本发明涉及多囊卵巢综合症治疗领域，尤其是一种茯苓酸或茯苓酸衍生物用于制备治疗多囊卵巢综合症药物的应用及药物制剂。
背景技术：
多囊卵巢综合征(polyeystie ovary syndrome,PCOS)又称Stein-leventhal综合征,是育龄妇女较常见的内分泌综合征，是由多基因、多遗传因素和多环境等因素引起的下丘脑-垂体-卵巢功能轴的紊乱、月经失调(月经稀发或闭经)、持续无排卵、不孕、胰岛素抵抗、高胰岛素血症、卵巢多囊性改变和高雄激素血症为特征的异质性疾病。大多数研究人员通过大量临床数据认为本病的主要发病原因是饮食、遗传、精神及环境等因素，而其主要的发病机制是下丘脑-垂体-卵巢轴功能失调、高雄激素血症、肾上腺内分泌功能失调、胰岛素抵抗等,也有研究表明其与促炎因子、肿瘤坏死因子、胰岛素样生长因子、脂联素、抗苗勒激素、瘦素等细胞因子有关。
多囊卵巢综合症的发病机制极其复杂，下丘脑垂体卵巢轴(hypothalamus-pituitary-ovarianaxis，HPO)紊乱、卵巢功能异常、肾上腺皮质功能异常、慢性炎症以及胰岛素抵抗都对卵巢的发病产生影响。
目前针对PCOS治疗方案包括三种：控制体重、药物治疗、手术治疗。首先，对肥胖型PCOS患者，要求控制饮食和增加运动，从而降低体重和缩小腰围，这样可增加胰岛素敏感性，降低睾酮、胰岛素水平，最终恢复其排卵及生育能力。药物治疗包括适当服用药物改善和调节月经周期，定期合理服用药物，比如口服避孕药；除此之外，也可通过降低血雄激素水平，如口服地塞米松，服用环内孕酮或者螺内酯与避孕药联用，效果会更好。其次，对于肥胖或者伴有胰岛素抵抗患者可通过服用胰岛素增敏剂，如二甲双胍以改善卵巢排卵功能；对于有生育要求的患者，可通过服用促排卵药物来进行调整。最后，针对药物保守治疗无效的无排卵多囊卵巢综合征患者，最后可采取手术疗法，通过手术刺激卵巢，卵巢激素水平会迅速回落，进而刺激下丘脑，从而使垂体分泌正常水平的促性腺激素。
然而，目前没有一种有效的治疗方法，手术治疗对身体损害很大，药物治疗会出现明显的副作用，并诱发其他疾病的产生。
尽管多囊卵巢综合征是一种妇科疾病，也同时会增加糖尿病，心脏病，高血压和子宫内膜癌的发病率。因此，现在很难提供适当的PCOS一线治疗。二甲双胍作为一种胰岛素敏化药物，被广泛用作PCOS治疗的一线药物。然而，二甲双胍的长期临床应用可导致腹泻、胃肠不适等副作用。因此，长期应用药物二甲双胍治疗PCOS可能并不适合，寻找PCOS更合适的治疗药物(改善患者卵巢功能从而提高卵母细胞质量)对解决这个困境具有重要意义。
茯苓酸，3-8-乙酰氧基-16-α-羟基-羊毛甾烷-8，24(31)-二烯-21-酸，白色粉末，是一种天然存在于灵芝、茯苓等中草药中的三萜类化合物，目前可以通过菌种培养或者中药提取方式获得纯样。据文献报道，茯苓酸对肺癌、胰腺癌、结肠癌、前列腺癌、乳腺癌等肿瘤细胞的侵袭和增殖都有着显著抑制作用。在茯苓的临床应用过程中未观察到明显的副作用。
技术实现要素：
本发明的目的是为了克服现有的多囊卵巢综合症治疗药物副作用大、治疗效果不佳的问题，提供一种茯苓酸或茯苓酸衍生物用于制备治疗多囊卵巢综合症药物的应用及药物制剂。
具体方案如下：
一种茯苓酸或茯苓酸衍生物用于制备治疗多囊卵巢综合症药物的应用。
进一步的，所述的茯苓酸或茯苓酸衍生物用于制备治疗多囊卵巢综合症药物的应用包括抑制体重增加，改善糖耐量异常，改善激素紊乱、高血脂症和慢性炎症，抑制炎症，缓解胰岛素抵抗，抑制颗粒细胞的损伤，抑制卵母细胞氧化及凋亡中至少一种。
进一步的，所述茯苓酸的衍生物包括茯苓酸盐、茯苓酸水合物、茯苓酸溶剂化物、茯苓酸共晶化合物中的任意一种。
本发明还保护一种治疗多囊卵巢综合症的药物制剂，包含茯苓酸或者茯苓酸的衍生物。
进一步的，所述治疗多囊卵巢综合症的药物制剂为分散剂、片剂、胶囊剂、颗粒剂、栓剂或者丸剂。
进一步的，所述治疗多囊卵巢综合症的药物制剂还包括辅料。
有益效果：
本发明提供茯苓酸及其衍生物一种新的用途，用于制备治疗多囊卵巢综合症药物，其对多囊卵巢综合症有显著的疗效，且没有副作用。再则，茯苓酸作为中药中提取分离的化合物，在本发明实施例中证实可用于改善由DHEA诱导的小鼠PCOS疾病，进一步地，本发明从卵巢和卵母细胞角度，阐述了茯苓酸的治疗作用。总之，茯苓酸可以抑制炎症及缓解PCOS小鼠胰岛素抵抗，从而抑制颗粒细胞的损伤，抑制卵母细胞氧化及凋亡，间接提高多囊卵巢综合征小鼠卵母细胞质量，对治疗多囊卵巢综合症具有较好的效果。
附图说明
为了更清楚地说明本发明的技术方案，下面将对附图作简单的介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅涉及本发明的一些实施例，而非对本发明的限制。
图1是本发明一个实施例提供的对照组、模型组、茯苓酸治疗组和二甲双胍治疗组体内发育的MII期卵母细胞的形态评估图，图中N正常外观；a极体退化；b卵周隙扩大；c细胞质碎裂)；
图2是本发明一个实施例提供的茯苓酸和二甲双胍对DHEA诱导的小鼠模型中胚胎卵裂和后期发育图像，图中Bl＝囊胚；Ly＝裂解的胚胎；Mo＝桑椹胚)；四组胚胎中Oct4(红色)和TUNEL(绿色)的代表性免疫荧光图像，用DAPI染色的核(蓝色)，比例尺＝20μm；
图3是本发明一个实施例提供的各组小鼠卵巢切片的代表性H&E染色图像，分别在放大X40，X100，X400倍数处拍摄显微图像，方框即被放大倍区域(*为囊性卵泡；HC为出血性囊肿；箭头指示颗粒细胞层)；
图4是本发明一个实施例提供的对照组、模型组、茯苓酸治疗组和二甲双胍治疗组卵巢生长卵泡的透射电子显微镜分析(n＝3)。各组卵巢样品的生长卵泡的代表性图像(a1，b1，c1，d1，e1，f1；比例尺＝10μm)。卵母细胞(a2，b2，c2，d2，e2，f2)，颗粒细胞(a4，b4，c4，d4，e4，f4)，卵泡膜细胞(a6，b6，c6，d6e6，f6)，卵巢基质细胞(a8，b8，c8，d8，e8，f8)比例尺＝2μm。a3，b3，c3，d3，e3，f3显示卵母细胞图像方框被放大区域；a5，b5，c5，d5，e5，f5来自颗粒细胞图像方框被放大区域；a7，b7，c7，d7，e7，f7来自卵泡膜细胞图像方框被放大区域；a9，b9，c9，d9，e9，f9来自卵巢基质细胞图像方框被放大区域；比例尺＝0.5μm。在对照组-a，茯苓酸治疗组-e和二甲双胍治疗组-f中(椭圆形)显示正常线粒体的大小尺寸和嵴外观。线粒体呈“空泡”状(椭圆形)，“黑或类似重影”状(椭圆形)和“管状/蜂窝状”嵴在横截面中(椭圆形)出现在模型组-b，c，d，部分出现在茯苓酸治疗组-e和二甲双胍治疗组-f中。细胞脂滴(星形)出现在四个组中。显示线粒体细胞凋亡坏死(d8，星形)。
具体实施方式
下面将更详细地描述本发明的优选实施方式。虽然以下描述了本发明的优选实施方式，然而应该理解，可以以各种形式实现本发明而不应被这里阐述的实施方式所限制。
本发明中，相关术语定义如下：
茯苓酸(PA)是茯苓和灵芝中草药中的一种三萜类化合物，是茯苓的主要有效成分之一，在各种药理作用中起着重要作用。例如中药导痰丸、启宫丸及定经汤配伍成分中都有一味相同的至关重要的中药，即茯苓。
本发明对茯苓酸的来源没有特别的限定，可以通过商购得到，也可以按照现有的各种方法制备得到，包括中药提取分离、以及菌种培养分离提纯等。此外，还需要说明的是，茯苓酸的衍生物具有茯苓酸相似的活性，同样具有相同或相近的治疗多囊卵巢综合症的效果。例如茯苓酸盐、茯苓酸水合物、茯苓酸溶剂化物、茯苓酸共晶化合物等。
本发明中，茯苓酸对小鼠的治疗效果包括抑制体重增加，改善糖耐量异常，改善激素紊乱、高血脂症和慢性炎症，抑制炎症，缓解胰岛素抵抗，抑制颗粒细胞的损伤，抑制卵母细胞氧化及凋亡中至少一种，相应地，茯苓酸或茯苓酸衍生物用于制备治疗多囊卵巢综合症药物对于一般受体也具有上述作用，对此本领域技术人员均能知悉，在此不作赘述。
本发明中，茯苓酸或其衍生物应用于制备治疗多囊卵巢综合症的药物制剂，药物制剂的形式包括但不限于分散剂、片剂、胶囊剂、颗粒剂、栓剂或者丸剂。此外，药物制剂可以含有辅料，例如，淀粉、粘结剂、糖，对此本领域技术人员均能知悉，在此不作赘述。
以下将通过实施例对本发明进行详细描述。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
以下实施例所涉及实验动物：
实验的小鼠均为5周龄的雌性KM小鼠，体重为20-23g，中国上海斯莱克公司(证书号：SCXK2012-0002)，根据中国厦门大学动物研究委员会的严格规定(批准文号：XMUMC2011-10-08)进行饲养并使用，标准完全符合美国国立卫生研究院(National Institutes of Health,NIH)公布的“实验动物管理准则”(Principles of Laboratory Animal Care)的相关规定。光照严格按照12h光照和黑暗交替的周期，温度控制在24℃±1℃，小鼠摄水进食自由，适应性喂养一周后可用于实验。
以下使用的主要试剂包括：
1)DHEA(脱氢表雄酮)：购自武汉欣欣佳丽生物科技有限公司，纯度≥98％，4℃避光保存；
2)Pachymic acid(茯苓酸)：购自上海士锋生物科技有限公司，纯度≥98％，-20℃避光保存；
3)Metformin(二甲双胍)：购自武汉欣欣佳丽生物科技有限公司，纯度≥98％，4℃保存；
4)注射用大豆油：购自新兴(铁岭)制药股份有限公司，4℃避光保存；
5)DMSO(二甲基亚砜)：购自Sigma Chemical Co.(St.Louis,MO,USA)公司，常温保存；
6)D-Glucose：购自Sigma Chemical Co.(St.Louis,MO,USA)公司，规格100mg，室温保存；
7)血糖试纸：购自强生公司(强生ONE TOUCH-Ultra稳豪倍易倍优血糖仪试纸片)，常温避光保存；
8)CHO、TG、HDL、LDL生物试剂盒：购自南京建成生物工程研究所，4℃避光保存；
9)Isoflurane(异氟醚)：购自上海玉研科学仪器有限公司，规格100mL，4℃避光保存；
10)透明质酸酶：购自Sigma Chemical Co.(St.Louis,MO,USA)公司，-20℃避光保存；
11)逆转录试剂盒(RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit)：Thermo Scientific，USA，q-PCR所有试剂套装(SYBR Green Real-time PCR Master Mix Kit)：Takara，Japan；
12)促超数排卵激素：PMSG(孕马促性腺激素，Pregnant mare serum gonadotropin)和hCG(人绒毛膜促性腺激素，Human chorionic gonadotrophin)：购自宁波三生药业有限公司(Ningbo Sansheng pharmaceutical company,China)，-20℃保存；
13)M2medium(M2细胞培养基)：购自Sigma Chemical Co.(St.Louis,MO,USA)公司，4℃保存；
14)小鼠源抗β-actin单克隆抗体(Mouse monoclonal Anti-beta Actin antibody)：购自Abcam(Abcam ab8226)公司，规格：100μg，-20℃保存，WB稀释比例1:10000；
15)兔源抗IL-6多克隆抗体(Rabbit PolyclonalAnti-IL-6Antibody)：购自proteintech(proteintech21865-1-AP)公司，规格：53μg/150μl，-20℃保存，WB稀释比例1:1000；
16)兔源抗TNF-α多克隆抗体(Rabbit Polyclonal Anti-TNF-Alpha Antibody)：购自proteintech(proteintech 17590-1-AP)公司，-20℃保存，WB稀释比例1:1000；
17)兔源抗OCT4多克隆抗体(Rabbit Polyclonal Anti-OCT4Antibody)：购自购自proteintech(proteintech 11263-1-AP)公司，规格：54μg/150μl，-20℃保存，IF稀释比例1:100；
18)Alexa Fluor 546标记驴抗兔二抗(Donkey Anti–Rabbit IgG Antibodies Conjugates Alexa Fluor546)：购自INVITROGEN(A10040)公司，规格：500μl，4℃避光保存，IF稀释比例1:400；19)FITC偶联小鼠源抗α-tubulin单克隆抗体(mouse monoclonal anti-α-tubulin antibody conjugate FITC)：购自Sigma Chemical Co.(St.Louis,MO,USA)公司，规格：1.5mg/mL，-20℃避光保存，工作液4℃保存，IF稀释比例1:200；
20)小鼠源γ-tubulin单克隆抗体(Mouse monoclonal anti-γ-tubulin antibody)：购自Sigma Chemical Co.(St.Louis,MO,USA)公司，规格：1.3mg/mL，-20℃保存，工作液4℃保存，IF稀释比例1:100；21)罗丹明标记鬼笔环肽(Phalloidin conjugates TRICT)：购自Sigma Chemical Co.(St.Louis,MO,USA)公司，规格：0.5mg/mL，-20℃避光保存，工作液4℃保存，IF稀释比例1:100；
22)含有核染料DAPI的防淬灭封片剂(Vectashield mounting medium with DAPI)：购自Vector Laboratories,I(Burlingame,CA,USA)公司，规格：1.5μg/ml，原液及分装工作液4℃避光保存；
23)Tunel细胞凋亡原位检测试剂盒(terminal deoxynucleotidyltransferasemediated dUTP nick-end labelingreaction mixture)：购自凯基生物技术股份有限公司，-20℃避光保存；
24)Annexin V-PE细胞凋亡检测试剂盒：购自碧云天生物技术股份有限公司(Beyotime-C1065,China)，4℃保存；
除非另有说明，本实验中使用的所有化学品试剂均购自Sigma Chemical。
实施例中所涉及的引物在上海生工生物公司合成，引物信息如下：
PI-3K(mouse)：
forward,5’-AGCCAACAACAGCATGAACA-3’；SEQ ID NO:1
reverse,5’-AAGGTCCCATCAGCAGTGTC-3’；SEQ ID NO:2
GLUT4：
forward,5’-TCTCAATGGTTGGGAAGGAA-3’；SEQ ID NO:3
reverse,5’-GAGGAACCGTCCAAGAATGA-3’；SEQ ID NO:4
IRS-1：
forward,5’-AGCCTGTTGTGGACTTGGTC-3’；SEQ ID NO:5
reverse,5’-ACTCGAGCCTGTGCATTCTT-3’；SEQ ID NO:6
CYP17：
forward,5’-TGGTCATATGCATGCCAACT-3’；SEQ ID NO:7
reverse,5’-CCCTTCTTCACGAGCACTTC-3’；SEQ ID NO:8
GSK3-β：
forward,5’-TTCCTTTGGAATCTGCCATC-3’；SEQ ID NO:9
reverse,5’-TGAAACATTGGGCTCTCCTC-3’；SEQ ID NO:10
IL-6：
forward,5’-AGTTGCCTTCTTGGGACTGA-3’；SEQ ID NO:11
reverse,5’-CCTCCGACTTGTGAAGTGGT-3’；SEQ ID NO:12
TNF-α：
forward,5’-ACGGCATGGATCTCAAAGAC-3’；SEQ ID NO:13
reverse,5’-GTGGGTGAGGAGCACGTAGT-3’；SEQ ID NO:14
以下使用相关试剂的配制方法如下：
1)实验用药物：
DHEA溶液：取600mgDHEA溶于10ml注射用大豆油中，常温搅拌1-2天完全溶解。溶解后液体呈现乳白色，牛奶样。4℃避光保存。
茯苓酸溶液：取1.1g茯苓酸粉末溶于176ml生理盐水中，加入5‰的DMSO助溶，充分混匀后，分装(每只8ml)避光保存至-20℃冰箱。随用随取。
二甲双胍溶液：取11g二甲双胍粉末溶于176ml生理盐水中，加入5‰的DMSO，充分溶解，分装(每只8ml)保存至4℃冰箱，随用随取。
2)HE染色试剂：
苏木精的配制：首先将20g硫酸铝钾粉末加入200mL蒸馏水中，加热使其溶解，随后将1g苏木精粉末加入10mL无水乙醇溶解；混合上述两种液体并加热煮沸；加入0.5g氧化汞粉末后继续加热并搅拌，随后溶液变为深紫色，迅速在冰水中冷却；最后加入8mL冰醋酸；室温1h过滤即可。
伊红的配制：取100mL95％的乙醇溶液，将1g伊红加入至溶解，即得到1％的伊红。
3)IF自备试剂：
PBS缓冲液(pH7.4，1000mL)：分别称取KH2PO4 0.2g，NaCl 8g，Na2HPO4 1.15g(或NaHPO4·12H2O 2.9g)，KCl 0.2g，依此将药品加入到500ml超纯水中，在磁力搅拌器上搅拌至完全溶解，后转移至1000mL容量瓶中，将清洗烧杯过后的适量超纯水倒入容量瓶，后加入超纯水使其定容至1000mL，混匀充分后调PH至7.4，经高压灭菌，4℃保存。
固定液(4％多聚甲醛，10mL)：称取0.4g多聚甲醛粉末，放入10mL PBS缓冲液中，后放入65℃左右的水浴锅里加热直至粉末完全溶解，室温冷却后将固定液进行过滤并分装；4℃保存1周，-20℃可保存1个月。
透膜液(MPs，10mL)：吸取50μLTritonX-100加入9.95mL PBS缓冲液中，(由于TritonX-100性状较粘稠，不易被吸取，将枪头尖端减掉一小部分以便液体的吸取)，待其完全溶解后，过滤分装，于4℃可保存1个月。
洗脱液(Washing Buffer，WBF；50mL)：吸取50μL Tween20加入至50mLPBS缓冲液，(由于Tween20性状较粘稠，不易被吸取，将枪头尖端减掉一小部分以便液体的吸取)，待其完全溶解后，过滤分装，于4℃可保存1个月。
封闭液(Blocking Buffer，BBF；10mL)：称取0.2g牛血清蛋白(Bovine Serum Albumin,BSA)加入至10mL WBF中待其完全溶解后，过滤分装，于4℃可保存1个月。
抗原修复液：首先配置A液(0.1M枸橼酸溶液)，称取21.01g枸橼酸(C6H8O7·H2O)加入至装有约500mL超纯水的1000mL烧杯中，在磁力搅拌器上搅拌直至枸橼酸完全溶解，后转移至1000mL容量瓶中，将清洗烧杯过后的适量超纯水倒入容量瓶，后加入超纯水使其定容至1000mL，充分混匀后转移至1000mL规格的洁净蓝口瓶中待用。再配置B液(0.1M枸橼酸钠溶液)，称取29.41g枸橼酸钠(C6H5Na3O7·2H2O)加入至装有500mL左右超纯水的1000mL烧杯中，在磁力搅拌器上搅拌直至枸橼酸完全溶解，后转移至1000mL容量瓶中，将清洗烧杯过后的适量超纯水倒入容量瓶，后加入超纯水使其定容至1000mL，充分混匀后转移至1000mL规格的洁净蓝口瓶中待用。最终工作液的配置:分别取9mL A液和41mL B液，混合至洁净烧杯中，后将混合液转移至500mL规格的容量瓶中，加适量超纯水定容至500mL，注意现配现用。
4)超排试剂：
PMSG(50U/mL)：用纯净PBS将PMSG冻干粉末稀释至50U/mL，随即分装成(0.1mL/每只鼠注射)的量储存。-20℃可保存1个月；
hCG(50U/mL)：用纯净PBS将hCG冻干粉末稀释至50U/mL，随即分装成(0.1mL/每只鼠注射)的量储存。-20℃保存可1个月，注意避光。
5)其他试剂：
透明质酸酶(0.1％)：称取1mg透明质酸酶，溶于1ml M2溶液中。
亚甲基蓝(0.1％)：向54ml 95％乙醇中加入40ml四氯乙烷，混合摇匀，水浴锅(65℃)中放置3min，之后加入0.1g亚甲基蓝，混匀后冷却至4℃，最后加入6ml冰乙酸，混匀后常温保存。
以下使用的测试、分析方法包括：
1)发情周期测定
通过阴道细胞的显微镜检查获取发情周期信息，发情前期阴道脱落细胞以部分角化上皮细胞为主；发情期：阴道脱落细胞以完全角化上皮细胞为主；发情后期：阴道脱落细胞以白细胞和中间层细胞为主；间情期：阴道脱落细胞为少量白细胞与中间层细胞。
具体操作如下，首先将小鼠固定，用细棉签蘸取适量生理盐水，充分润湿后轻轻插入生殖道(约0.5cm)，轻轻转动后取出，将棉签湿润部分轻轻在载玻片中央涂抹均匀，晾晒至自然干燥，用注射器将亚甲基蓝染色(0.1％)放于载玻片涂抹处染色5min，之后用蒸馏水缓缓冲洗多余的染液，晾干后在显微镜下观察涂片的细胞形态及组织的特征变化，从而确定小鼠所处于动情周期的阶段，每日1次。
2)口服葡萄糖耐量试验(OGTT)
禁食8h的雌性小鼠通过灌胃给予溶于生理盐水(2g/kg)的D-葡萄糖，使用OneTouch Ultra血糖仪测量血液中葡萄糖含量。禁食时间结束后0min(在口服葡萄糖之前)，从尾静脉收集的血液样品用于测量血糖水平作为初始血糖水平，立即通过灌胃给予每只小鼠(2g/kg)的D-葡萄糖生理盐水溶液，之后在30min、60min、90min和120min时测量这些小鼠的血糖值，并记录其血糖变化。数据记录为血糖浓度的绝对值。使用GraphPad Prism 5.0软件计算葡萄糖应答曲线下面积(AUC)。
3)血清中生化指标检测分析
血样通过摘除小鼠眼球的方式收集。小鼠禁食8h之后，通过吸入异氟醚麻醉，立即进行摘眼球取血处理。取血结束后，室温静止后，离心分离得到血清，并立即保存在-80℃以进行随后的血清生化指标的测定。委托湖南锋锐生物科技有限公司采用ELISA法测定血清中E2、T、AMH、INS、LEP、IL-6、TNF-α水平。利用生化试剂盒(南京建成生物工程研究所)测定血清中CHO，TG，HDL，LDL含量。
4)卵巢组织学分析和卵泡计数
收集血样后，迅速取出小鼠(每组3只)的卵巢，并用4％多聚甲醛固定。然后按照常规组织学方法脱水并包埋在石蜡中，将小鼠一侧的卵巢切成5μm的薄片，并伸展至载玻片用于卵巢形态评估。将另一侧的卵巢进行全切，连续切片(8μm片)，每5张中取一张伸展至载玻片上，用于卵泡计数。最后用苏木精和伊红染色，在光学显微镜下观察并计数。
HE染色的具体过程包括脱水包埋、切片及展片、HE染色三步。脱水包埋：首先将卵巢组织放置于4％的多聚甲醛固定液中12h，固定结束后；蒸馏水冲洗3遍，之后梯度酒精脱水，于50％、70％、80％、90％梯度酒精中各放置25min，100％乙醇中2次，每次30min；随即无水乙醇与二甲苯1:1混合液中30min，二甲苯中2次，每次20min，最后放置二甲苯与石蜡1:1混合液30min，石蜡液中2次，每次1h，脱水结束后，用石蜡将组织包埋。切片及展片：首先修整包埋块，轻轻固定于切片机上，调节切片厚度为需要值(4μm/8μm)，切出薄片后，用镊子夹取放至水浴锅(40℃)中展片；取载玻片伸入水浴锅中，可用镊子辅助轻轻靠近石蜡片后，竖直慢慢抬起载玻片，可见石蜡片黏到玻璃片上；将载玻片放入烘箱(60℃)30min进行熔蜡处理，必须保证染色时放入二甲苯中载玻片是热的。HE染色：此时石蜡切片需用二甲苯进行脱蜡，乙醇水化处理：将切片放入二甲苯2次，每次20min，100％乙醇2次，每次2min，随后梯度酒精水化，95％、80％、70％乙醇各1min，最后蒸馏水中1min；苏木精和伊红染色：按照苏木精染色5min，自来水浸洗至无色，1％盐酸乙醇10s，自来水浸洗至无色，伊红液染色8min，自来水浸洗至无色的步骤可使组织染色；随即乙醇进行脱水、二甲苯进行透明、中性树胶进行封固，具体过程为70％、80％、85％、95％乙醇中各放置30s，最后100％乙醇2次，每次1min，二甲苯酒精1:1混合液1min，二甲苯I中1min后再放入二甲苯II中2min，立即中性树胶封片。
卵泡计数方法参考相关文献的记述，详细确定每个卵巢的静息(原始)、生长(初级，次级)和成熟卵泡的数量，原始卵泡：卵母细胞的外周有一层扁平的卵泡细胞，并靠近白膜中央；生长卵泡中初级生长卵泡：卵母细胞外周有一层或多层立方形卵泡细胞，并出现透明带，结缔组织的卵泡膜出现在卵泡外围；生长卵泡中次级生长卵泡：卵泡腔出现，大的卵泡腔形成卵丘，并出现颗粒细胞层(卵泡内壁上的卵泡细胞密集并排列成数层)，卵泡膜可分出内膜和外膜两层；成熟卵泡：卵泡腔更大，卵丘非常明显，卵泡内膜细胞与卵泡颗粒层紧靠，一层基膜将其和颗粒层细胞相隔，内膜细胞胞质清亮，呈多边形，胞核呈圆形，许多毛细血管出现在细胞间，多呈梭形的外膜细胞位于最外层，与周围结缔组织的分界极不明显，出现放射冠；闭锁卵泡：透明带出现皱缩，卵母细胞的结构很不清晰，甚至消失不见，卵泡壁发生塌陷。简而言之，只计算给定切片中具有可见核的滤泡，以避免高估真实的卵泡数量，每五张切片记录一张切片的各级卵泡数，最后累计计数切片的各级卵泡数，即为每个卵巢所含各级卵泡真实值。
5)透射电子显微镜(TEM)分析
按照上述方法处死每组另外三只小鼠，将每只小鼠卵巢的一侧保存在-80℃的Trizol中用于RNA分离。另一侧卵巢在填充有2.5％戊二醛的蜡板上将其解剖成两部分，立即在2.5％戊二醛中固定，之后在4℃冰箱中放置至少8h，固定结束。随后将固定液用PBS稀释三倍，用四氧化锇进行后固定，然后用乙醇梯度脱水，然后渗透并包埋于618树脂中，注意包埋位置卵巢皮质朝上。最后用超透射电子显微镜(JEM-2100，TEM)观察3％醋酸铀-枸橼酸铅双染色后的超薄切片。
6)RNA提取和实时定量聚合酶链式反应
本实验采用实时定量聚合酶链式反应(qPCR)来检测卵巢组织和脂肪组织中PI3K、GLUT4、GSK3-β、IRS-1、CYP-17、TNF-α、IL-6的mRNA相对表达水平。
卵巢组织或脂肪组织总RNA的提取操作流程:
提取组织中的RNA，首先在研钵中加入液氮，再分别将卵巢组织或脂肪组织放在液氮中磨成粉末，在1ml的Trizol液中(注意组织粉末总体积不可大于所用Trizol体积的10％)中加入约50～100mg组织粉末(用预冷后的药匙取)，使其充分混合均匀。在室温放置5min后，加入氯仿200μl，将EP管盖盖紧并摇荡15s。随即离心机调至12000rpm转速，离心10min后取上层水相到新的EP管中(注意不可混入下层液和中间的沉淀层，否则需重新离心分离)，加入异丙醇500μl后混匀；室温放置10min，离心机调至12000rpm转速，离心10min后小心地弃去上清液，之后加入75％乙醇1ml，涡旋使其混匀，于4℃离心机(12000rpm)离心5min。重复操作一次。最后将上清液(尽量将残余液体除去)弃之，放置室温干燥5～10min。取30μl DEPC处理过的水，用于RNA溶解，如有需要可55℃～60℃水浴约10min。如不使用可贮存于70％乙醇并保存于-70℃。
总RNA提取中注意事项：全程佩戴无菌的手套和口罩，身穿实验服，少说话并不可用手触摸其他物品(必要时需更换手套)。操作前做好准备工作，如耗材、试剂、样品、仪器是否齐全等)。应事先做好操作台和所用仪器的清洁消毒准备，在实验正式开始前，先用含RNA酶降解剂的Ambion液喷操作台面、仪器、手以及试剂外壳，以去除RNA酶。所有试剂及各个样品一定要在离心管盖上标记清楚，切勿混淆。操作全程注意避免交叉污染，移液枪头需及时更换。最终提取的RNA溶液，需立即进行逆转录反应处理(防止RNA的降解)。
总RNA的逆转录PCR反应:
首先在65℃条件下把装有RNA的EP管静置5min对RNA进行变性处理，随后立即放置冰上使其冷却。逆转录体系(20μl反应体系)配制好后，轻柔地使用移液枪充分混匀(注意尽量不要出现气泡，如果产生气泡，可在低温下瞬时离心去除；或者发现样品较多时，处于低温条件下有利于抑制酶的活性，可延缓上机前反应)。使用的PCR仪为Biometra T-Gradient Thermoblock PCR equipment。将装有20μl逆转录反应体系(无气泡且充分混匀)的EP管放至仪器内的中间金属槽，启动逆转录程序被选择并确认后，逆转录反应便开始进行。随后对cDNA浓度和纯度进行测定，可得到可用模板，最后逆转录反应结束。之后，如果实验者一周以内就要做real-time的上机检测，则cDNA模板可保存于4℃；如果较长时间后才做上机检测，需-20℃长期保存(低温条件下cDNA不易被降解)。
Real time qPCR反应:
反应体系的配制和加样过程中，为了减少加样误差，建议在加样之前，先在20μlcDNA模板中加入80μl双蒸水，并充分混匀，随后分别完成cDNA模板和引物的预混操作。
cDNA模板预混：5μl cDNA液+0.4μl ROX Reference Dye II(50X)+10μl SYBR染液＝15.4μl
引物预混：3.8μl双蒸水+0.4μl正向引物+0.4μl反向引物＝4.6μl
上述过程完成后，上机进行Real time qPCR检测，本实验所使用的Real time qPCR仪为7500Fast Real-Time PCR System，选择β-actin作为内参，以进行相对定量检测。qPCR的实验程序设置如下：首先95℃30s，其次95℃3s与60℃30s(完成1个循环)，总共40个循环。随后95℃15s，60℃1min，95℃15s。
针对数据分析，根据已经检测出的循环数CT值，使用ΔΔCT法最终可计算出目的基因的相对mRNA表达量。
7)蛋白质免疫印迹试验(Western blot)检测脂肪组织中的IL-6和TNF-α
第1步蛋白样品的提取:
将分离得到的腹膜后白色脂肪组织称重，切小块放入管中。加入含抑制剂的预冷的蛋白质抽提试剂(250mg组织中约加入1ml抽提试剂)。用裂解超声仪在冰水浴中每次30s低频间隔超声1min，直至组织完全裂解，之后裂解液于预冷的离心机中离心15min。上清液立刻转移入新的离心管中并加入10X loading buffer使之变为1X，在100℃煮5min，煮完放入-20℃保存待用。
第2步蛋白质免疫印迹试验(Western blot):
首先配置凝胶，包括12％的分离胶和5％的浓缩胶。之后上样电泳，将样品从-20℃取出置于100℃煮5min，随后在室温下高速离心5min，将样品全部加入上样孔中，设置电泳程序为浓缩胶80V跑30min，分离胶110V跑70min。待蛋白完全分离，进行转膜，切下相应位置的凝胶，剪裁相应大小的两张滤纸一同放入装有转膜缓冲液的小盒中浸泡约10min，剪裁相应大小的硝酸纤维素膜(PVDF膜)放于甲醇中激活后也转移至转膜缓冲液中，按从正极至负极顺序为滤纸-膜-胶-滤纸的顺序叠放，设置转膜程序为15V转膜1h。转膜结束，配制封闭液，10ml TBST中加入0.5g脱脂奶粉制成5％封闭液，将PVDF膜浸入封闭液，室温下在摇床上封闭1h。孵育一抗，将PVDF膜放入配制的一抗溶液(β-actin，1:10000，Abcam ab8226；IL-6，1:1000，proteintech21865-1-AP；TNF-α，1:1000，proteintech 17590-1-AP)中，4℃下在摇床上震荡过夜。孵育结束，用TBST洗膜3遍，每遍10min，随后室温摇床孵育二抗(鼠抗；兔抗)1h，之后用TBST洗膜3遍，每遍10min。最后，避光将Western Light ECL行业检测试剂(Keygene生物技术公司)混合后淋于PVDF膜表面，静置3min左右后，于暗室中以胶片曝光获取蛋白条带情况。
8)卵母细胞收集和体外培养(IVM)
采用脊椎脱臼法来处死小鼠以最小化小鼠的痛苦，处死后将小鼠腹部朝下置于75％乙醇消毒过的工作台上，随后继续用75％乙醇对其背部进行消毒，用眼科剪在背部皮肤做一开口，以镊子夹出背部脂肪垫顺势牵出输卵管和卵巢，用眼科剪小心分离出双侧卵巢，将卵巢放置于预热过的M2培养基中，于培养皿中以少许新鲜M2将卵巢清洗干净，用无菌刀片将卵巢彻底剁碎，其后加入新鲜M2充分摇匀卵巢组织，将培养皿置于体式显微镜下，用口吸管挑选出发育良好的GV期卵母细胞，用新鲜M2反复清洗干净后将卵母细胞转移至覆盖着石蜡油平衡过的M2培养液中，置于培养箱中培养，培养条件为37℃，5％CO2，饱和湿度。
然后将收集的GV期卵母细胞置于37℃，5％CO2培养箱中培养并跟进观察，生发泡破裂(GVBD)卵母细胞数在2h后测定。随后，在第12h后记录第一极体(PB1)排出的数量。
GVBD率＝发生GVBD的卵母细胞数/GV期卵母细胞数×％
PB率＝发生PB1的卵母细胞数/发生GVBD的卵母细胞数×％
9)卵母细胞(MII)和胚胎收集和形态评估
为了收集MII卵母细胞，来自不同组的小鼠通过腹腔注射5IU PMSG超排，然后48h后，腹腔注射5IU hCG，14h后脱颈椎处死小鼠，取其输卵管置于预温过的M2液中。通过显微镜，使用无菌注射器的针头将输卵管壶腹部挑破，采集卵丘-卵母细胞复合体(COCs)，随后将其转移至含有0.2％透明质酸酶的M2液中，消化3-5min去除卵丘细胞。收集裸露的MII期卵母细胞并在立体显微镜下观察。最后，收集健康的MII期卵母细胞做后期的免疫荧光以检测纺锤体状况。
为了收集胚胎，像上述方法对小鼠进行超数排卵。注射完hCG后，按雌雄比1:1，与8周左右的健康雄性KM小鼠常规合笼交配过夜，第二天早上8:00观察雌鼠阴道栓，发现有阴道栓的小鼠说明成功交配，记为妊娠0.5天。妊娠3.5天后，取子宫，首先用颈椎脱臼法人道处死小鼠，把处死的小鼠腹面朝上放在消毒锅的操作台上，立刻用70％乙醇喷洒小鼠腹部。将腹腔打开，剥离盘绕在一起的肠子，双角子宫、输卵管和卵巢可见。用镊子夹住靠近子宫颈(膀胱后)的部位剪刀和镊子分离输卵管和卵巢，用剪刀剥离输卵管和子宫之间的系膜，然后将输卵管和卵巢之间剪开，确保输卵管和子宫之间的连接完整性。将子宫放在滴有预温好的M2培养液的组织培养皿上。随后冲洗子宫，采用从子宫角向子宫颈方向冲洗的方法。在靠近子宫颈的位置剪断子宫角，然后在靠近子宫输卵管连接部的子宫上端插入26号针头，吸取约0.3mL的M2培养基，朝子宫颈方向冲洗子宫角。用口吸管在显微镜下将胚胎挑拣出来。收集好的胚胎再用几滴新鲜的M2培养液洗涤几次，去除杂质，对各组小鼠胚胎总数，桑椹胚数，囊胚数，溶解胚胎数,发育在桑椹胚阶段前胚胎数等进行快速统计，并将各组囊胚挑选出来进行下一步的免疫荧光染色。
10)免疫荧光
1)卵巢凋亡(TUNEL)检测:
采用原位末端标记(deoxynucleotidyltransferase-mediated dUTP nick-end labelling，TUNEL)试剂盒检测，具体步骤如下：
石蜡切片进行脱蜡处理：按照如下程序，60℃烘片1h，二甲苯脱蜡2次，梯度乙醇水合(100％→95％→80％→75％)，每次5min；把玻片放入玻片槽中，加入PBS缓冲液使之没过组织块，漂洗三次，每次5min。
之后画蜡圈：为防止加在组织上的液体流失，需用组化笔在组织块周围画蜡圈，画圈之前可用洁净吸水纸尽量将标本周围的水吸干(注意不可触及标本)，画圈时圈不宜过大，距组织块边缘2-3毫米为宜。
通透处理：以45μl PBS+5μl Proteinase K的比例配置Proteinase K工作液，滴加50μl至每个样品上，37℃条件下反应30min。工作液现用现配。反应后把玻片放入玻片槽中，加入PBS缓冲液使之没过组织块，漂洗三次，每次5min。
制阳性片：按40μl DNaseI+10μl DNaseI Buffer的比例配置DNaseI工作液。选取一个样品，加入50μl DNaseI工作液，37℃反应30min。反应后把玻片放入玻片槽中，加入PBS缓冲液使之没过组织块，漂洗三次，每次5min。
连接标记：现配TdT酶反应液：以45μl Equilibration Buffer+1 μlbiotin-11-UTP+4μl TdT Enzyme的比例配置TdT酶反应液，冰上保存，注意避光。然后吸水纸将样品周围的水吸干，注意不要触碰到组织，每个样品滴加50μl TdT反应液，放入湿盒中，37℃避光，反应1h(选一张样品不加TdT酶，做阴性对照)。反应后把玻片放入玻片槽中，加入PBS缓冲液使之没过组织块，漂洗三次，每次5min。按5μl Streptavidin-Fluorescein+45μl Labeling Buffer比例混合配置Streptavidin-Fluorescein反应液，在用吸水纸吸干样品周围的平衡液后，每个样品滴加50μl反应液，37℃避光于湿盒内反应30min。反应后把玻片放入玻片槽中，加入PBS缓冲液使之没过组织块，漂洗三次，每次5min。
DAPI染核并封片：用DAPI染色液染细胞核，于室温条件下湿盒内避光10min，后盖上盖玻片，最后用FV1000共聚焦激光扫描显微镜(Olympus，日本)进行观察。
2)卵母细胞(GV期)早期凋亡(TUNEL)检测:
为了评估卵母细胞的凋亡，按照厂家说明使用Annexin-V探针(Beyotime，China)。首先将从不同组小鼠中取出的GV期卵母细胞直接放入提前预温好的Annexin-V-FITC荧光探针液滴(Annexin-V-FITC荧光探针：M2培养液为1：40)于37℃，5％CO2的培养箱中孵育30min。培养结束之后用M2培养液漂洗三遍，随后将这些卵母细胞转移至固定液30min，固定结束后，在WBF中洗涤三次，最后转移至预先滴有DAPI封片剂(2.5μl)的洁净载玻片中，可用玻璃针轻柔地混匀，沿一遍轻轻加盖洁净盖玻片，之后可用粘合剂将盖玻片封闭以防止盖玻片滑动和水分散失。标记清楚后避光保存至-20℃，整个操作过程需注意避光，封片结束后放入避光盒内，需要时可取出，使用激光共聚焦显微镜进行观察。
3)体内卵母细胞(MII)纺锤体染色:
为了评估来自输卵管壶腹部的MII期卵母细胞的纺锤体和染色体状态，将利用免疫荧光染色方法，将纺锤体和染色体标记染色，具体过程可鉴于以前的研究中所述。首先MII期卵母细胞在4％多聚甲醛中室温固定30min，然后在透膜溶液(0.5％Triton X-100)中透化30min。随后用含有1％牛血清白蛋白(BSA)的PBS封闭1h，与第一抗体(小鼠抗α-tubulin-FITC抗体；1:200；Sigma，美国)在4℃孵育过夜。随后，用含0.1％吐温-20和0.01％Triton X-100的PBS洗涤三次，每次5min后，将卵母细胞与另一种抗体(鬼笔环肽-TRITC；1:100；Sigma，USA)在室温下孵育30min。最后用DAPI(Vector，Switzerland)将卵母细胞共染色密封在载玻片上。随后，使用FV1000共焦激光扫描显微镜检查。
4)体内胚胎Oct4和凋亡(TUNEL)检测:
具体步骤如下：预处理：将从不同组小鼠中取出的囊胚分别用4％的多聚甲醛中固定30min，透膜液(Mps)中处理30min，然后转移至封闭液(BBS)中封闭1h。加一抗：将囊胚置于抗Oct4多克隆抗体(1:100，proteintech11263-1-AP)中4℃过夜；漂洗：第二天，洗脱液(WBF)漂洗3次，每次5min；加二抗：将样品转移至Alexa Fluor 546标记驴抗兔二抗(1:400，INVITROGEN(A10040))工作液中孵育1h；漂洗：孵育结束后，用WBF漂洗3次，每次5min；随后按照tunel试剂盒配制反应液，进行tunel染色；再次漂洗：孵育结束后，用WBF漂洗3次，每次5min；封片：在净载玻片中央滴加含有少量可防荧光猝灭的DAPI，将样品转移至此，轻柔地用玻璃针混匀，随后加盖洁净盖玻片封片；最后可用粘合剂将盖玻片封闭以防止盖玻片滑动和水分散失。封片完成后放入玻片避光盒内，-20℃保存，在激光共聚焦显微镜下观察并计数。
11)统计分析
在本研究中每项实验至少重复3次以上，采用SPSS软件(IBM Corp，USA)软件对实验所得数据进行分析，统计学方法采用的是单因素方差分析Bonferroni检验法，数据用均值±标准误(means±SEM)表示，*P<0.05，**P<0.01vs对照组；ΔP<0.05，ΔΔP<0.01vs模型组；P<0.05被认定为在统计学上差异，本文中n表示卵母细胞的个数。
实验方法
将饲养一周后的雌性KM小鼠在随机分成四组(对照组、模型组(DHEA)、茯苓酸(Pachymic acid)治疗组、二甲双胍(Metformin)治疗组)，每组30-40只。对照组小鼠皮下注射大豆油(新兴(铁岭)制药股份有限公司)并每天给予生理盐水灌胃一次作为空白对照，连续21天，同时模型组小鼠每天皮下注射DHEA(6mg/100g；武汉欣欣佳丽生物科技有限公司)溶解在注射用大豆油中，用于制造PCOS疾病模型，并通过灌胃给予相同的生理盐水。而茯苓酸治疗组和二甲双胍治疗组的小鼠皮下注射相同的DHEA溶液，用于制造疾病模型，同时分别通过灌胃方式给予含有茯苓酸(5mg/100g；上海士锋生物科技有限公司)和二甲双胍(50mg/100g；武汉欣欣佳丽生物科技有限公司)的生理盐水溶解液。所有参与实验的小鼠在受控温度(24℃)和光照条件下(模拟12h的自然光/暗循环)饲养，并维持和提供充足的食物和水。
在整个实验期间，所有雌性小鼠每两天称重一次，并记录每组小鼠体重变化。从第14天，从每组小鼠中随机选出3只，观察其性周期变化，每天早上8:00～9:00进行阴道涂片至实验结束，观察到小鼠的阴道上皮细胞连续8天出现角质化被作为PCOS模型成功的标志。每组随机选取部分小鼠(约15只/组)用于采集血样，同时其中一部分采集其腹膜后白色脂肪组织，卵巢组织，以检测脂肪组织及卵巢变化；另一部分用于收集这些小鼠的GV期卵母细胞进行体外培养成熟(IVM)等试验，以检测卵母细胞初期状态。采集得到的血样，及时离心取上层血清，采集得到的血清标本和组织，及时处理，放于-80℃冰箱用于后续实验，用于后期血清因子检测和组织PCR检测。剩余的小鼠分成两部分，一部分约10只，禁食8h后，进行OGTT实验，OCTT实验结束后，超排处理，并收集MII期卵母细胞，用于对MII期卵母细胞质量评估；另一部分放入健康雄性小鼠进行1:1交配处理以收集胚胎，用于胚胎的质量评估。
实验结果
1)茯苓酸对小鼠体重和糖耐量的影响
所有小鼠的体重在治疗开始时相似。从治疗的第11至21天，模型组小鼠的体重表现出显著上升的趋势(P<0.01)，而与对照组相比，茯苓酸治疗组的和二甲双胍治疗组小鼠的体重都有所增加，但增长较慢，并且茯苓酸治疗组的体重更接近对照组的体重。数据表明，模型组小鼠通过皮下注射DHEA后，体重表现出显著增加，同时，茯苓酸可明显改善由此引起的小鼠体重增加。
通过进行OGTT以研究茯苓酸对小鼠葡萄糖代谢的影响。发现，刚开始时组间空腹血糖水平相似。与模型组小鼠相比，在口服葡萄糖后30和60min时，茯苓酸和二甲双胍治疗组小鼠血清葡萄糖水平得到显著降低。茯苓酸治疗组小鼠和对照组小鼠对葡萄糖应答情况相似。统计分析显示，与模型组小鼠相比，茯苓酸和二甲双胍治疗组小鼠在0至120min内的AUC值显著下降。此外，在缓解药物组和对照组小鼠之间没有发现显着差异，表明由DHEA引起的葡萄糖耐量受损被茯苓酸和二甲双胍缓解。
2)茯苓酸对小鼠体内激素紊乱、高血脂症和慢性炎症的影响
激素异常是PCOS最常见的特征，它与雌二醇，睾酮，抗缪勒氏激素，胰岛素和瘦素等相关。因此分别测量了这些激素在四组小鼠血清中的浓度。发现，与对照组相比，模型组中这些激素水平都有所增加。而除了在降低胰岛素水平上外，茯苓酸在改善这些异常方面都强于二甲双胍。除上述指标外，还测定了血清中参与高脂血症形成的总胆固醇和TG、HDL、LDL水平。发现，在茯苓酸和二甲双胍治疗后，由DHEA诱导引起的CHO、TG、LDL升高得到缓解，同时，低水平的HDL得到提升。这些结果表明茯苓酸，类似二甲双胍，可参与脂质代谢。同时，也检测了血清中的TNF-α，IL-6(系统性炎症评估指标)含量。令人惊讶的是，与对照组相比，这两个炎症因子在模型组中降低，同时发现茯苓酸治疗组中TNF-α值更是低于模型组，虽然这个差异没有达到统计学意义。总之，与对照组相比，模型组和两种药物治疗组中的一些促炎性细胞因子的血清浓度降低。这些数据表明，茯苓酸可改善PCOS所引起的激素紊乱、高血脂症和慢性炎症。
3)茯苓酸对小鼠卵巢GV期卵母细胞数和发育潜能的影响
为了研究药物对小鼠GV期卵母细胞数量及质量的影响，检测了各组小鼠GV期卵母细胞数量、凋亡和发育潜能。结果显示，模型组小鼠的GV期卵母细胞数量和卵母细胞质量明显低于对照组(P<0.01)。然而，与模型组相比，卵母细胞凋亡，GVBD率和PB1率在PA组(2.2％vs 10.3％，卵母细胞数/n；91.0％vs 83.6％，GVBD；69.6％vs 55.3％，PB1)和Met处理的小鼠(3.8％vs 10.3％，卵母细胞数/n；91.8％vs 83.6％，GVBD；73.8％vs 55.3％，PB1)得到显著改善，同时对照组，茯苓酸和二甲双胍组中每只小鼠回收卵母细胞的数量没有差异。
接下来，分析标记膜联蛋白-V后的GV期卵母细胞，只有形态正常的卵母细胞被用于分析。与模型组相比，两组治疗组的GV期卵母细胞的死亡比率显著降低(P<0.01，PA；P<0.01，Met)。检测发现，通过膜联蛋白-V检测到的磷脂酰丝氨酸不能移位到内膜中，而只在透明带上具有绿色荧光信号的卵母细胞才能存活并且没有发生凋亡。具有早期凋亡的GV期卵母细胞的特征是在卵母细胞膜上有清晰的绿色信号，模型组(37.1％，n＝116)的GV期卵母细胞早期凋亡率显著高于对照组(9.4％，n＝138)。其中，茯苓酸组(12.6％，n＝132)和二甲双胍组(12.6％，n＝159)的GV期卵母细胞早期凋亡率与模型组相比显著降低。结果表明茯苓酸可通过抑制GV期卵母细胞的早期凋亡，从而改善PCOS小鼠的GV期卵母细胞质量。
4)茯苓酸对小鼠的异常MII期卵母细胞的数量影响
为了研究茯苓酸、脱氢表雄酮、二甲双胍对体内成熟的卵母细胞的影响，选择从输卵管中取出的MII期卵母细胞进行实验。首先，通过立体显微镜观察检测MII期卵母细胞的形态学异常。发现对照组中大多数MII期卵母细胞呈现正常形态(图1)，而来自茯苓酸处理组(21.1％，a；9.5％，b；4.8％，c；n＝124，n表示卵母细胞的数目)和二甲双胍处理组(13.1％，a；9.7％，b；7％，c；n＝114)具有异常形态特征的卵母细胞数，这些异常包括(a)极体退化，(b)卵周隙扩大，(c)细胞质碎裂，显著低于模型组(22.5％，a；7.1％，b；17.3％，c；n＝98)(图1)。这些结果都显示体内发育的MII期卵母细胞可被茯苓酸保护。
5)茯苓酸对小鼠的胚胎发育的影响
为了进一步评估茯苓酸对DHEA处理后的小鼠卵裂和胚胎发育异常的影响，比较了四个处理组内随机选择的小鼠体内胚胎的形态学特征，凋亡状况和Oct4表达。如图2所示，对照组中大部分胚胎为囊胚，异常胚胎包括裂解碎片(LY)和桑椹胚(MO)。与模型组胚胎异常情况(26.9％，LY；34.2％，MO；n＝85)相比，在茯苓酸处理组(11.1％，LY；36.1％，MO；n＝72)和二甲双胍处理组(14.7％，LY；22.4％，MO；n＝89)中的胚胎异常有所缓解。同时，通过共聚焦扫描显微镜检查了胚胎总细胞数，凋亡状况和Oct4表达情况。发现，与模型组(34±1.9)平均胚胎总细胞数相比，茯苓酸治疗组(37±1.4)或二甲双胍治疗组(43±1.8；P<0.01)的总细胞数显着增加。Oct4的表达在这些胚胎中也发生了显著的变化。此外，与模型组凋亡点数(10±0.8)相比，凋亡得到显著改善通过茯苓酸(4±0.6；P<0.01)或者二甲双胍(7±0.8；P<0.05)。同时，与对照组胚胎凋亡率(31％)相比，茯苓酸治疗组(36％)的凋亡率显著降低，二甲双胍治疗组(81％)凋亡改善不是很明显。这表明DHEA可对卵裂和囊胚发育造成损伤，并导致发育中的胚胎Oct4表达异常和凋亡增加，这些异常可通过茯苓酸治疗得到改善。
6)茯苓酸对卵泡发育的影响
基于卵巢是卵母细胞生长发育最重要的处所，研究了PCOS小鼠及治疗组小鼠卵巢形态和卵泡发育的变化。图3显示了对照组小鼠卵巢不同阶段的卵泡，以及卵泡膜细胞和卵泡颗粒层显示正常。然而，来自模型组小鼠的卵巢出现囊状滤泡，并具有异常外观的间质组织(箭头，图3，400X)。尽管在茯苓酸治疗组和二甲双胍治疗组小鼠同样存在囊性卵泡和出血性囊肿的异常结构(图3，40X和100X)，但与模型组卵巢相比(图3，400X)，茯苓酸治疗组或二甲双胍治疗的小鼠中囊状卵泡的颗粒细胞数目明显多于模型组及形态更加正常，表明茯苓酸和二甲双胍可降低卵巢管腔周围的颗粒细胞的凋亡。
接下来，通过统计各级卵泡数量来研究茯苓酸、脱氢表雄酮及二甲双胍对卵泡形成的作用。发现，尽管次级和有腔卵泡的数量在各组之间没有统计学差异，但是值得注意的是，与对照组相比，模型组小鼠卵巢的原始卵泡和初级卵泡的数量下降，而且，闭锁卵泡的数量增加。然而模型组中出现的这些损伤可被茯苓酸和二甲双胍改善。这些结果表明茯苓酸对的卵泡发育具有一定的影响。
7)茯苓酸对小鼠生长卵泡中细胞器的影响
通过透射电镜检测超微结构，进一步观察了生长卵泡周围及内部包含的各种类型细胞的显微照片，包括卵母细胞、颗粒细胞、内膜细胞和基质细胞。如图4所示，与对照组相比，模型组卵巢的卵泡膜结构总体上受损严重，而茯苓酸处理组和二甲双胍处理组没有出现如此严重的损伤。接下来，卵母细胞的超微结构观察显示，各组线粒体的数量和外观都发生了变化。图4a3，a5，a7，a9显示对照组卵母细胞中正常线粒体，具有许多平行膜层(蓝色)的正常线粒体嵴的组织外观。然而，在模型组异常卵母细胞中，线粒体具有变化稀疏/缺嵴的异常结构，包括具有“空泡”外观的线粒体(红色，图4.c，d，e，f)和“黑或类似重影”外观的线粒体(黄色,图4.c5，f5，c7，b9)。上述所有异常线粒体形态的例子很少出现在茯苓酸治疗组和二甲双胍治疗组中。此外，茯苓酸治疗组卵母细胞中线粒体数量明显多于其他组。计算了每组卵母细胞的线粒体损伤率。模型组线粒体损伤率明显高于对照组，然而，茯苓酸可以很好地改善这种损害(P<0.01)。另外，在本次研究中观察到颗粒和卵丘细胞，这两种细胞在模型组卵巢的生长卵泡中细胞凋亡严重，同时，呈现线粒体异常，内质网严重扩张。有趣的是，一种新的异常线粒体被发现在模型组和二甲双胍处理组的卵巢中，被称为“管状/蜂窝状”(橙色，图4.f7，c9，d9，f9)，具有更厚和膨胀线粒体嵴的外观。最后，对基质细胞的超微结构进行观察，发现与对照组相比，模型组诱导的基质细胞内脂滴体积更大且密度显著增加，同时线粒体也显示出“蜂窝状”。所有这些结果表明，模型组卵巢生长卵泡内各种类型细胞均出现损伤，这种损伤与线粒体和脂质体异常有关。对于这些病变，茯苓酸和二甲双胍都可以有效改善，其中茯苓酸改善线粒体损伤成效显著。
8)茯苓酸对卵巢中PI3K、GLUT4、GSK3-β、IRS-1、CYP-17、TNF-α表达的影响
实时荧光定量PCR用于对每组卵巢重要基因进行定量分析，选择了6个基因，每个基因编码参与葡萄糖摄取或胰岛素信号通路中的蛋白。使用GAPDH的同时测量作为标准内参。结果显示这些基因中有四个发生了显着变化，与模型组相比，茯苓酸治疗组的基因(GLUT4，GSK3-β，IRS-1和CYP-17；P<0.01)表现显著不同，而且模型组的IRS-1表现出异常地增加。
9)茯苓酸可减少脂肪组织中的促炎细胞因子
在小鼠脂肪组织中，通过q-PCR检测TNF-α和IL-6的mRNA水平变化，通过蛋白质免疫印迹法观察蛋白质水平变化。发现，模型组小鼠脂肪组织中TNF-α和IL-6的mRNA水平显着高于对照组(TNF-α，P<0.05；IL-6；P<0.01)。而这些促炎性细胞因子水平在茯苓酸治疗组(TNF-α，P＝0.09；IL-6；P<0.01)中显著恢复到接近正常水平。而二甲双胍处理小鼠脂肪组织(TNF-α，P＝0.9；IL-6；P＝1)没有得到显著的改善。与此对应，与模型组相比，茯苓酸治疗组和二甲双胍治疗组小鼠脂肪组织中的这些炎症因子在蛋白质的表达水平上也有所下降，尽管没有统计学意义。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合。为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。
SEQUENCE LISTING
<110> 厦门大学
<120> 一种茯苓酸或茯苓酸衍生物用于制备治疗多囊卵巢综合症药物的应用及药物
制剂
<130> XMDX-18015-CNI
<160> 14
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
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<212> DNA
<213> 人工合成
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