复合取向性结构的pcl组织工程移植物的制备：
首先将表面具有微纳拓扑结构的pdms印章进行喷涂一层金，喷涂厚度为50nm，并用导电胶带将pdms印章粘贴到静电纺丝接收端。随后将用二氯甲烷配制的2ml10％浓度的pcl溶液注入静电纺丝专用注射器中，电纺参数为电压：15-21kv，针头到pdms印章距离：20cm，流速：0.06ml/h，纺丝时间：12h。电纺结束后将pcl支架从pdms印章上剥离，然后放在真空干燥箱中进行干燥，获得表面具有微纳拓扑复合取向性结构的pcl组织工程移植物。
(4)表面具有微纳拓扑复合取向性结构的pcl组织工程移植物的制备：
首先将表面具有微纳拓扑结构的pdms印章进行喷涂一层金，喷涂厚度为50nm，并用导电胶带将pdms印章粘贴到静电纺丝接收端。随后将用二氯甲烷配制的2ml10％浓度的pcl溶液注入静电纺丝专用注射器中，电纺参数为电压：15-21kv，针头到pdms印章距离：20cm，流速：0.12ml/h，纺丝时间：12h。电纺结束后将pcl支架从pdms印章上剥离，然后放在真空干燥箱中进行干燥，获得表面具有微纳拓扑复合取向性结构的pcl组织工程移植物。
(5)表面具有微纳拓扑复合取向性结构的丝素蛋白组织工程移植物的制备：
首先将表面具有微纳拓扑结构的pdms印章进行喷涂一层金，喷涂厚度为50nm，并用导电胶带将pdms印章粘贴到静电纺丝接收端。随后将用六氟异丙醇配制的2ml5％浓度的丝素蛋白溶液注入静电纺丝专用注射器中，电纺参数为电压：15-21kv，针头到pdms印章距离：20cm，流速：0.1ml/h，纺丝时间：10h。电纺结束后将丝素蛋白支架从pdms印章上剥离，然后放在真空干燥箱中进行干燥，获得表面具有微纳拓扑复合取向性结构的丝素蛋白组织工程移植物。
(6)表面具有微纳拓扑复合取向性结构的壳聚糖组织工程移植物的制备：
首先将表面具有微纳拓扑结构的pdms印章进行喷涂金纳米粒子，喷涂厚度为50nm，并用导电胶带将pdms印章粘贴到静电纺丝接收端。随后将用90％乙酸配制的2ml2％浓度的壳聚糖溶液注入静电纺丝专用注射器中，电纺参数为电压：15-21kv，针头到pdms印章距离：20cm，流速：0.08ml/h，纺丝时间：8h。电纺结束后将壳聚糖支架从pdms印章上剥离，然后放在真空干燥箱中进行干燥，获得表面具有微纳拓扑复合取向性结构的壳聚糖组织工程移植物。
(7)内壁具有微纳拓扑复合取向性结构的pcl组织工程导管的制备：
首先采用微模塑法制备外壁具有微图案的pdms圆柱体印章，然后将表面具有微纳拓扑结构的pdms印章进行喷涂一层金，喷涂厚度为50nm，随后将pdms印章安装到静电纺丝接收端。随后将用二氯甲烷配制的2ml10％浓度的pcl溶液注入静电纺丝专用注射器中，电纺参数为电压：15-21kv，针头到pdms印章距离：20cm，流速：0.03ml/h，纺丝时间：8h，接受轴转速200rpm。电纺结束后将pcl导管从pdms印章上剥离，获得内壁具有微纳拓扑复合取向性结构的pcl组织工程导管。
(8)内壁具有微纳拓扑复合取向性结构的丝素蛋白组织工程导管的制备：
首先采用微模塑法制备外壁具有微图案的pdms圆柱体印章，然后将表面具有微纳拓扑结构的pdms印章进行喷涂一层金，喷涂厚度为50nm，随后将pdms印章安装到静电纺丝接收端。随后将用六氟异丙醇配制的2ml5％浓度的丝素蛋白溶液注入静电纺丝专用注射器中，电纺参数为电压：15-21kv，针头到pdms印章距离：20cm，流速：0.1ml/h，纺丝时间：8h，接受轴转速200rpm。电纺结束后将丝素蛋白支架从pdms印章上剥离，然后放在真空干燥箱中进行干燥，获得表面具有微纳拓扑复合取向性结构的丝素蛋白组织工程移植物。
(9)内壁具有微纳拓扑复合取向性结构的壳聚糖组织工程导管的制备
首先采用微模塑法制备外壁具有微图案的pdms圆柱体印章，然后将表面具有微纳拓扑结构的pdms印章进行喷涂金纳米粒子，喷涂厚度为50nm，随后将pdms印章安装到静电纺丝接收端。随后将用90％乙酸配制的2ml2％浓度的壳聚糖溶液注入静电纺丝专用注射器中，电纺参数为电压：15-21kv，针头到pdms印章距离：20cm，流速：0.08ml/h，纺丝时间：6h，接受端转速为300rpm。电纺结束后将壳聚糖导管浸入pbs1h后从pdms印章上剥离，然后放在真空干燥箱中进行干燥，获得内壁具有微纳拓扑复合取向性结构的壳聚糖组织工程导管。
不成功的操作(10)、(11)
(10)玻片基底上具有微纳取向性结构的丝素蛋白组织工程移植物的制备：
首先将表面有微纳取向性图案的盖玻片粘贴到静电纺丝接收端。随后将用六氟异丙醇配制的2ml5％浓度的丝素蛋白溶液注入静电纺丝专用注射器中，电纺参数为电压：15-21kv，针头到玻片距离：20cm，流速：0.1ml/h，纺丝时间：10h。电纺结束后将丝素蛋白支架从pdms印章上剥离，然后放在真空干燥箱中进行干燥，在剥离丝素膜的时候发现丝素膜跟玻片接触面有粘连，膜表面结构被破坏，无法获得表面具有微纳拓扑复合取向性结构的丝素蛋白组织工程移植物。
不成功的操作
(11)不锈钢基底上具有微纳取向性结构的壳聚糖组织工程移植物的制备
首先将表面有微纳取向性图案的不锈钢片粘贴到静电纺丝接收端。随后将用90％乙酸配制的2ml2％浓度的壳聚糖溶液注入静电纺丝专用注射器中，电纺参数为电压：15-21kv，针头到pdms印章距离：20cm，流速：0.08ml/h，纺丝时间：8h。电纺结束后将壳聚糖支架从pdms印章上剥离，然后放在真空干燥箱中进行干燥，在剥离壳聚糖膜的时候发现丝素膜跟不锈钢片接触面有粘连，膜表面结构被破坏，无法获得表面具有微纳拓扑复合取向性结构的壳聚糖组织工程移植物。