本发明涉及水凝胶制备领域，特别是涉及基于酰腙键和亲疏水自组装的双交联杂化水凝胶、其制备方法及皮肤组织创面修复剂。
背景技术：
高分子水凝胶是由高分子组分经化学或物理交联制备的三维网络，经水溶胀后具有一定的机械强度与弹性。高分子按其来源可分为天然和合成两大类。天然的亲水性高分子包括多糖类(纤维素、淀粉、海藻酸、透明质酸，壳聚糖等)和蛋白类(胶原、明胶、聚赖氨酸、聚谷胺酸等)。合成的亲水高分子包括聚醇类(聚乙二醇)、改性聚酯(聚氨酯、亲水改性聚己内酯、聚乳酸等)、丙烯酸及其衍生物类(聚丙烯酸，聚甲基丙烯酸，聚丙烯酰胺，聚n-聚代丙烯酰胺等)及其共聚物等。高分子水凝胶的交联结构可以由物理相互作用、共价键以及动态共价键来完成。物理相互作用主要包括：链缠结、氢键、疏水相互作用、静电相互作用、超分子相互作用等；动态共价键包括双硫键、席夫碱以及酰腙键等；另外，一些特殊的物理或化学键合形式也得到关注，比如滑环交联结构、微晶结构等。
作为一种软、湿材料，高分子水凝胶用于临床医疗的案例已不再罕见，该技术与医疗的结合方式主要有以下几种：①组织植入物制备(骨骼、牙齿、软组织器官等)；②药物载体与传输；③外用医疗材料如皮肤修复与护理等。应用于皮肤烧伤、机械损伤或慢性病溃疡创面，可以用于降低创面温度，阻隔细菌，吸收渗液，减轻疼痛，阻止创面伤加深，以及加速创面愈合，缩短治疗周期，减轻瘢痕增生等。
目前高分子水凝胶在软组织修复中的应用受到广泛关注与研究，但其成分与结构复杂，也存在机械强度、结构与综合性能等无法统一与共同提高等挑战，有待进一步完善：①对于物理相互作用作为交联点的水凝胶，其强度相对脆弱，不利于其在临床上的推广与商品化；②对于共价键作为交联点构建的水凝胶，不具有自修复性与可塑性，其机械强度提高的时候，必然对应交联度的提高，但提高交联度会导致水凝胶网络尺度太低，影响细胞的浸润与迁移；③此外，多数高分子材料的分子量太高，降解速度过快或过慢，不可控，或其生物相容性不佳，也制约着其在医学领域中的应用。
技术实现要素：
(一)要解决的技术问题
本发明的目的是提供基于酰腙键和亲疏水自组装的双交联杂化水凝胶、其制备方法及皮肤组织创面修复剂，解决上述至少一个技术问题。
(二)技术方案
为了解决上述技术问题，本发明提供一种基于酰腙键和亲疏水自组装的双交联杂化水凝胶，其原料包括：酰肼基修饰的透明质酸hahz和醛基修饰的聚氧化乙烯-聚氧化丙烯-聚氧化乙烯pfah；hahz和pfah的添加质量比例满足：酰肼基取代度/醛基取代度的范围为20-80％，水溶剂余量。
本方案中，酰腙键为可逆动态共价键，基于可逆动态共价键制备的水凝胶交联点的化学动力学在反应物与产物间转换并达到化学平衡状态，使得制备的水凝胶具有自愈合的特性，有利于解决目前的水凝胶医用敷料面临的受外力易碎问题。聚氧化乙烯(peo)-聚氧化丙烯(ppo)-聚氧化乙烯(peo)三嵌段共聚物，各嵌段分子链可以调整，peo链段亲水易溶于水，ppo链段疏水难溶于水，该组分在水中易自组装形成胶束。使得该水凝胶具有良好的快速原位成型特性，更有利于贴合各种不规则的伤口，该水凝胶所具有的特殊结构使得其对于组织修复具有良好的效果。
在一些实施例中，优选为，所述酰肼基修饰的透明质酸中酰肼基的取代度为1.0-50％。
在本方案中，透明质酸的化学结构上含有大量羟基与羧基，通过化学修饰的方法引入酰肼基。
在一些实施例中，优选为，所述透明质酸为由单位d-葡萄糖醛酸及n-乙酰葡糖胺组成的酸性粘多糖。在本方案中，透明质酸为天然高分子多糖透明质酸，具有特殊的保水作用，是自然界中保湿性最好的物质，具有促进创伤愈合的作用。可以提高产品的保水作用和创伤自愈效果。
在一些实施例中，优选为，所述醛基修饰的聚氧化乙烯-聚氧化丙烯-聚氧化乙烯为醛基取代所述聚氧化乙烯-聚氧化丙烯-聚氧化乙烯端基的羟基。在本方案中，peo-ppo-peo三嵌段聚合物是一类合成高分子，分子链非常柔软、无毒且生物安全性较好的聚醚。提供一种在水中易自组装的胶束，提高产品的强度和原料的生活相容性。
在一些实施例中，优选为，所述醛基的取代度为1.0-100％。peo-ppo-peo三嵌段聚合物的端基羟基可被醛基取代。
在一些实施例中，优选为，所述双交联杂化水凝胶的固含量为2-22％。在规定条件下烘干后剩余部分占总量的质量百分数为2-22％。
在一些实施例中，优选为，所述原料还包括：生长因子或干细胞；所述水溶剂包括超纯水。在本方案中，通过生长因子、干细胞等具备生物活性成分的生长因子或干细胞促进皮肤创面的修复和再生长。减少皮肤创面的感染几率。
本发明还提供了一种所述基于酰腙键和亲疏水自组装的双交联杂化水凝胶的制备方法，其包括：制备酰肼基修饰的透明质酸hahz；制备醛基修饰的聚氧化乙烯-聚氧化丙烯-聚氧化乙烯pfah；常温下，按预设比例将所述酰肼基修饰的透明质酸hahz和所述醛基修饰的聚氧化乙烯-聚氧化丙烯-聚氧化乙烯pfah以及水溶剂混合；搅拌均匀，得到预交联凝胶；静置，预交联凝胶渐变为具有弹性的水溶胀三维网络产品或水凝胶。在本方案中，hahz和pfah直接混合混匀即可得到预交联凝胶，并随着静置逐步变为所需产品。
在一些实施例中，优选为，在所述按预设比例将所述酰肼基修饰的透明质酸hahz和所述醛基修饰的聚氧化乙烯-聚氧化丙烯-聚氧化乙烯pfah以及水溶剂混合中还包括：将具备生活活性成分的生长因子或干细胞加入混合。在本方案中，通过生长因子、干细胞等具备生物活性成分的生长因子或干细胞促进皮肤创面的修复和再生长。
本发明还提供了一种皮肤组织创面修复剂，其包括所述的基于酰腙键和亲疏水自组装的双交联杂化水凝胶。有利于贴合各种不规则的伤口，该水凝胶所具有的特殊结构使得其对于组织修复具有良好的效果。
(三)有益效果
本发明提供的技术方案，基于酰腙键和亲疏水自组装的双交联水凝胶充分结合了共价交联及物理相互作用的优势。酰腙键作为一种新颖、典型的可逆动态共价键，基于可逆动态共价键制备的水凝胶交联点的化学动力学在反应物与产物间转换并达到化学平衡状态，使得制备的水凝胶具有自愈合的特性，有利于解决目前的水凝胶医用敷料面临的受外力易碎问题。此外，酰腙键交联点处于不停的“开”与“关”的动态平衡中，类似于阀门，不会束缚细胞的浸润与迁移。因此，该水凝胶在分子结构方面对于细胞行为及组织再生或修复具有明显的优势。同时，由于peo-ppo-peo三嵌段聚合物在常温下能够自组装成胶束，赋予了该高分子水凝胶更加优异的力学性能，并且温敏性的peo-ppo-peo三嵌段聚合物的引入使得该水凝胶具有较好的温度响应性，凝胶的强度随温度的提升有显著的增加，使得该水凝胶具有良好的快速原位成型特性，更有利于贴合各种不规则的伤口，该水凝胶所具有的特殊结构使得其对于组织修复具有良好的效果。
附图说明
图1为实施例8hahz/pfah双交联杂化水凝胶的凝胶强度随时间的变化；
图2为实施例9所述的hahz/pfah双交联杂化水凝胶在无外界刺激下的愈合及拉伸图片；
图3为实施例10所述的烧伤修复21天时的皮肤病理学h&e染色分析。
具体实施方式
下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
本发明提供了一种基于酰腙键和亲疏水自组装的双交联杂化水凝胶，其原料包括：酰肼基修饰的透明质酸hahz和醛基修饰的聚氧化乙烯-聚氧化丙烯-聚氧化乙烯pfah；hahz和pfah的添加质量比例满足：酰肼基取代度/醛基取代度的范围为20-80％，水溶剂余量。酰肼基对透明质酸中的羟基和羧基取代，醛基对聚氧化乙烯-聚氧化丙烯-聚氧化乙烯pfah端部的羟基进行取代。
基于酰腙键和亲疏水自组装的双交联水凝胶充分结合了共价交联及物理相互作用的优势。酰腙键作为一种新颖、典型的可逆动态共价键，基于可逆动态共价键制备的水凝胶交联点的化学动力学在反应物与产物间转换并达到化学平衡状态，使得制备的水凝胶具有自愈合的特性，有利于解决目前的水凝胶医用敷料面临的受外力易碎问题。此外，酰腙键交联点处于不停的“开”与“关”的动态平衡中，类似于阀门，不会束缚细胞的浸润与迁移。因此，该水凝胶在分子结构方面对于细胞行为及组织再生或修复具有明显的优势。
同时，由于peo-ppo-peo三嵌段聚合物在常温下能够自组装成胶束，赋予了该高分子水凝胶更加优异的力学性能，并且温敏性的peo-ppo-peo三嵌段聚合物的引入使得该水凝胶具有较好的温度响应性，凝胶的强度随温度的提升有显著的增加，使得该水凝胶具有良好的快速原位成型特性，更有利于贴合各种不规则的伤口，该水凝胶所具有的特殊结构使得其对于组织修复具有良好的效果。
透明质酸(hyaluronicacid，ha)是一种天然大分子葡萄氨基多糖，具有特殊的保水作用，是目前发现的自然界中保湿性最好的物质，被称为理想的天然保湿因子(naturalmoisturizingfactor，nmf，具有促进创伤愈合的作用。皮肤中也含有大量的透明质酸。人类皮肤成熟和老化过程也随着透明质酸的含量和新陈代谢而变化。此外，它含有羧基和羟基，易于进行各种反应，可灵活合成出各种衍生物。peo-ppo-peo三嵌段聚合物是一类合成高分子，分子链非常柔软、无毒且生物安全性较好的聚醚。因此，该水凝胶所选材料具有优秀的生物相容性，普遍应用于临床应用，安全性高。
本技术得到的基于酰腙键和亲疏水自组装的双交联杂化水凝胶,具有优良的自愈合特性，有利于解决医用凝胶敷料受外力易碎的问题；具有一定的温度响应性，具有优良的机械性能和原位成型特性，非常适宜于皮肤组织创面的修复护理或治疗。
透明质酸是一种酸性粘多糖，是由单位d-葡萄糖醛酸及n-乙酰葡糖胺组成的高级多糖，天然高分子多糖透明质酸，其化学结构上含大量羟基与羧基，可以通过化学修饰的方法引入酰肼基；酰肼基修饰的透明质酸中酰肼基的取代度为1.0-50％，优选为10-25％，或20-40％。
聚氧化乙烯(peo)-聚氧化丙烯(ppo)-聚氧化乙烯(peo)三嵌段共聚物，高分子共聚物，各嵌段分子链可以调整，聚氧化乙烯peo链段亲水易溶于水，聚氧化丙烯ppo链段疏水难溶于水，该组分在水中易自组装形成胶束；泊洛沙姆的端基为羟基，可以经化学改性生成醛基；醛基的取代度为1.0-100％。优选10-35％、或55-85％，或40-80％等。
该双交联杂化水凝胶的固含量为2-22％。其原料还加入具备生物活性成分的生长因子或干细胞等；水溶剂作为余量，水溶剂包括超纯水，所有原料的质量浓度百分比之和为100％。
针对现有技术的不足，本发明旨在提供一种基于酰腙键和亲疏水自组装的双交联杂化水凝胶，通过在皮肤创伤修复领域中的应用来说明其在医学领域具有独特的技术优势与广阔的应用前景。该体系将利用动态共价键及亲疏水自组装本身的物理化学性质、天然高分子与水凝胶本身的特点，为医学组织工程再生与修复尤其是皮肤组织工程提供一种新颖与可靠的材料。优势如下：
(1)基于酰腙键和亲疏水自组装的双交联水凝胶充分结合了共价交联及物理相互作用的优势。酰腙键作为一种新颖、典型的动态共价键，对于水凝胶性能具有极大优势。可逆动态共价键，处于不停的“开”与“关”的动态平衡中，类似于阀门，不会束缚细胞的浸润与迁移。基于可逆动态共价键制备的水凝胶交联点的化学动力学在反应物与产物间转换并达到化学平衡状态，使得制备的水凝胶具有自修复性能与创面粘合性，有利于解决目前的水凝胶医用敷料面临的受外力易碎及易脱落问题。同时，由于peo-ppo-peo三嵌段聚合物在常温下能够自组装成胶束，赋予了该高分子水凝胶更加优异的力学性能，并且温敏性的peo-ppo-peo三嵌段聚合物的引入使得该水凝胶具有较好的温度响应性，凝胶的强度随温度的提升有显著的增加，使得该水凝胶具有良好的快速原位成型特性，更有利于贴合各种不规则的伤口。
(2)ha与peo-ppo-peo三嵌段聚合物均具有非常优秀的组织相容性；酰肼基改性的ha(hahz)与醛基改性的泊洛沙姆(pfah)混合后呈现一定的流动性，可以直接涂抹在皮肤损伤的组织创面，很快变为具有一定强度的材料，起到类似于皮肤敷料的作用。因此，该水凝胶应用于皮肤敷料，对于临床应用非常方便。
(3)具有很强的吸水性，可以吸收组织渗液；具有一定的机械强度与组织粘合性；非常适宜于皮肤组织创面的修复护理或治疗；
(4)可在0-37度下储存并保持原有成分、微结构及生物活性，仅凭简单的温度调控物理混合既能快速成型，不含光敏物质，更为安全，更适用于在日用化工、科研、临床医学、转化医学中应用推广。在皮肤修复与护理领域的应用同样具有绝对优势。
本发明还提供了一种基于酰腙键和亲疏水自组装的双交联杂化水凝胶的制备方法，其包括：
步骤110，制备酰肼基修饰的透明质酸hahz；
步骤112，制备醛基修饰的聚氧化乙烯-聚氧化丙烯-聚氧化乙烯pfah；
步骤114，常温下，按预设比例将酰肼基修饰的透明质酸hahz和醛基修饰的聚氧化乙烯-聚氧化丙烯-聚氧化乙烯pfah以及水溶剂混合；
步骤116，搅拌均匀，得到预交联凝胶；
步骤118，预交联凝胶渐变为具有弹性的水溶胀三维网络产品或水凝胶。
其中，步骤114中可以将hahz和部分水溶剂混合得到混合物一，将pfah与部分水溶剂混合得到混合物二，然后将混合物一和二进行混合，搅拌均匀得到预交联凝胶。或者直接将hahz和pfah直接与水溶剂进行混合。
步骤114中提到常温，即未加任何温度调节干扰因素的情况下的自然温度。优选为22-37℃的范围内的温度值。
为了增加双交联杂化水凝胶的生物活性，提高应用中对皮肤创面的修复、再生效果，在按预设比例将酰肼基修饰的透明质酸hahz和醛基修饰的聚氧化乙烯-聚氧化丙烯-聚氧化乙烯pfah以及水溶剂混合中还包括：将具备生活活性成分的生长因子或干细胞加入混合。
本发明还提供了一种皮肤组织创面修复剂，其包括上述基于酰腙键和亲疏水自组装的双交联杂化水凝胶。
本皮肤组织创面修复剂在使用中，基于透明质酸与聚氧化乙烯-聚氧化丙烯-聚氧化乙烯均具有非常优秀的组织相容性；酰肼基修饰后得到的hahz与醛基修饰得到的pfah混合后呈现一定的流动性，可以直接涂抹在皮肤损伤的组织创面，很快变为具有一定强度的材料，起到类似于皮肤敷料的作用。因此，该水凝胶应用于皮肤敷料，对于临床应用非常方便。
本发明公开的一种基于酰腙键和亲疏水自组装的双交联水凝胶的制备及其在皮肤组织创面修复，尤其是烧伤修复中的应用，其中酰腙键是一种动态共价键，它是一种可逆键，基于动态共价键制备的水凝胶交联点的化学动力学在反应物与产物间转换并达到化学平衡状态，使得制备的水凝胶具有自愈合的特性，有利于解决目前的水凝胶医用敷料面临的受外力易碎问题。此外，酰腙键交联点处于不停的“开”与“关”的动态平衡中，类似于阀门，不会束缚细胞的浸润与迁移。因此，该水凝胶在分子结构方面对于细胞行为及组织再生或修复具有明显的优势。同时，由于peo-ppo-peo三嵌段聚合物在常温下能够自组装成胶束，赋予了该高分子水凝胶更加优异的力学性能，并且温敏性的peo-ppo-peo三嵌段聚合物的引入使得改水凝胶具有较好的温度响应性，凝胶的强度随温度的提升有显著性增加，使得改水凝胶具有良好的原位成型特性，更有利于贴合各种不同形状的伤口，该水凝胶所具有的特殊结构使得其对于组织修复具有良好的效果。该水凝胶所选材料具有优秀的生物相容性，普遍应用于临床应用，安全性高。
实施例1
分别精确配制5％(w/v)的hahz和5％(w/v)的pfah的聚合物溶液，将两者充分混合，室温下静置交联形成凝胶。
实施例2
分别精确配制5％(w/v)的hahz和10％(w/v)的pfah的聚合物溶液，在溶液中增加生长因子，充分混合，室温下静置交联形成凝胶。
实施例3
分别精确配制5％(w/v)的hahz和15％(w/v)的pfah的聚合物溶液，在溶液中增加干细胞，充分混合，室温下静置交联形成凝胶。
实施例4
分别精确配制5％(w/v)的hahz和20％(w/v)的pfah的聚合物溶液，将两者充分混合，室温下静置交联形成凝胶。
实施例5
分别精确配制10％(w/v)的hahz和10％(w/v)的pfah的聚合物溶液，将两者充分混合，室温下静置交联形成凝胶。
实施例6
分别精确配制10％(w/v)的hahz和15％(w/v)的pfah的聚合物溶液，将两者充分混合，室温下静置交联形成凝胶。
实施例7
分别精确配制10％(w/v)的hahz和20％(w/v)的pfah的聚合物溶液，将两者充分混合，室温下静置交联形成凝胶。
实施例1-7中的hahz中酰肼基的取代度为1-50％，比如：10％、25％、20％或40％；
实施例1-7中的pfah中醛基的取代度为1-100％，比如：10％、35％、55％、85％等。
而且，酰肼基和醛基取代度比值满足20-80％，比如30％，50％，75％等。
下面给出hahz和pfah的制备：
实施例1-7-1，
采用酰肼基取代透明质酸中的羟基、羧基，获得酰肼基取代度为1％的hahz。
实施例1-7-2
采用酰肼基取代透明质酸中的羟基、羧基，获得酰肼基取代度为10％的hahz。
实施例1-7-3
采用酰肼基取代透明质酸中的羟基、羧基，获得酰肼基取代度为20％的hahz。
实施例1-7-4
采用酰肼基取代透明质酸中的羟基、羧基，获得酰肼基取代度为25％的hahz。
实施例1-7-5
采用酰肼基取代透明质酸中的羟基、羧基，获得酰肼基取代度为40％的hahz。
实施例1-7-6
采用醛基取代聚氧化乙烯-聚氧化丙烯-聚氧化乙烯的端基羟基，获得醛基取代度为1％的pfah。
实施例1-7-7
采用醛基取代聚氧化乙烯-聚氧化丙烯-聚氧化乙烯的端基羟基，获得醛基取代度为35％的pfah。
实施例1-7-8
采用醛基取代聚氧化乙烯-聚氧化丙烯-聚氧化乙烯的端基羟基，获得醛基取代度为55％的pfah。
实施例1-7-9
采用醛基取代聚氧化乙烯-聚氧化丙烯-聚氧化乙烯的端基羟基，获得醛基取代度为100％的pfah。
实施例1-7-10
分别精确配制酰肼基取代度为20％的hahz和醛基取代度为100％的pfah的聚合物溶液，将两者充分混合，室温下静置交联形成凝胶。
实施例1-7-11
分别精确配制酰肼基取代度为40％的hahz和醛基取代度为50％的pfah的聚合物溶液，将两者充分混合，室温下静置交联形成凝胶。
实施例1-7-12
分别精确配制酰肼基取代度为32％的hahz和醛基取代度为80％的pfah的聚合物溶液，加入干细胞，充分混合，室温下静置交联形成凝胶。
实施例1-7-12
分别精确配制酰肼基取代度为6％的hahz和醛基取代度为20％的pfah的聚合物溶液，加入生物因子，充分混合，室温下静置交联形成凝胶。
实施例8
将实施例6中的混合液300ul加至流变仪测试平台上，于37℃,1hz,10％的应力下测试凝胶的强度随时间的变化。
结果参见图1，图1是实施例8所述的hahz/pfah双交联杂化水凝胶的凝胶强度随时间的变化。如图1所示，储能模量g’和损耗模量g”的交叉点即为凝胶点，凝胶能在5分钟内形成，有利于原位形成凝胶，即说明次凝胶具有原位成型的特性。随着时间的增加，凝胶的强度显著增加，90min时凝胶强度达到1100pa,表明该水凝胶具有优良的力学强度，可以作为皮肤敷料提供力学支撑。
实施例9
将实施例6中的混合液300ul加入到直径为1cm的聚四氟乙烯模具中，静置交联西郭城凝胶，待凝胶形成后将其取出，任意分成三份，再将凝胶放入模具中，30min后取出观察并拉伸。
结果参见如2，图2为实施例9所述的hahz/pfah双交联杂化水凝胶在无外界刺激下的愈合及拉伸图片。如图2所示，凝胶被任意分成三分再放入模具，待30min后取出，凝胶能够完全愈合为一个整体，枪头也不能将其分开，能够轻易的将凝胶整体悬起而不坠落，表明凝胶优良的愈合性能。更进一步的，将愈合后的凝胶拉伸，凝胶不碎裂并且可以拉伸，表明凝胶具有优良的自愈合性能和拉伸性能，良好的机械性能有利于凝胶的实际应用。
实施例10
建立深二度烧伤模型，随机分为实验组和对照组，对照组仅用纱布覆盖，实验组用实施例6所述的凝胶治疗。在7天，14天，21天，分别11取创面部分的皮肤进行h&e染色，进行病理学分析。
结果参见图3，图3为实施例10所述的烧伤修复21天时的皮肤病理学h&e染色分析(左边：对照组，右边：实验组)。如图3所示，实验组和对照组相比：实验组的瘢痕区域较对照组的瘢痕区域范围明显减小，炎症细胞浸润较对照组明显减少，胶原结构形态接近正常，实验组21d时虽有部分区域少量炎症细胞浸润，但有清晰的皮肤三层结构且真皮层均有皮肤附属结构存在；而对照组21d时有大量炎症细胞浸润，并且有明显的皮肤溃疡(ulcer)出现且表皮增厚。因此，动物皮肤烧伤实验结果表明材料对皮肤组织修复具有明显效果。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。