本发明属于药物治疗领域，具体涉及雷美替胺在制备治疗缺血性脑损伤药物中的相关用途。
背景技术：
脑卒中，是一类由脑部血供障碍引起，以快速局灶性脑功能缺失为特征的脑血管疾病。据统计，所有卒中类型中约87％为缺血性脑卒中，其病理生理机制极为复杂，临床上除缺血后短时间内进行溶栓外，尚无较好的治疗手段。然而，溶栓的时间窗窄，多数患者会因各种原因而不幸错过脑缺血后的黄金治疗期，继而形成永久性的缺血病灶，影响正常神经功能。因此，亟需寻找脑缺血后的重要病理环节及有效的药物调控靶点。
雷美替胺是一种安全、有效的新型抗失眠症药物。相比于激动GABAA受体的苯二氮卓类药物，雷美替胺通过激动褪黑素受体发挥作用，中枢神经系统不良反应很少。近期有研究发现，褪黑素受体可能是重要的脑缺血药物治疗新靶点，雷美替胺与褪黑素受体的亲和力是褪黑素本身的17倍以上，但雷美替胺是否具有潜在的抗脑缺血作用尚不明确，且迄今未见雷美替胺或其类似物用于缺血性脑卒中或脑梗塞治疗的相关研究及报道。此外，脑缺血损伤包括急性缺血性脑卒中和慢性脑梗塞后的神经功能障碍，临床上针对这两种疾病的治疗方案常有较大区别，对急性脑缺血主要是控制脑梗死体积，而对慢性脑梗主要是促进功能恢复。因此，深入揭示雷美替胺针对这两类疾病的有效治疗剂量及精准给药时间窗，并明确其具体药效机制，将有助于推动雷美替胺用于缺血性脑损伤治疗的新适应症申报，也为缺血性脑损伤的防治提供新的途径与策略。
技术实现要素：
本发明的目的是提供雷美替胺的一种新治疗用途——抗缺血性脑损伤。本发明通过构建动物的脑缺血模型，利用传统药理学及分子生物学手段，从整体、细胞和分子水平等多个层面证实雷美替胺具有显著的抗永久性脑缺血作用，并提出其用于急性缺血性脑卒中治疗的黄金给药时间窗为发病后6小时以内。此外，对于脑缺血后期的神经功能恢复，雷美替胺也表现出显著的改善效应，提示雷美替胺对急性或慢性脑缺血损伤均具有突出的治疗作用。
本发明采取如下技术方案：
雷美替胺在制备治疗缺血性脑损伤药物中的应用。
进一步，所述雷美替胺可用于制备治疗急性缺血性脑卒中药物。
进一步，所述雷美替胺可用于制备治疗慢性缺血性脑损伤药物。
优选的，所述药物可以为雷美替胺的各种剂型，可以为口服剂、外用剂、注射剂或复方制剂等。药物中可包括雷美替胺和药用可接受的载体。
更进一步，所述药物中的雷美替胺为脂质体雷美替胺、雷美替胺的盐或雷美替胺复合物。
所述雷美替胺可用于制备抑制急性脑缺血过程中的细胞自噬药物，也可用于制备减轻脑内炎症损伤药物。雷美替胺也可用于制备缺血性脑损伤后期的神经功能恢复药物。
本发明中雷美替胺用于治疗脑缺血的原理：雷美替胺通过激动MT2褪黑素受体，抑制缺血脑区神经元的自噬水平，进而减少神经元的自噬性死亡；此外，雷美替胺还能抑制脑缺血所继发的炎症因子释放，降低炎症性的细胞损伤，最终发挥抗脑缺血损伤的作用
本发明的有益效果主要体现在：提供了雷美替胺的新治疗用途，并为其新适应症的申报提供了基础。
附图说明
图1为雷美替胺剂量依赖性抗永久性脑缺血损伤的实验结果图，图1的A图为灌胃给予不同剂量的雷美替胺，小鼠pMCAO 24h后的脑梗死体积照片，图1的B图为脑梗死体积柱形对比图，图1的C图为模型动物的神经症状评分柱形对比图。B图和C图中，**P<0.01,***P<0.001v.s pMCAO组，Ram＝雷美替胺(n＝6)
图2为pMCAO造模后的不同时间点给药的实验结果图，图2的A图为脑梗死体积照片，图2的B图为脑梗死体积柱形对比图，图2的C图为神经症状评分柱形对比图。*P<0.05,**P<0.05v.spMCAO组，Ram＝雷美替胺(n＝6)
图3为MT2褪黑素受体抑制剂4-P-PDOT对雷美替胺抑制作用实验结果图，图3的A图为为脑梗死体积照片，图3的B图为脑梗死体积柱形对比图，图3的C图为神经症状评分柱形对比图。*P<0.05v.s雷美替胺给药组，Ram＝雷美替胺(n＝6)
图4为western blot法检测pMCAO 24h后，各组别动物脑内炎症因子IL-1β和TNF-α的表达的实验结果图，图4的A图为条带显影照片，图4的B图为IL-1β条带光密度和GAPDH对照的百分比柱形对比图，图4的C图为TNF-α条带光密度和GAPDH对照的百分比柱形对比图。*P<0.05v.s pMCAO组，,+P<0.05,++P<0.01v.s雷美替胺组，Ram＝雷美替胺(n＝3)
图5为光栓法研究雷美替胺促进小鼠脑缺血后的神经功能恢复的实验和结果图，图5的A图为小鼠错步试验照片，图5的B图为小鼠趴壁试验照片。图5的右上图为小鼠错步试验中错步率随时间变化的曲线图，图5的右下图为小鼠趴壁试验中趴壁率随时间变化的曲线图。Ram＝雷美替胺(n＝12)
图6为自噬相关蛋白(SQSTM1和LC3)的表达检测照片。
具体实例方式
下面结合实施例和附图对本发明的技术方案作详细说明，但本发明的保护范围不限于此。
实施例1：雷美替胺剂量依赖性抗永久性脑缺血损伤的作用
小鼠永久性脑缺血模型
局灶性脑缺血采用线栓法阻塞C57BL/6小鼠大脑中动脉(MCAO)。结扎并剪断颈外动脉分支，将线拴插入Willian’s环，阻塞大脑中动脉的起始部，假手术组尼龙线只插入0.5cm左右，线留置24h。同时利用多普勒激光脑血流仪对梗死脑区血流情况进行监测，缺血后血流降至其基础值20％以下的动物入选。
神经症状评分及脑梗死体积测算
以神经症状评分评价神经功能损伤程度；TTC染色脑损伤面积/体积计算梗死体积，为排除脑水肿带来的误差，结果以(对侧体积-缺血侧非梗死体积)/对侧体积×100％表达。
利用小鼠局灶性永久性脑缺血模型(permanent MCAO,pMCAO)，予术前给予不同剂量(0.3mg/kg，1mg/kg，3mg/kg)的雷美替胺，缺血24h后观察各组动物的神经症状并评分。取脑后，以TTC染色法测算脑梗死体积。结果发现，雷美替胺可剂量依赖地减少模型小鼠的脑梗死体积，并降低神经症状评分(图1)，提示雷美替胺具有抗急性脑缺血损伤的作用。**P<0.01,***P<0.001v.spMCAO组，Ram＝雷美替胺(n＝6)
实施例2：雷美替胺抗永久性脑缺血损伤的最佳给药时间窗
利用pMCAO模型，分别在pMCAO造模后的不同时间点(0h，4h，6h)给予3mg/kg雷美替胺，考察缺血后不同时间点各组动物的神经症状并评分。取脑后，以TTC染色法测算脑梗死体积。结果发现，小鼠脑缺血后6h内给药均可显著降低脑梗死体积(图2)，提示急性脑缺血后的0-6h为雷美替胺治疗的最佳给药时间窗。*P<0.05,**P<0.05v.s pMCAO组(n＝6)
实施例3：MT2褪黑素受体抑制剂4-P-PDOT有效抑制雷美替胺的脑保护作用
利用pMCAO模型，术前腹腔注射特异性MT2褪黑素受体抑制剂4-P-PDOT，再灌胃给予雷美替胺，缺血24h后观察各组动物的神经症状并评分。取脑后，以TTC染色法测算脑梗死体积。结果发现，同时给予4-P-PDOT和雷美替胺的小鼠的脑梗死体积和神经症状评分均明显大于单用雷美替胺组(图3)，提示4-P-PDOT能有效抑制雷美替胺的抗脑缺血作用。*P<0.05v.s雷美替胺给药组(n＝6)
实施例4：雷美替胺抑制脑缺血后继发的炎症因子释放
Western blot法
待测组织或细胞样本，按常规方法提取蛋白，进行SDS-PAGE分离蛋白，电转蛋白至固相载体后，加入特异性一抗和二抗。采用ECL法检测印迹膜，在暗室内压片。以GAPDH为内参，QuantityOneTM 4.2.2(Bio-Rad)软件分析条带光密度，结果以对照组的百分率表示。
在pMCAO模型中，western blot检测预给予雷美替胺和4-P-PDOT后，炎症因子IL-1β和TNF-α的表达变化，发现pMCAO组两种炎症因子的表达均为假手术组的1.5倍左右，雷美替胺有效抑制炎症因子释放，可使两者表达量下降至假手术组的50％，明显降低两种炎症因子的蛋白水平。同样的，此效应也可被4-P-PDOT所拮抗(图4)，提示雷美替胺能有效缓解脑缺血继发的炎症性损伤。*P<0.05v.spMCAO组，,+P<0.05,++P<0.01v.s雷美替胺组(n＝3)
实施例5：雷美替胺促进小鼠脑缺血后的神经功能恢复
小鼠光栓缺血模型
小鼠麻醉后固定头部，暴露其顶部颅骨，将一直径5mm的光导纤维固定紧贴在颅骨上方。小鼠腹腔注射2.5mg/kg的玫瑰红素，并同时用冷光源照射颅骨15min。玫瑰红素在光照下损伤血管内皮细胞，造成局部血管内凝血，从而导致大脑皮层急性局灶性缺血。
小鼠错步试验
将小鼠置于40cm边长、内部1cm见方的网格上，网格由直径1mm的铁丝制成，离地高度30cm。网格底部设置一摄像头，拍摄小鼠在网格上的自由活动，正常小鼠自由运动时前后足均踩踏于铁丝上，由于脑缺血影响，缺血脑对侧前后足踏空网格，每踏空一步记为错步一次。拍摄小鼠自由活动总步数100步，记录错误步数并计算错步率，错步率为错误步数占总步数的百分比。
小鼠趴壁试验
设置一透明有机玻璃圆筒，筒内径15cm，高25cm，将小鼠置于筒内，小鼠自发探索时双前爪均趴于筒壁上，由于脑缺血影响，对侧前爪呈现缩回、仅单侧前爪趴壁状态。分别记录5min内小鼠右侧前爪趴壁时间和左侧前爪趴壁时间：
临床上大部分急性脑缺血患者无法得到及时的溶栓治疗，故急性缺血损伤后期的神经功能恢复对于患者今后的生活质量则显得更为重要。由于pMCAO造模损伤大，动物术后恢复差、死亡率高，故构建新型光栓法作为评价小鼠缺血后恢复阶段的动物模型。造模后每天给予雷美替胺3mg/kg，光栓造模后d0、d1、d3、d5、d7、d9、d11、d13、d15连续进行错步试验和趴壁试验，分别记录各组动物的错误步数占总步数的百分比和趴壁率。结果发现，动物的神经症状在脑缺血后的第一天最重，随后会有一定程度的恢复。在所有时间点中，雷美替胺给药组动物的行为学表现均明显好于模型组，而4-P-PDOT同时给药能有效抑制雷美替胺的药效(图5)，提示雷美替胺对脑梗塞后期的神经功能恢复也具有显著的促进作用(n＝12)
实施例6：雷美替胺经MT2褪黑素受体抑制神经元自噬
利用pMCAO模型，造模前同时给予雷美替胺及4-P-PDOT，检测自噬相关蛋白(SQSTM1和LC3)的表达，发现雷美替胺显著上调了SQSTM1和LC3-II蛋白的水平，表明脑组织的自噬降解受到了抑制，而引起LC3-II蛋白的堆积，提示雷美替胺抑制了脑缺血过程中的自噬，而预给4-P-PDOT则能降低SQSTM1和LC3II的水平，提示其可有效拮抗雷美替胺的自噬抑制作用(图6)。自噬是细胞通过溶酶体机制对胞内成分的分解代谢过程。前期研究发现，抑制永久性脑缺血过程中的自噬，有助于减轻脑组织损伤，改善神经功能。上述结果表明，雷美替胺的抗脑缺血作用是通过激动MT2褪黑素受体，抑制缺血脑区的细胞自噬，最终减轻神经元的自噬性损伤实现的(n＝3)。