本发明涉及生物医学领域，具体涉及一种神经组织工程化的角蛋白纤维‐神经生长因子复合支架及其制备方法。
背景技术：
神经营养因子的存在可以维持神经干细胞在体外的生存和迁移，使它们具有分化成神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的潜能。已有研究表明神经营养因子可以促进脊髓损伤的修复[lix,yangz,zhanga.theeffectofneurotrophin‐3/chitosancarriersontheproliferationanddifferentiationofneuralstemcells.[j].biomaterials,2009,30(28):4978.]。神经生长因子(ngf)是第一个被发现的神经营养因子。神经生长因子可以促进轴突生长[]mccormickam,jarmusikna,leipzignd.co‐immobilizationofsemaphorin3aandnervegrowthfactortoguideandpatternaxons.[j].actabiomaterialia,2015,28:33‐44.]，促进突起伸展[zuidemajm,provenzac,caliendot,etal.magneticngf‐releasingplla/ironoxidenanoparticlesdirectextendingneuritesandpreferentiallyguideneuritesalongalignedelectrospunmicrofibers.[j].acschemicalneuroscience,2015,6(11):1781‐8.]，诱导神经干细胞分化成神经元[liuf,xuana,cheny,etal.combinedeffectofnervegrowthfactorandbrain‐derivedneurotrophicfactoronneuronaldifferentiationofneuralstemcellsandthepotentialmolecularmechanisms.[j].molecularmedicinereports,2014,10(4):1739.]。但是单纯的神经生长因子的半衰期非常短，这极大限制了其生物作用的发挥[poduslojf,currangl.permeabilityattheblood‐brainandblood‐nervebarriersoftheneurotrophicfactors:ngf,cntf,nt‐3,bdnf.[j].molecularbrainresearch,1996,36(2):280‐286.]。
人类的头发是人体皮肤重要的一种附属器官，无细胞毒性，具有优异的生物相容性。头发纤维从外到内有三层结构：表皮层，皮质层和髓质层[czechka,sagenj.updateoncellulartransplantationintothecnsasanoveltherapyforchronicpain.[j].progressinneurobiology,1995,46(5):507‐529.]。作为一种复合生物纤维，头发的主要成分是角蛋白(占头发总重量的85％‐90％)[czechka,sagenj.updateoncellulartransplantationintothecnsasanoveltherapyforchronicpain.[j].progressinneurobiology,1995,46(5):507‐529.]，所以它是一种具有精细结构的天然角蛋白纤维。角蛋白作为一种生物材料在生物医学领域已经得到了广泛的研究，由于其良好的生物相容性、生物可降解性、机械耐久性和产量丰富。但是这些研究都集中关注于将头发中的角蛋白提取出来，然后进行材料的制备与化学修饰，如制备得到薄膜[zhongy,bellamkondarv.biomaterialsforthecentralnervoussystem.[j].journaloftheroyalsocietyinterface,2008,5(26):957‐975.]、静电纺丝纳米纤维[jaina,kimyt,mckeonrj,etal.insitugellinghydrogelsforconformalrepairofspinalcorddefects,andlocaldeliveryofbdnfafterspinalcordinjury.[j].biomaterials,2006,27(3):497‐504.woerlys,petrovp,sykováe,etal.neuraltissueformationwithinporoushydrogelsimplantedinbrainandspinalcordlesions:ultrastructural,immunohistochemical,anddiffusionstudies.[j].tissueengineering,1999,5(5):467‐488.]、水凝胶[]meilandernj,pasumarthymk,kowalczykth,etal.sustainedreleaseofplasmiddnausinglipidmicrotubulesandagarosehydrogel.[j].journalofcontrolledrelease,2003,88(2):321.]，而忽视了对头发本身这种具有精细结构的天然角蛋白纤维的生物学作用的研究。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种神经组织工程化的角蛋白纤维‐神经生长因子复合支架及其制备方法。
第一方面，本发明要求保护一种角蛋白纤维‐神经生长因子复合支架的制备方法。
本发明所提供的角蛋白纤维‐神经生长因子复合支架的制备方法，可包括如下步骤：
(a)对角蛋白纤维进行处理，破坏最表面惰性的表皮层，暴露出内部活泼的皮质层，得到处理后角质蛋白纤维；
(b)将神经生长因子加载于所述处理后角蛋白纤维上，即获得角蛋白纤维‐神经生长因子复合支架。
进一步地，步骤(a)中，是用酸性溶液(如盐酸、硫酸、硝酸)对所述角质蛋白纤维进行处理的。更进一步地，用于处理所述角质蛋白纤维的酸性溶液的浓度为8m‐12m(如8m)。
在本发明的具体实施方式中，步骤(a)中，所述用酸性溶液处理角质蛋白纤维是按照包括如下步骤的方法进行的：将所述角质蛋白纤维置于8m‐12m酸性溶液(如8m盐酸)中，37‐50℃(如37℃)浸泡30min‐60min(如30min)。
进一步地，步骤(a)中，在用盐酸处理所述角质蛋白纤维之后还可包括如下步骤：将所述角质蛋白纤维用蒸馏水冲洗3次，pbs缓冲溶液(如0.1mpbs缓冲溶液(ph7.2))冲洗3次，去除残留盐酸，37‐50℃(如37℃)烘箱中烘干。
进一步地，步骤(b)中，在将所述神经生长因子加载于所述处理后角蛋白纤维上之前还可包括利用体积分数为75％的酒精对所述处理后角质蛋白纤维进行消毒的步骤。
更进一步地，利用体积分数为75％的酒精对所述处理后角质蛋白纤维进行消毒可按照包括如下步骤的方法进行：在无菌条件下，将所述处理后角质蛋白纤维浸泡于体积分数为75％的酒精中10‐20min(如15min)，之后用pbs缓冲溶液(如0.1mpbs缓冲溶液(ph7.2))冲洗3次，并风干，去除残留的酒精。
进一步地，步骤(b)中，将所述神经生长因子加载于所述处理后角蛋白纤维上可通过用交联剂对所述神经生长因子和所述处理后角蛋白纤维进行交联来实现。其中，所述交联剂可交联具有自由氨基和羧基的物质；所述交联剂具体可如1‐(3‐二甲氨基丙基)‐3‐乙基碳二亚胺盐酸盐(edc)和n‐羟基丁二酰亚胺(nhs)、戊二醛、京尼平等。
更进一步地，步骤(b)中，进行所述交联时采用的交联用缓冲溶液和所述交联剂的配比可为10ml：(20‐100mg)，如10ml：20mg。步骤(b)中，进行所述交联时采用的所述神经生长因子和所述处理后角蛋白纤维的质量比可为1:(2000‐5000)，如1:5000。
更加具体的，步骤(b)中，可按照包括如下步骤的方法对所述神经生长因子和所述处理后角蛋白纤维进行交联：
(b1)将所述处理后角蛋白纤维置于所述交联用缓冲溶液中，然后加入所述交联剂，在室温避光环境下震荡24‐48h(如24h)；
(b2)4℃下将经步骤(b1)处理过的所述处理后角蛋白纤维加入到预冷的0.1mph7.2的pbs缓冲溶液中，再加入所述神经生长因子，在4℃避光环境下震荡反应12‐24h(如12h)。
在步骤(b1)和(b2)中，所述处理后角蛋白纤维、所述交联用缓冲溶液、所述交联剂、所述预冷的0.1mph7.2的pbs缓冲溶液和所述神经生长因子的配比为1mg：10ml：(20‐100mg)：10ml：(200‐500ng)，如1mg：10ml：20mg：10ml：200ng。
在本发明的具体实施方式中，所述交联用缓冲溶液具体为0.1m2‐(n‐吗啡啉)乙磺酸(mes)缓冲溶液(ph5.6)。所述交联剂具体为1‐(3‐二甲氨基丙基)‐3‐乙基碳二亚胺盐酸盐(edc)和n‐羟基丁二酰亚胺(nhs)；进一步地，1‐(3‐二甲氨基丙基)‐3‐乙基碳二亚胺盐酸盐(edc)和n‐羟基丁二酰亚胺(nhs)的质量配比具体可为2:3。
当步骤(b2)反应完成后，还可包括‐80℃抽真空冷冻干燥的步骤。
在所述方法中，所述角蛋白纤维可为毛发，如头发(具体如人类头发)。在本发明的具体实施方式中，所述角蛋白纤维具体为人类头发远离发梢和发根的纤维中间部分，长度大约5cm。
第二方面，本发明要求保护利用前文所述方法制备得到角蛋白纤维‐神经生长因子复合支架。
第三方面，本发明要求保护所述角蛋白纤维‐神经生长因子复合支架在如下任一中的应用：
(a1)制备用于修复神经系统损伤的产品，或修复神经系统损伤；
(a2)治疗神经系统相关疾病的产品，或治疗神经系统相关疾病；
(a3)制备用于促进神经干细胞存活的产品，或促进神经干细胞存活；
(a4)制备用于诱导神经干细胞定向向神经元分化的产品，或诱导神经干细胞定向向神经元分化；
(a5)制备用于增加神经干细胞表面trka受体的表达量的产品，或增加神经干细胞表面trka受体的表达量。
本发明研发了一种可用于神经组织工程的ngf‐角蛋白纤维复合支架。通过对不同浓度酸性溶液处理后的角蛋白纤维进行理化性质的表征，确定了处理的最优酸性溶液浓度(8m‐12m)；然后借助羧基与氨基发生交联反应的方法将ngf加载于角蛋白纤维上，并通过ftir证明了ngf的成功加载。随后的结果提示ngf‐k8支架可以显著促进神经干细胞存活并可增加神经干细胞分化成神经元的比例以及受体trka的表达数量。因此，我们认为ngf‐角蛋白纤维可能作为一种新型三维支架，为应用神经组织工程方法治疗神经系统损伤或疾病提供了一个新的方法和思路。
附图说明
图1为扫描电子显微镜下不同浓度盐酸处理的毛发纤维的表面形貌。a‐d为a‐d的放大图。箭头所指的是盐酸处理后残留的表皮层的底层结构，即表皮内层。
图2为不同浓度酸处理后单根头发纤维的极限拉伸强度(n＝5)。**代表p﹤0.01。
图3为红外图谱。a为不同浓度酸处理后头发纤维；b为ngf，k8和ngf‐k8。
图4为不同共培养体系对神经干细胞突起生长的影响。a是倒置显微镜下不同共培养体系中神经干细胞突起的生长状态。b是分析不同共培养体系中神经干细胞突起生长的定量表征图(n＝10)。*代表p<0.05。柱状图从左往右依次为cont.组、k8组、sngf组、ngf‐k8组。
图5为不同共培养体系对神经干细胞细胞活性的影响。*代表p<0.05，**代表p<0.01。柱状图从左往右依次为cont.组、k8组、sngf组、ngf‐k8组。
图6为不同共培养体系对神经干细胞分化方向的影响及定量分析。a是免疫荧光化学检测，证明四组共培养体系中的神经干细胞都能分化成神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。b是定量分析(n＝4)。*代表p<0.05，***代表p<0.005，****代表p<0.001。柱状图从左往右依次为cont.组、k8组、sngf组、ngf‐k8组。
图7为不同共培养体系对受体trka表达的影响及定量分析。a是免疫荧光化学检测，证明四组共培养体系中都有受体trka的表达。b是定量分析(n＝6)。*代表p<0.05，**代表p<0.01，***代表p<0.005。
图8为ngf‐k8对ngf控制释放的动力学结果。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、神经组织工程化的角蛋白纤维‐神经生长因子复合支架的制备及鉴定
一、材料和方法
1、角蛋白纤维的选取
所有用于本发明的角蛋白纤维均为来自于25‐30岁的健康女性的头发，且实验前没有经过任何烫染或者化学试剂处理，因为这些处理会严重破坏纤维本身的结构。但是，所有的样品使用前都经过洗发水和护发素洗涤，然后用蒸馏水冲洗3次，去除残留的试剂。37℃烘箱中烘干，室温下干燥储存。洗发水和护发素的使用主要是为了清除纤维表面的灰尘和油污等，并不会对头发内部的角蛋白结构产生影响。为了得到头发纤维最健康的部分，所取的纤维样品为远离发梢和发根的纤维中间部分，长度大约5cm。
2、ngf‐角蛋白纤维支架的制备
取上述头发纤维分别置于2m，4m，8m的盐酸中，37℃水浴处理30分钟。蒸馏水冲洗3次，pbs缓冲溶液冲洗3次，去除残留的盐酸。37℃烘箱中烘干，室温下干燥储存以备用。2m，4m，8m的盐酸处理后的头发纤维分别记为k2，k4，k8，未使用盐酸处理的头发纤维记为k0。
在无菌条件下，取最适浓度盐酸处理过后的头发纤维1mg，浸泡于30ml75％(体积分数)酒精中15min，之后用0.1mpbs缓冲溶液(ph7.2)冲洗3次，并风干，去除残留的酒精。将消毒后的头发纤维加入到10ml0.1m2‐(n‐吗啡啉)乙磺酸(mes)缓冲溶液(ph5.6)中，加入8mg1‐(3‐二甲氨基丙基)‐3‐乙基碳二亚胺盐酸盐(edc)和12mgn‐羟基丁二酰亚胺(nhs)，在室温避光环境下，轻微震荡(120rpm)，反应24h。随后，用蒸馏水冲洗3次，4℃下将头发纤维加入到10ml预冷的0.1mpbs(ph7.2)中，再加入200ngngf(sigma，usa)，在4℃避光环境下，轻微震荡(120rpm)，反应12h。反应完成后，‐80℃抽真空冷冻干燥。
3、ngf‐角蛋白纤维支架相关产品的表征
将所有不同浓度的盐酸处理后的角蛋白纤维(k0，k2，k4，k8)样品固定在铝质样品台上，进行喷金处理。借助扫描电子显微镜(fei250，usa)分别观察不同浓度的盐酸处理后的角蛋白纤维(k0，k2，k4，k8)的表面形貌，加速电压为10kv。
使用电子万能材料试验机(instron5565，usa)检测不同浓度的盐酸处理后的单根角蛋白纤维(k0，k2，k4，k8)的极限拉伸强度。最大拉伸力为500n，拉伸速率为2mm/min。每一组至少测试6个样品。
借助atr‐ftirspectroscopy(vertex70v，bruker，usa)对不同浓度的盐酸处理后的角蛋白纤维(k0，k2，k4，k8)和加载了ngf的角蛋白纤维进行化学分析；分辨率为4cm‐1，扫描次数为30次，扫描范围为4000‐400cm‐1，并进行波数扫描。
4、脊髓神经干细胞的分离和培养
无菌状态下，将过量麻醉的新生24hwistar大鼠的脊髓完整取出，置于预冷的pbs缓冲液中。解剖显微镜下(olympusix73，tokyo，japan)移除脊髓的硬脊膜，将脊髓预冷的pbs缓冲液中冲洗3次，再用预冷的dmem/f12培养基中冲洗3次后，将脊髓剪碎，用玻璃吸管轻轻吹打剪碎的脊髓组织，过200目滤网，形成单细胞悬液，以1×105cells/cm2的浓度接种于含新鲜培养基培养瓶(25ml，corning)中。培养基成分为：96.8％dmem/f‐12，2％b27，0.1％bfgf(20ng/ml)，0.1％egf(20ng/ml)，1％青霉素‐链霉素，％表示体积百分含量。将细胞置于37℃，5％co2的培养箱中培养，每2‐3天半量换液一次，即将细胞悬液以1000r/min的转速离心5min，弃半量上清后加入等量新鲜神经干细胞培养基，吹打混匀。
神经干细胞培养一周后，细胞通过不断的分裂和增殖形成神经球，悬浮在培养基中，此时进行传代，用预冷的0.25％胰蛋白酶‐乙二胺四乙酸(edta)消化并用等量神经干细胞培养基终止消化后，轻轻吹打细胞悬液进行机械分离，并再次以单细胞或体积较小的神经球的形式，以1×105cells/cm2的浓度接种于含新鲜神经干细胞培养基的培养瓶中，形成p1代神经球。为了获得纯净的脊髓神经干细胞，重复上述的培养过程，在p3代获得较纯的神经球。
5、细胞活性检测
使用cck‐8(cellcountingkit‐8，dojindo，japan)试剂盒检测细胞活性。即在96孔板中接种细胞悬液(100μl/孔)，将培养板放在37℃、5％co2的培养箱中预培养1天。之后，实验分组为：1)对照组(只含有基础培养基)；2)单纯的角蛋白纤维组(不加载ngf)；3)soluble神经生长因子组(在共培养的起始，一次性加入200ngngf)；4)ngf‐角蛋白纤维组。每组重复8次。随后将培养板放在37℃，5％co2培养箱中培养。在特定时间点(如共培养的1、3和7d)，每孔加入10μlcck‐8溶液，并在37℃、5％co2的培养箱中孵育2h。然后将培养基转移到另一个96孔板中，使用酶标仪(clariostar，bmglabtech，germany)在450nm处测量吸光度值。
6、ngf‐角蛋白纤维支架对神经干细胞行为的影响
取p3代的神经球，以50个神经球/cm2的密度接种在多聚赖氨酸铺板的盖玻片上。将盖玻片置于培养皿中，并加入基础培养基。实验分为：1)对照组(只含有基础培养基)；2)单纯的角蛋白纤维组(不加载ngf)；3)soluble神经生长因子组(在共培养的起始，一次性加入200ngngf)；4)ngf‐角蛋白纤维组。将上述四组共培养体系置于37℃，5％co2的培养箱中培养，每三天半量更换培养基。在特定的时间点，借助倒置显微镜(olympusix73，tokyo，japan)去观察神经球的形态，并进行随机视野拍照，并随机测量每一个神经干细胞球伸出的10个突起的长度即从神经干细胞球的边缘到突起的顶端的直线距离。每组细胞随机检测10个神经球的突起长度。
借助免疫细胞化学的方法，检测不同培养条件对神经干细胞分化行为及trka受体表达量的影响，以及细胞表面受体trka表达的情况。上述四组共培养体系在培养10天后，移除培养基，使用0.01mpbs清洗3次，每次5分钟。之后使用4％多聚甲醛在4℃下固定40min，pbs清洗三次，每次5分钟。用0.3％pbst浸泡5分钟，1％ngs封闭30分钟。随后加入一抗，4℃过夜；pbs清洗3次，每次5分钟，加入相应的二抗，避光，37℃，孵育60分钟。pbs清洗3次，每次5分钟，用hoechst33258核染料(1:1500)在避光环境中染细胞核5分钟，再用去离子水漂洗3次，每次5分钟。最后用50％pb甘油(50％pb甘油就是甘油和pb各一半的混合液(pb：磷酸缓冲溶液)封片，荧光显微镜下观察。其中，所用一抗、二抗及稀释浓度(体积比)分别如表1所示。
表1免疫细胞化学方法中所用一抗、二抗及稀释浓度
7、酶联免疫吸附测定(elisa)
借助enzyme‐linkedimmunosorbentassaykit(elisa，sigma，usa，小鼠源性)来检测各共培养体系下ngf的释放量。具体步骤参照已发表文章[xiaoguangli,zhaoyangyang,aifengzhang.theeffectofneurotrophin‐3/chitosancarriersontheproliferationanddifferentiationofneuralstemcells.biomaterials2009；30:4978‐4985.]，简述如下：共培养启始后，在特定时间点(3h，12h，24h，7d，14d和21d)，从各组中取3份独立且等量的培养基上清液。分别将100μl样品加入到涂覆有mousebeta‐ngfantibody的elisaplate中，4℃孵育过夜。完全移除液体后加入biotinylatedmousebeta‐ngfdetectionantibody，室温孵育1h，轻微震荡。plate清洗后加入hrp‐streptavidin。最后，加入3,3’,5,5’‐tetramethylbenzidine(tmb)，然后通过加入一种酸性溶液终止反应。借助酶标仪(clariostar，bmglabtech，germany)在450nm处测量吸光度值。ngf的量通过已知浓度的ngf标准曲线来确定。
9、统计分析
所有的量化数据均以平均值±标准差表示。借助one‐wayanalysisofvariance(anova)统计分析来评估不同组之间的统计学差异的结果。p值小于0.05被认为是具有统计学差异。
二、实验结果
1、头发纤维的表面形貌
由于头发纤维结构中皮质层具有更多的角蛋白，对维持头发纤维良好的机械性能起到主要作用，且含有更多的羧基，便于进行修饰；而头发纤维外层的表皮层因大量二硫键的存在而呈现出极大的化学惰性，难以直接改性，因此本发明使用盐酸对头发角蛋白纤维进行处理，破坏其最表面惰性的表皮层，破露出内部活泼的皮质层。
人类头发作为一种结构复杂的天然角蛋白纤维，最外层是表皮层，表面呈堆叠的鳞片状结构。如图1所示，没有用盐酸处理的纤维的表面形貌是典型的表皮层结构，表现出致密的鳞片状堆叠的形貌，且鳞片状边缘清晰完整。随着盐酸浓度的逐步升高，头发纤维表面表皮层被破坏的程度增加。2m盐酸处理后头发纤维的表面形貌发生了可见的改变，鳞片状的结构被破坏，特别是边缘部分，但是表皮层的底层结构(表皮内层)仍然大量残留，即箭头所指的团状物质。4m盐酸处理后，可以看到表皮层的结构被进一步破坏，表皮内层也被破坏而消失了，但仍可以看到表皮层的根部结构。8m盐酸处理后的纤维表面已经完全看不到鳞片状的结构，且纤维表面布满了裂痕，这提示表皮层已被完全移除，此时暴露在外面的是皮质层，它作为纤维的主要结构，相较于表皮层具有更高的角蛋白含量。本发明处理角蛋白纤维的目的是为了使头发纤维暴露出更多的角蛋白成分，从而暴露出更多的羧基，以提高ngf的接枝率。所以本发明希望可以完全移除纤维表面的表皮层，从而暴露出内部的皮质层。随着盐酸浓度的提高，头发纤维表皮层被逐渐破坏。当盐酸浓度达到8m时，表皮层被完全破坏，而皮质层完全暴露出来。
2、机械性能
借助万能材料试验机对不同浓度的盐酸处理过的头发纤维的机械性能进行评估。表皮层对头发纤维的机械性能具有重要的影响，因为表皮层主要包含β‐角蛋白，其中丰富的二硫键的存在使头发纤维具有了优异的机械性能。如图2所示，k0组表现出极高的极限拉伸强度，达到149.19±7.86mpa。随着处理的盐酸浓度的逐渐升高，头发纤维的机械性能呈明显的降低趋势(k2，k4，k8的极限拉伸强度分别为111.41±10.96mpa，107.33±7.50mpa，82.45±4.101mpa)，这提示：表皮层破坏程度增加，导致头发纤维的机械性能的降低。k2，k4，k8组头发纤维的机械性能与k0组相比都发生了显著性的降低。与k2组相比，k4组头发纤维的机械性能没有发生显著性变化，虽然k4组中纤维的表皮层已被大部分破坏，k2组中纤维表面仍残留部分表皮内层，但表皮内层中没有二硫键的存在，所以其对纤维的机械强度无明显的影响。k8组相较于k0组，k2组和k4组都发生了显著地降低。尽管k8组头发纤维的机械性能相较于k0组的极限拉伸强度降低了约44.7％，但其仍表现出良好的机械性能(82.45±4.101mpa)。提示：机械性能检测的结果与扫描电镜的结果一致，即随着盐酸浓度的逐渐升高，头发纤维的表皮层的破坏程度增加，从而导致其机械性能降低。k8组的头发纤维的表皮层被完全移除，但仍保留着大量的皮质层，所以仍能保持良好的机械性能。
3、傅里叶红外光谱ftir
头发纤维从外到内分别是表皮层，皮质层和髓质层。皮质层是纤维的主要部分，在三层结构中拥有最多的角蛋白含量。随着处理盐酸浓度的逐渐升高，越来越多的皮质层被暴露出来，而皮质层中含有比表皮层中更多的角蛋白，即含有更多的羧基。不同浓度盐酸处理后的头发纤维均在ftir的谱图中显现出了羧基的特征峰(图3中a)。在3288cm‐1处的大而宽的峰是‐cooh中‐oh的伸缩振动峰，在1642cm‐1处的峰是c＝o的伸缩振动峰，1241cm‐1处是c‐o的伸缩振动峰。提示：随着盐酸浓度的逐渐增加‐oh的峰值和峰面积都发生了增加，这提示头发纤维表面暴露出的羧基的量增加了。其中k8组暴露出的羧基的量明显多于其他三组，这意味着它具有加载上更多ngf的可能。相比于k8组，k4组头发纤维出现了更多的c＝o和c‐o，可能是因为k4组中纤维的表皮层虽然被大部分破坏，但是表皮层和皮质层中间脂质的依然存在。综合ftir，表面形貌和机械性能的检测结果，本发明认为8m的盐酸是最佳处理浓度，因为8m盐酸处理后的头发纤维表皮层已完全移除，同时表现出优异的力学性能以及最多的羧基含量。
图3中b所示是加载ngf前后的角蛋白纤维，以及solublengf的ftir图谱。soluablengf组ngf的曲线中表现出了氨基的特征峰，其中3421cm‐1是游离的‐nh的伸缩振动峰，1465cm‐1是n‐h的弯曲振动峰。k8组角蛋白纤维的图谱表现出羧基的特征峰。soluablengf图谱中氨基的出现和k8组图谱中羧基的出现为ngf加载到角蛋白纤维上提供了依据。ngf‐k8组的图谱中，在3315cm‐1处出现的的吸收峰是酰胺键中‐nh的伸缩伸缩振动峰，提示：成功进行了酰胺反应；1224cm‐1是c‐o的伸缩振动峰，相较于k8组向低波数区域发生了迁移，提示：头发纤维表面的c‐o和ngf中的n‐h产生了氢键。上述结果提示：ngf与角蛋白纤维发生交联反应，从而成功加载到角蛋白纤维上。
4、lightmicroscope
如图4所示：在共培养1天时，k8组和基础培养基组(cont.)仅有少量的神经球粘附到培养皿底部，大部分神经球都没有突起长出并延伸出来。随着共培养时间的延长，到第7天，少量的细胞从神经球中迁移出来，那些细胞有着大的平的胞体和短的突起。光镜下，k8组和基础培养基的神经球的形态以及突起的伸展情况相比没有显著的差异。ngf‐k8组在共培养1天时，就可以观察到大量的神经球贴壁，粘附在培养皿底部，同时有少量短的突起从那些神经球中伸展出来，随着共培养时间的延长，从神经球长出的突起的数量及长度都在增加，共培养第7天，可以观察到大量细胞从神经球中迁移分化出来，突起的长度明显增大，突起之间形成了一个复杂的网络。sngf组虽然第1天也观察到了大量的神经球贴壁，少量突起伸展，但是到第7天时突起的长度和数量都低于ngf‐k8组。
上述结果提示，相对于其他三组，k8‐ngf组对突起的生长与延伸具有显著的促进作用。
5、细胞活性检测
借助cck‐8试剂盒来定量检测共培养体系中细胞的活性。本发明中，为了检测角蛋白纤维是否对脊髓来源的神经干细胞的活性有影响，将其与神经干细胞共培养。在起始共培养第1、3、7天的培养时，k8组和基础培养基的细胞活性没有明显的统计学差异，但显著低于sngf组与k8‐ngf组的细胞活性；共培养7天时sngf组的细胞活性明显低于k8‐ngf组(图5)。
上述结果提示，在7天的共培养周期内，k8‐ngf组中神经干细胞的细胞活性都显著高于k8组和基础培养基。sngf组中神经干细胞的细胞活性在共培养的前3天与k8‐ngf无显著差异，但是到第7天时sngf组中神经干细胞的细胞活性明显低于k8‐ngf组。这主要是因为开始时加入的ngf维持了神经干细胞良好的细胞活性，但是ngf逐渐消耗和失活又没有额外的补充，而k8‐ngf组ngf的持续释放会一直促进神经干细胞的细胞活性。k8组和基础培养基表现出的细胞活性没有显著性的差异，这也提示了单纯的角蛋白纤维对细胞活性无负面影响，具有良好的细胞相容性。
6、神经干细胞的分化
借助免疫荧光染色技术检测了四个共培养体系中的神经干细胞分化的情况(图6所示)。神经元的marker是map2，星形胶质细胞的marker是gfap，少突胶质细胞表达的marker是mbp。如图6中a所示，共培养10天时，四个共培养体系中的中的神经干细胞都分化成了神经元，星形胶质细胞和少量的少突胶质细胞。ngf‐k8组和sngf组中神经干细胞分化成的神经元的数量明显多于基础培养基和k8组。
为了进一步定量分析分化的细胞的表型，本发明从每个共培养体系中随机选取区域，对其中的map2，gfap和mbp‐阳性细胞进行计数。如图6中b所示是共培养10时，k8组，基础培养基和sngf组中神经干细胞分化出的细胞表型的比例是星形胶质细胞>神经元>少突胶质细胞，而在k8‐ngf组中是神经元>星形胶质细胞>少突胶质细胞。k8‐ngf组中，神经干细胞分化为神经元的比例高达77.6±2.56％，而分化为星形胶质细胞的比例只有21.8±2.62％。而k8组和基础培养基更多的诱导神经干细胞分化成了星形胶质细胞(76±2.19％和74±2.19％)，分化成神经元的比例非常低(分别是22.4±2.26％和23.6±2.27％)。sngf组中虽然分化的神经元的比例(35.8±2.29％)高于k8组和对照组，低于k8‐ngf组，但是其分化的星形胶质细胞的比例仍然较高(63.5±2.41％)，这是由于sngf组中开始加入的ngf快速的变性失活，导致其对神经干细胞的分化无法达到持续的促进作用。所有的上述结果提示ngf‐k8更有利于诱导神经干细胞定向向神经元分化。k8组和基础培养基中分化出的各种细胞表型的比例均没有显著性差异，这表明不载有ngf的角蛋白纤维对神经干细胞的分化无明显作用。
7、受体trka的表达
已有研究证明trka的激活对细胞的生存和分化非常重要。ngf诱导神经干细胞的分化是通过结合细胞膜上的trka受体，激活下游通路，最终促使细胞分化。结果提示：共培养起始10天时，ngf‐k8组受体trka的表达量明显高于另外三组(图7)。
8、elisa
有研究已证明了神经营养因子和生物材料支架的结合可以增强神经营养因子的功能有效性和延长其功能持续时间。ngf的半衰期非常短(大概7.2分钟)，在生理环境下很容易失活，且不易通过血‐脑脊液屏障。作为ngf的载体，角蛋白纤维在稳定ngf生物活性方面发挥了巨大的作用。如图8所示，elisa检测的结果提示：ngf‐k8可持续释放ngf至少3周，在3小时处ngf有一个初始的快速释放，12小时后ngf的释放呈稳定状态。结果提示，将ngf加载至角蛋白纤维上之后可以防止神经营养因子的变性和水解，并可控制对其缓慢释放至三周。