本申请要求2011年6月30日提交的突尼斯临时申请No.TN2011/327的权益，将其内容并入本文作为参考。
发明背景
1、技术领域
本发明涉及[60]富勒烯，和包含溶解于载体中的[60]富勒烯的稳定的生物相容性组合物。本发明还涉及用于提高哺乳动物预期寿命(长寿)的方法，该方法包括给药[60]富勒烯或含有治疗有效量的[60]富勒烯的组合物的步骤。本发明还涉及用于防止哺乳动物免受自由基引起的损害的方法，所述方法使用所述[60]富勒烯或所述组合物。
2、相关技术的描述
自由基，如氧自由基，和其他活性氧物质/氮/氯物质(羟基，一氧化氮自由基)，都在不断在体内形成。一些这些分子在生理上是有益的，但它们也可导致对细胞和组织的病理氧化应激。内源性防御包括抗氧化剂和修复系统。然而，自由基的过量产生，自由基不合适的相对量的产生或内源性防御缺陷可产生有害的影响。自由基可引起对脂类，DNA，生物分子的氧化损伤，升高细胞内钙的浓度，以及激活蛋白酶，核酸酶和蛋白激酶。相当多的证据支持如下观点：涉及自由基的氧化损伤发生在多数人类疾病中，可能不是全部疾病。目前公认，氧化应激是人类许多疾病发展的重要原因，所述疾病包括肝纤维化，缺血再灌注，动脉粥样硬化，神经退行性疾病和与年龄有关的癌症以及衰老过程。因此，需要抗氧化剂和能够对抗氧化应激的保护系统以保持健康。大量科学证据支持，氧化应激直接导致老化(Aging Cell 2009，8(3):258-69)和一系列神经病理学疾病(Nutrition 2010年，26:595-603。Neurochem Res 2007，32:757-73)。衰老的自由基理论认为，生物是无法修复所有损伤，而且，随着时间的推移，未修复的损伤累积，并使生物处于风险：换句话说，自由基引发衰老和死亡(FEBS Letters 2009年，498：183-186。J.Neurochem.2009，108:1251-65)。抗氧化剂是能够与自由基反应，保护机体免受这些分子(Ital J Biochem.2006，55:263-282)损害的物质。特别是，消耗过量的一些是抗氧化剂丰富来源的食物，被认为是促进健康长寿。现在人们认为，身体内氧化还原平衡的保持可以防止衰老，促进健康长寿。
由于它的30个碳双键，[60]富勒烯(Buckminsterfullerene，C60)是功能强大的自由基清除剂，其具有自由基海绵的特征(Science 1991年，254，1183-1185)。富勒烯及其衍生物的生物学应用，特别是作为抗氧化剂，已被广泛地综述(Bioorg.Med.Chem.1996，4：767-779。Eur.J.Med.Chem.2003，38：913-923。Biomedicine&Pharmacotherapy，2005，59：351-358)。C60仅能溶于数量有限的有机溶剂，如甲苯，苯，氯萘和二氯苯。水不溶性的C60和其衍生物的生物相容性的水溶液的获得已是主要在这个新的化合物家族的毒性和体内研究障碍。水不溶性富勒烯的生物学特性仍然遭到误解，据我们所知，没有认证他们的毒理学数据。研究的大部分富勒烯，直至现在仍然是水溶性的衍生物，由于在生物介质中的水不溶性的富勒烯例如最初的C60的研究被证明是困难的。常见的做法是，采用取代基如OH，COOH，NH2衍生化富勒烯芯，以增加亲水性(Bioorg.Med.Chem.1996，4：767-779。Eur.J.Med.Chem.2003，38：913-923Biomedicine&Pharmacotherapy，2005，59：351-358)。水溶性的C60衍生物已被发现保留在它们的富勒烯母分子的体外清除自由基性质，使这些特性在生物系统中被利用。已经存在许多针对以下的专利：水溶性富勒烯的范围广泛生物医学应用和其它商业应用，包括抗癌和抗HIV疗法，神经变性疾病药物，药物递送系统，和延缓衰老制剂。特别是，提出了一组亲水性的C60衍生物，羧基富勒烯，以增加后生动物的寿命(美国专利申请2003/0162837)。然而，水溶性富勒烯难以合成和纯化。此外，相对于无毒的最初的C60，某些C60衍生物可以是剧毒的(Adv Exp Med Biol，2007，620，168-80)。
最初的C60已经被证明是一种比Wang，I.等人，J.Med.Chem.1999，42，4614-4620中的一定羧基富勒烯更有效的抗氧化剂。然而，在该出版物中，C60曾不被用作有效成分以开发的体内的治疗方法。C60的含水悬浮液是本领域公知的。他们是长时间稳定的，并且可以被递送到细胞中。14C标记的C60的一项研究报道了，有可能形成在水中长期稳定的C60的悬浮液(J.Am.Chem.Soc.，1994，116，4517-4518)。然而，作者没有检测到细胞内的富勒烯，这些含有非常低浓度富勒烯的悬浮液(通常为每ml0.1mg)不足以执行体内研究，特别是毒性研究和代谢性质调查((J.Am.Chem.Soc.1994，116，4517-4518)。其他向量化方法包括采用环糊精，杯芳烃，吐温20，胶束，脂质体和小泡形成包合络合物；但是本通过这样的方法达到的C60浓度仍然很低(至多1mg/ml)，不足以进行体内毒性研究，另外，这些方法具有另一个缺点，因为它们通常必需进行将富勒烯在有机溶剂中初步溶解的步骤。其他的研究提出了，使用悬浮在水介质中的C60纳米颗粒，以形成所谓nC60的胶体溶液，但是这样的解决方案被证明是高度有毒的，因为它们包含与它们制备过程中使用的溶剂的氧化副产物相关的杂质(Adv Exp Med Biol，2007，620，168-80。Journal of Nanoscience Letters 2011，1：62-63)。在J.Med.Chem.2000，43，3186-3188披露的另一个方法，采用聚乙烯吡咯烷酮溶解C60，但是该溶媒可以与富勒烯反应，所形成的复合物可引起对小鼠胚胎有害的影响。
Moussa等人在Fullerene Science&Technology 1995，3，333-342说明，部分地微粉化的C60颗粒可以掺入活的人体巨噬细胞。C60是直接悬浮于培养基中，并没有表现出急性毒性。Moussa等在Fullerene Science&Technology 1996，4，21-29中还描述，水不溶性富勒烯微粉化粒子可以采用生物相容性水悬浮液形式给药至小鼠，所述悬浮液含有表面活性剂(吐温80)的形式和悬浮剂(羧甲基纤维素)，所述悬浮剂可以稳定悬浮液。作者披露，C60是无毒的，可以穿过细胞膜并积聚在肝，脾(Fullerene Science&Technology 1996，4：21-29)。由F.Moussa为首的相同小组已经使用微粉C60悬浮液作为在体内的自由基清除剂(Nano Letters 2005，5：2578-2585)。然而，有效剂量是非常高的(即>1g/kg体重)，腹膜内(ip)给药是给予这种悬浮液的唯一途径。该作者还公开，C60可以在脂滴内进行体内溶解(Nano Letters 2005，5：2578-2585)。这一结果已经被其他作者在体外证实，该作者在植物油中研究C60的溶解度(Fullerenes，Nanotubes，and Carbon Nanostructures，2007，15：311-314 Fullerenes，Nanotubes，and Carbon Nanostructures，2007，15：331-339)。N Gharbi和F Moussa已经提出了包含分散和/或溶解在载体中的水不溶性富勒烯的稳定的生物相容性组合物以用于防止自由基引起的损害，所述载体选自脂肪和油，所述载体的含量范围相对于所述组合物总重量为0.2～10重量％，优选为0.1～2重量％(2005，国际申请PCT/EP2005/004963)。然而，在这种组合物中，水不溶性富勒烯未完全溶解，它们的口服吸收性是未知的。进而，所给药的富勒烯的大的聚集体可被肝脏和脾脏过滤，并限制在肝脏和脾脏网状内皮系统(RES)中，从而改变C60在全身的扩散和生物分布。因此，在体内使用的水不溶性富勒烯仍然是不能令人满意的，因为通过递送的自由基清除剂得益于非水载体。
现在，本发明人发现，[60]富勒烯作为试剂的一个令人惊讶的用途，所述试剂用于促进增加哺乳动物的预期寿命的总长度。
在2011年6月30日公布的Moussa等的TN专利No.TN 2011/327中，公开了包含[60]富勒烯的组合物及其预防哺乳动物(metazons)由自由基造成的损害的用途，将Moussa等全文并入本文中以作参考。
技术实现要素：
针对上述的问题，开发了本发明。本发明的主要目的是提供用于延长哺乳动物的寿命的方法或过程，该方法或过程包括给药所述哺乳动物包含有效量[60]富勒烯的组合物的步骤，它避免了现有技术过程的缺点，特别是：1、避免了使用电荷转移络合物，2、避免了使用有机溶剂，和3、避免被给予的富勒烯的原位聚集。本发明人现已发现，含有溶解在合适的载体中的[60]富勒烯的组合物被证明适合于实现上述目的，所述载体选自油和脂肪。特别是，他们不仅允许[60]富勒烯可口服或肌注或腹膜内给予以延长哺乳动物的寿命，而且它们的活性比以前的组合物高至少几倍。因此，本发明的第一实施方案包括稳定的生物相容性组合物，其包含(a)选自脂肪和油的载体，和(b)[60]富勒烯，其中，[60]富勒烯几乎全部溶解在所述载体中。本实施方案进一步涉及组合物，其中[60]富勒烯溶解在载体中。本发明的另一种实施方案是延长哺乳动物寿命的方法，该方法包括向所述哺乳动物给予稳定的生物相容性的组合物的步骤，所述组合物包含有效量的溶解在选自脂肪和油的载体中的[60]富勒烯。在优选的实施方案中，本发明涉及延长哺乳动物的寿命的方法，该方法包括将稳定的组合物添加到食品或任何营养组合物中的步骤，所述稳定的组合物包含有效量的分散在选自脂肪和油的载体中的[60]富勒烯。
根据下文的详细描述，本发明的其它目的，特征和优点将是显而易见的。然而，应当理解，仅通过示例的方式给出详细描述和具体实施例，同时指示本发明的具体实施方案，因为，根据所述详细描述，在本发明精神和范围内的各种改变和修改将是本领域技术人员显而易见的。
附图说明
根据下文详细描述，当将其与附图结合考虑时，本发明的前述和其它目的，特征和优点对本领域技术人员来说是容易明白的，在所述附图中：
-图1表示作为时间函数的大鼠的生长率，所述大鼠采用本发明组合物治疗或不采用本发明组合物治疗。
-图2显示单剂量经口给予(4mg/kg，n＝3)或单剂量腹膜内(ip)推注相同剂量(n＝3)的溶于橄榄油的C60(0.8mg/ml)(n＝3)之后的全血C60浓度-时间曲线(平均值±S.E.M.)。
图3和图4显示给药CCl4前C60预治疗的大鼠和对照大鼠的一些生化检查结果。
图5表示采用C60经口治疗的10月龄大鼠的存活率(每组n＝6)(1ml/kg体重，每周1次，直到第2个月结束，然后每两周1次，直到第7个月结束，采用水，橄榄油或溶解于橄榄油的C60(0.8mg/ml))。
表1总结了经口给予(n＝3)或腹膜(n＝3)给予溶解于橄榄油的C60后在大鼠中获得的平均药代动力学参数。
表2总结了每天用单剂量的溶于橄榄油的C60(4mg/kg体重)经口(n＝3)或经腹膜(n＝3)治疗大鼠的全血(WB)、肝、脾、脑中的C60浓度。
具体实施方式
自由基是不断在体内形成。一些这些分子在生理上有益的，但它们也可导致对细胞和组织的病理氧化应激。内源性防御包括抗氧化剂和修复系统。然而，自由基的过量产生，自由基不合适的相对量的产生或内源性防御缺陷可产生有害的影响。自由基可引起对脂类，DNA，生物分子的氧化损伤，升高细胞内钙的浓度，以及激活蛋白酶，核酸酶和蛋白激酶。相当多的证据支持以下观点，涉及自由基的氧化损伤发生在多数人类疾病中，可能不是全部疾病。目前公认，氧化应激是人类许多疾病发展的重要原因，所述疾病包括肝纤维化，缺血再灌注，动脉粥样硬化，神经退行性疾病和与年龄有关的癌症以及衰老过程。因此，需要能够提供保护以免受抗氧化应激的抗氧化剂和系统以在哺乳动物中保持健康，延长预期寿命。这导致了尝试开发作为潜在治疗剂的附加用于补充细胞抗氧化防御系统的抗氧化剂。饮食衍生的抗氧化剂和一些可以清除自由基的小分子，以及超氧化物歧化酶模拟物和过渡金属离子的螯合剂被提议作为抗氧化应激的潜在治疗剂。根据本发明的含有[60]富勒烯的组合物已被发现呈现体内高效抗氧化性能。在本发明的实施中使用的富勒烯芯，即，无侧链取代基的富勒烯骨架，包括一般是球形的簇形炭结构，并具有60个碳原子的碳含量。通常情况下，本发明的[60]富勒烯的存在量相对于所述组合物总重量为0.01至0.08重量％，优选为0.08重量％。[60]富勒烯优选溶解在载体中，即该组合物可以通过0.2μm过滤器进行过滤。根据本发明的稳定的生物相容性的组合物包含选自脂肪和油的载体和[60]富勒烯，其中所述富勒烯几乎全部溶解于所述载体中。在本发明中使用的载体是药学上可接受的和生物相容性的载体，选自脂肪和油。所述脂肪或油可以是任何天然或合成的适合给药于哺乳动物的脂肪或油。它们没有特别的限制，只要它们是可以在药物制剂或食品中使用的成分即可。油和脂肪可以被氢化或部分氢化。它们以固体，半固体或液体状态被使用。植物和动物脂肪和油是优选的，植物脂肪和油是最优选的。油和脂肪包括但不限于脂肪酸酯，脂肪酸，脂肪醇和脂肪醇酯。合成的脂类也可使用。脂肪酸，如本文所定义，是指具有链4至40个碳原子的脂肪族一元羧酸，它可以是支链或无支链的，饱和或不饱和的，环状或无环的。脂肪酸可以是天然的或合成的，多不饱和的，单不饱和的或饱和的。优选的是，通常是无支链和C4-C28的偶数的天然脂肪酸。脂肪酸的实例包括但不限于，亚油酸，花生四烯酸，亚麻酸，γ-亚麻酸，辛酸，硬脂酸，肉豆蔻酸，棕榈酸，山萮酸，十一碳烯酸，油酸，二十二碳六烯酸(DHA)，二十碳五烯酸(EPA)，异硬脂酸，12-羟基硬脂酸。也可以采用它们的盐[例如碱金属盐(钠盐，钾盐等)，碱土金属盐(钙，镁的盐等)]。脂肪酸酯优选是如上述定义的脂肪酸与C1-C40脂族或芳族醇的酯，优选脂肪族的，饱和或不饱和的，直链或支链的，环状的或无环的。醇可以是多元醇，优选具有最多5个羟基。脂肪酸酯的例子包括但不限于，甘油三酯(即甘油与上文引用的脂肪酸形成的三酯)，甾族化合物(即甾醇与上文引用的脂肪酸形成的酯)，上文引用的脂肪酸的低级烷基酯(最优选是甲基，丙基，丁基，异丙基和己基)，1,2-或1,3-甘油二酯，1-或2-甘油单酯，聚乙二醇化的甘油酯，例如蔗糖脂肪酸酯，聚甘油脂肪酸酯，丙二醇脂肪酸酯等。脂肪酸酯的具体实例是山嵛酸辛基十二烷基酯；山嵛酸异鲸蜡酯，乳酸异十六烷基酯；乳酸异十八烷酯；乳酸亚油酯；乳酸油酯，辛酸异硬脂醇酯，辛酸异鲸蜡酯，油酸癸酯，异硬脂酸异鲸蜡酯，月桂酸异鲸蜡醇酯；硬脂酸异鲸蜡醇酯；辛酸异癸酯；油酸异癸酯；异壬酸异壬酯，棕榈酸异硬脂基酯，异硬脂酸十四烷基酯，异辛酸壬基酯，异壬酸2-乙基己酯，硬脂酸异辛酯；芥酸辛基十二烷基酯；棕榈酸异丙基酯，棕榈酸2-乙基己基酯，棕榈酸2-辛基癸基酯，肉豆蔻酸支链烷基酯，如肉豆蔻酸异丙酯，肉豆蔻酸叔丁基酯，肉豆蔻酸2-辛基十二烷基酯，异硬脂酸己基酯，异硬脂酸丁酯，异硬脂酸异丁酯，月桂酸己酯，桂酸2-己基癸基月酯，丙二醇单硬脂酸酯和二硬脂酸酯。甘油酯(脂肪酸酯)的例子包括但不限于，三油精，三亚油精，三棕榈酸甘油酯，三硬脂酸甘油酯，三肉豆蔻酸甘油酯，和二十碳四烯酸甘油三酯。甾族化合物(脂肪酸酯)的例子包括但不限于，油酸胆甾醇酯，油酸胆甾醇亚酯，肉豆蔻酸胆甾醇酯，棕榈酸胆甾醇酯，花生酸胆甾醇酯。脂肪醇的例子包括但不限于，鲸蜡醇，硬脂醇，月桂醇，肉豆蔻醇，棕榈醇，山嵛醇，十六醇，油醇，异硬脂醇，十八醇十六醇混合物。它们可以以C4-C40二羧酸，三羧酸或四羧酸形成的酯的形式使用。油可以是天然油，如植物油和动物油(主要是由甘油三酯组成)，或矿物油，如硅油，氟油(fluorinated oil)。也可以使用液体石蜡。天然油的例子包括但不限于，从植物来源的油，如玉米油，小麦胚芽油，大豆油，米糠油，菜籽油，介花油，芝麻油，棕榈油(核)油，橄榄油，山茶油，花生油，椰子油，葵花籽油，花生油，橙油，月见草油，琉璃苣油，黑醋栗籽油，棉籽油，海狸油，菠萝油，红花油，椰子油，咖啡中发现的油，和动物油，如海龟油，鱼油，鳕鱼肝油。脂肪可以是矿脂或天然脂肪，如植物脂肪和动物脂肪。也可以使用凡士林，石蜡。天然油脂的实例包括但不限于，黄油，可可脂，可可(属)(Theobroma)，花生酱，猪油，牛脂，鸡脂肪，马脂，羊毛脂和羊毛脂衍生物。油和脂肪，可以是多不饱和的，如玉米油，大豆油，红花油，或饱和的，如棕榈油，椰子油和黄油，或单不饱和的，例如橄榄油和菜籽油。根据本发明的其它合适的载体是癸二酸二异丙酯；己二酸二异丙酯；己二酸二异硬脂醇酯；辛基十二烷基硬脂酰硬脂酸酯；四异壬酸季戊四醇酯；四异硬脂酸季戊四醇酯；柠檬酸三异丙酯；柠檬酸三异硬脂基酯；和柠檬酸三辛基十二烷基酯。根据本发明的优选的载体是黄油，可可脂，花生酱，橄榄油，大豆油，鳕鱼肝油和液体石蜡。如上所定义，可以单独使用载体，或将载体与两种或更多种的载体组合使用。[60]富勒烯溶解于载体，这取决于载体的性质。某些载体能够溶解大量的水不溶性富勒烯(几mg/克载体)。在一种实施方案中，至少0.8mg富勒烯溶解于每ml载体(该载体为液体)。作为一个例子，在不到一周的时间内，每克橄榄油或豆油能够溶解的总重量至多1mg的C60。根据本发明的组合物可以是包含治疗有效量的富勒烯类的药物组合物。优选地，所述富勒烯可以提供保护以对抗生物活性自由基物质(biologically reactive radical species)，生物活性自由基物质意指是自由基或促进自由基产的生化学品。通常，从O2或H2O2产生生物活性自由基物质。因此，本发明还涉及延长哺乳动物的寿命的方法，该方法包括给药所述哺乳动物如上文所定义的稳定生物相容性组合物的步骤。[60]富勒烯，当溶解在本发明的载体时，可以给药到哺乳动物，并且该化合物很好地由所述哺乳动物吸收。一般地，所述富勒烯以至少0.1mg/kg体重每天的量给药。根据本发明的方法，本发明组合物可以经口给予，肌内给药，皮下给药，经皮内或腹膜内给予，以栓剂直肠给药或舌下给药。对于被治疗哺乳动物的经口摄入，载体优选是可食用的载体。在至少一种实施方式中，所述组合物以纯的形式被给药。在另一种实施方案中，以在水中的乳剂的形式给药所述组合物。在另一种实施方案中，富勒烯是作为不稳定的C60衍生物被给药，所述衍生物在被给药后可递送C60。本发明的组合物可以是任何液体或固体的常规的药物制剂。该载体能够使富勒烯被配制成片剂，丸剂，锭剂，胶囊，脂质体，润发油，软膏剂，乳膏剂，洗剂，乳剂，凝胶剂，糖浆剂，浆液等。本发明的组合物优选呈现为经口给药于哺乳动物的单位剂量形式，如片剂，胶囊，和口服溶液剂，其含有适当的量的[60]富勒烯。该组合物可以被灭菌和/或可以包含一些佐剂，如防腐剂，稳定剂，酸度调节剂，天然或合成香料，防沫剂，粘度控制剂，乳化剂，用于改变渗透压的盐，和/或其它缓冲液。此外，组合物可含有其它药物活性剂。与活性氧物质在未接触本发明组合物的细胞中的水平相比，治疗后，自由基和活性氧物质(reactive oxygen species)在哺乳动物细胞中的水平降低。的确，根据本发明的[60]富勒烯可以作为抗氧化剂，和补充细胞的抗氧化防御系统。这意味着它们抑制氧化或抑制活性氧物质促进的反应。生理学相关的活性氧物质(其产生自由基)包括过氧化氢，超氧化物阴离子等。本发明的保护方法减少细胞损伤和死亡，并因此一般维持受治疗的哺乳类动物的健康。进一步，本发明人发现，以如本文所述的生物相容性组合物的形式给予的[60]富勒烯：1)可在经口给予(图2)后被吸收；2)它们可以在肝脏内遵循狄尔斯-阿尔德样反应(Diels-Alder-like reaction)，与维生素A(视黄醇)及其酯类发生反应，无任何毒性作用(New J Chem，1998，989-992)；3)，它们通过胆管(Nano Letters 2005，5(12)：2578-2585)被清除；以及4)尽管大量被给药，在小鼠和大鼠中没有观察到急性或亚急性毒性。在治疗的动物中没有观察到行为或生长障碍(参见图1)。图1显示三组(n＝6)大鼠的生长率，所述大鼠每周一次经口获得1ml含有0.8mg C60的橄榄油或仅1ml橄榄油或仅1ml水。导致[60]富勒烯的体内新特性的原因是在施用后肝脏内形成的富勒烯本身和/或富勒烯-视黄醇及富勒烯-视黄基酯的加合物。本文还公开了制备本发明组合物的方法，所述组合物包含载体和[60]富勒烯颗粒。所述方法包括以下步骤：-(a)将富勒烯，载体和球填充入研磨容器中，所述研磨容器和球是由任何生物相容性的金属或聚合物制成；-(b)搅拌从步骤(a)得到的混合物，直至得到均相溶液，和-(c)通过过滤将从步骤(b)得到的组合物灭菌。载体中直接的机械研磨显示出促进溶解的优势。所述方法包括以下步骤：-(a)将富勒烯，脂肪或油和球填充入研磨容器中，所述研磨容器和球由任何生物相容性的金属或聚合物制成；-(b)搅拌从步骤(a)所得的混合物，直至溶液完全均化；-(c)搅拌从步骤(b)得到的所述组合物直到富勒烯全部溶解；和-(d)通过过滤灭菌从步骤(c)得到的组合物。除了在操作实施例中，或另有说明，在本说明书和权利要求书中表示成分，反应条件等的数量的所有数字在所有情况下都应当理解为被术语“约”修饰。因此，除非有相反的指示，在下文的说明书和所附的权利要求中列出的数字参数是近似值，其根据通过本发明试图获得的所需的性能可能会发生变化。至少应用，并且不试图限制应用权利要求范围等价物的原则，每个数字参数应该被解释为有效数字和普通舍入近似值的数字。尽管数值范围和参数提出了宽范围的公开内容是近似值，但是在具体实施例中的数值被尽可能准确地报道。任何数值，但是，固有地包含一定的误差，所述误差是它们各自的试验测量中发现的标准偏差必然产生的。本发明是通过下述实施例进一步说明。这些例子是为了本说明并且不应当被解释为限制本发明的范围。
实施例
一般操作
C60(纯度：99.98％)购自Term USA(加利福尼亚州，布拉格堡(Fort Bragg，CA)美国)。其性质和纯度经HPLC、UV、C-NMR和质谱法进行评估。没有观察到杂质。它无需进一步纯化和升华之后使用。所有其他试剂均为分析级，购自Sigma(圣路易斯，密苏里州(St Louis，MO))。动物接受人员护理，研究方案遵守实验动物的护理和使用的一般准则。雄性Wistar大鼠(Charles River，法国)均在恒定温度(22℃)和湿度(60％)，以3只为一组圈养在3个聚丙烯笼子中，并采用12h光照/黑暗周期，以标准饲料自由饲喂。在实验中使用之前，使所有大鼠适应该设施至少一周。在实验结束时，确定体重，通过用戊巴比妥钠(1.0ml/kg体重)麻醉后，通过胸主动脉出血，在相同条件下，处死动物。
如之前在Nano Letters 2005，5(12)：2578-2585中所述的，进行生化试验、C60测定和统计数据。
实施例1：在植物油中直接溶解[60]富勒烯
在Pulverisette 7(Fritsch，Idar-Oberstein，德国)或类似装置的不锈钢研磨容器中，加入8mg[60]富勒烯和10ml橄榄油或10g黄油和6个不锈钢球(直径为8mm)(研磨容器和球可以由任何生物相容性的金属或聚合物(如不锈钢，钢化铬钢，氮化硅，金刚砂，碳化钨，玛瑙，锆氧化物等)制成)。(采用例如600rpm)搅拌该混合物几个小时，直至全部溶解。由此产生均匀的溶液或膏状物，然后可用于在适当消毒后经口给予或通过任何途径给药。灭菌可以通过真空过滤(孔径0.2μm)来实现。灭菌组合物稳定至少1个月。另外，在不搅拌的情况下，也可以将水不溶性富勒烯溶解在天然或矿物油中，然而溶解可能是耗时(在室温下最多几天)。因此，优选前者的方案。如先前所述(J.Chromatogr.B 1997，696：153-159)，本发明组合物中的富勒烯浓度可以在流动相中适当稀释后，通过HPLC来确定。
实施例2：在大鼠中经口给予和腹膜内给予后的油性溶液的药代动力学和生物分布。
用雄性Wistar大鼠(体重200-220g)，研究了药代动力学。大鼠饲养在单独的笼子中，并保持在空调房间(22-25℃)，采用12h光照/黑暗循环，提供水和食物。将大鼠驯化7天，在治疗前，使大鼠禁食过夜，但可以获得水。
在全身麻醉下，将导管引入到大鼠右颈静脉，皮下放置，使尖端在肩胛间区中。然后使所制备的大鼠恢复24小时，血液导管用含有肝素的20IU/ml的0.9％NaCl溶液冲洗，以避免可能的凝块阻塞。给药C60前，将大鼠禁食过夜，但可以获得水。同一单剂量的C60(4mg/kg)通过灌胃针经口递送，或腹膜内递送至两个组的大鼠，每组3只大鼠。在给药前(t＝0)，和在给药后15，30，60分钟，然后在给药后2，4，8，10，12，24和48小时经插管取血(0.20ml)。将抗凝血酶的肝素(20IU/ml)加入每个血样中。各采血后，将0.20ml的无菌0.9％NaCl溶液注射到动物中，以避免血容量不足。给药C60后48小时处死大鼠，以采集器官(肝脏，脾脏和大脑)。
现在，本发明人发现：-1)在腹膜内或经口给予后，可溶性C60被吸收和消除。表1表示主要药动学参数；-2)腹膜内与经口给予后4小时和8小时分别达到最大浓度(Cmax)(图2)；-3)腹膜内给予后的最大浓度(1.47±0.15μg/ml)高于经口给予后的最大浓度(0.52±0.16μg/ml)。因此，与经口给予途径相比，当由腹膜内途径给予C60时，曲线(AUC)下面积增大约5倍。虽然这些结果不能确定C60的生物利用度，但是，它们清楚地表明，与腹膜内给药剂量相比，不可忽略的百分比(％)的经口给予剂量被吸收(图2)；以及-3)富勒烯很好地分布于全身，特别是它可以穿越血脑屏障(表2)。
实施例3：在大鼠中C60针对四氯化碳(CCl4)的急性毒性所产生的对肝的保护
四氯化碳是典型的肝毒物，导致迅速的肝损害进展，从皮脂腺病到小叶中心坏死。啮齿类动物CCl4中毒是阐明肝毒性影响(如脂肪变性，纤维化，肝细胞死亡和致癌性)作用机制的重要模型。这些影响与以下一致：已知CCl4诱导代谢活化为反应性中间体，包括CCl3”和CClO2’自由基，和细胞内钙的转移。Kupffer细胞(肝定居巨噬细胞)通过释放中性粒细胞趋化因子和一系列化学介质(细胞因子)，参与CCl4的体内毒性机制。这些细胞因子的表达和合成主要通过氧化还原敏感性反应调节。另外，活性氧物质和抗脂质过氧化产物的参与可以在肝纤维形成(fibrogenosis)的其它基本事件中被证明，例如肝星状细胞(HSC：肝定居非实质细胞也被称为脂肪储存细胞或窦周细胞，脂肪细胞和Ito细胞)的活化。在以前的工作中，报道了C60-预治疗对大鼠急性四氯化碳中毒的结果，所述大鼠是研究自由基介导的肝损伤的经典模型。以F Moussa为首的作者得到的结果(Nano Letters 2005，5(12)，2578-2585)表明，含水C60悬浮液在啮齿类动物中不仅没有急性或亚急性毒性，而且它们也以剂量依赖的方式保护它们的肝脏以对抗自由基损害。在后者的文章中报道：C60腹膜内给予的最有效剂量是约2.5g/kg体重，在给药后第14天获得更好的保护，现在，本发明人发现，与富勒烯以悬浮液形式给药相比，富勒烯以溶液形式给药时富勒烯的活性增加大约100倍，与采用相同实验模型(Nano Letters 2005，5：2578-2585)的以前发表的结果相比，效果更迅速(给药后24小时)。
实施例4：C60延长大鼠的寿命且无慢性毒性
每笼饲养1只大鼠，给药前驯化14天。三组大鼠，每组10只大鼠(10月龄，体重495±31g)，每天给药1次，持续1周，然后每周1次，直到第2个月结束，然后每两周给药1次，直到第7个月结束，分别用1ml水或橄榄油或溶解于橄榄油的C60(0.8mg/ml)通过管饲法给药。每次给药前称重大鼠。按照官方建议(2004年4月29日的EC委员会指令2004/73/EC，其适应于第29届理事会指令67/548/EEC的技术进展对法律，法规和管理规定的接近(Approximation)，其与危险物品分类、包装和标签O.J.No.L1522004相关)，对在笼子里面和外面的所有动物，针对违反正常活动的迹象、发病率和死亡率在整个研究过程中，进行每天一次例行观察。
观察到C60通过经口给予被吸收后，启动本实验。研究给药C60的慢性毒性，我们根据美国食品和药物管理局一般准则设计方案(采用啮齿类动物在食品成分安全性评价的毒理学原理方面的慢性毒性研究，红皮书，2000，2007年7月修订，第四章，C.5.a.)，进行了某些修改。现在，本发明人发现，C60的经口给药显著增加大鼠的寿命(图5)。在治疗开始后的第25个月，采用水、橄榄油或溶解在橄榄油中的C60治疗的大鼠存活率(％)分别等于25％，67％和100％(图5)。在治疗开始后的第37个月，该存活率百分比的情况如下：用溶解在橄榄油中的C60治疗的大鼠存活率百分比始终等于100％，用橄榄油治疗的大鼠存活率百分比为17％，用水治疗的大鼠存活率百分比为0％(图5)。据知，对于本申请所报道的预期寿命的增加，从未对任何其他物质有过这样的报道。