本发明涉及生物医药
技术领域：
，具体涉及25-羟基维生素D3在制备治疗或预防肝性骨病药物中的应用。
背景技术：
：25-羟基维生素D3又名骨化二醇，化学名：(3β,5Z,7E)-9,10-开环胆甾-5,7,10(19)-三烯-3,25-二醇一水合物，其结构式如下：维生素D(vitaminD)是一类脂溶性维生素，属固醇类衍生物，是包括人类在内的高等动物生命必需的重要营养素。维生素D主要的生理功能是调节体内钙、磷代谢并维持血浆钙、磷水平稳定，参与个体牙齿和骨骼的正常生长发育。维生素D主要包括五种化合物，分别为维生素D1、D2、D3、D4和D5，家族成员中最重要的是D2和D3，通常所说的维生素D即指这两种形式。维生素D2(麦角钙化醇)主要来源于蘑菇，牛油果等植物性食物；维生素D3(胆钙化醇)一方面由皮肤中的7-脱氢胆固醇通过阳光中的紫外线照射裂解转化而来，一方面来源于人摄取的动物性食物，如海鱼,蛋黄和黄油等。这两种形式的维生素D并没有生物活性，须与血液中的维生素D结合蛋白(VDBP)结合后，在肝脏中分别代谢成体内储备形式的25-羟基维生素D，包括25-羟基维生素D2和25-羟基维生素D3(骨化二醇)。25-羟基维生素D在肾脏转换为具有生物活性的代谢物1,25-二羟基维生素D，行使激素功能(D-荷尔蒙)。D-荷尔蒙调节肠道的钙吸收，骨骼的矿物质化,成骨细胞的分化和骨质合成，此外该激素还会影响神经肌肉的功能。作为维生素D在体内的主要储存形式，血清中的25-羟基维生素D浓度可以作为人体维生素D含量的最佳指标。美国医学科学院推荐25-OH-D的血浓度大于30ng/ml有利于骨骼健康，文献JournalofClinicalEndocrinology&Metabolism,2005,90(6):3215-3224.将维生素D缺乏定义为血清25-OHD水平低于30ng/ml，不足为21-29ng/ml，低于20ng/ml为严重不足，充足为30ng/ml以上，而大于150ng/ml可能会导致中毒。肝性骨病(hepaticosteodystrophy)，简称HO，慢性肝脏疾病(CLD)患者中出现骨矿物质密度(BMD)整体改变的一种代谢性骨骼疾病。表现为骨软化症、骨质疏松症或骨矿物密度偏低，骨折发生率是同等年龄正常人的2倍。肝性骨病是慢性肝脏疾病(慢性肝炎)患者常见而又经常被忽视的并发症。常见的肝病有肝炎、肝硬化、肝脓肿、原发性肝癌等，肝炎主要以慢性肝炎为主，按病因学分为慢性病毒性肝炎、自身免疫性肝炎、药物毒性肝炎、遗传性疾病以及其它原因不明的慢性肝炎。而病毒性肝炎以乙型肝炎最为常见，乙肝病毒是一种世界性传染疾病，据统计全球携带乙肝表面抗原的人数超过2.8亿，中国是乙肝的高发区，目前有现症的慢性乙型肝炎约3000万人，每年国内死于乙肝后肝硬化者有40万人。肝性骨病可严重影响患者的生活质量和长期预后。肝性骨病的病因是多因素的，根据基础肝脏疾病的不同其病因和严重程度也不同，肝性骨病在慢性肝脏疾病患者中的发病率约为20％～50％，可发生于慢性胆汁淤积性肝病、慢性病毒性肝炎和肝硬化、酒精性肝病、血色病、肝脏良恶性肿瘤及肝移植等患者中。其中慢性胆汁淤积性肝病、慢性病毒性肝炎和病毒性肝硬化的平均患病率约为13％-70％、20％和55％。依据病因可以将慢性肝炎做如下分类：慢性乙型肝炎(chronichepatitisB,慢性丙型肝炎(chronichepatitisC,CHC)，自身免疫性肝炎(autoimmunehepatitis,AIH)，慢性酒精性肝病(alcoholicliverdisease,ALD)，药物性肝病：又称药物性肝损害(druginducedliverinjury,DILI)。依据病情轻重，可以将慢性肝炎分为轻、中、重度以及慢性重型肝炎。慢性肝脏疾病的患者出现骨痛、背痛、身高变矮、脆性骨折、脊柱后凸/脊柱侧弯进行骨代谢标志物和骨矿物质密度(BMD)检测。骨密度(BMD)是指单位体积(体积密度)或单位面积(面积密度)的骨量，二者通过无创技术对活体进行测量。目前国际公认的骨密度检查方法是双能X线吸收法(dual-energyX-rayabsorptiometry,DEXA)，其测定值T值为诊断的金标准。基于DXA测定：骨密度值低于同性别、同种族正常成年人骨峰值不足1个标准差属正常；降低1～2.5个标准差为骨量低下(骨量减少)；降低程度等于或大于2.5个标准差为骨质疏松。符合骨质疏松诊断标准同时伴有一处或多处骨折时为严重骨质疏松。骨密度通常用T-Score(T值)表示，T值＝(测定值-骨峰值)/正常成人骨密度标准差。T值用于绝经后妇女和50岁以上的男性的骨密度水平。对于儿童、绝经前妇女和50岁以下的男性，其骨密度水平建议用Z值表示。Z值＝(测定值-同龄人骨密度均值)/同龄人骨密度标准差。不同程度的肝组织坏死和炎症反应，随后发生肝纤维化，最终可发展为肝硬化。目前评估肝脏的慢性损伤程度，仍然主要依靠肝组织活检，即通常所说的肝穿来实现。慢性肝炎的病理改变分为肝组织炎症活动坏死程度的分级(G)和纤维化程度的分期(S)。炎症活动度分级(Grade,G)为4级(G1～4).G1为轻微活动,G2轻度活动,G3中度活动,G4重度活动.G1-2为肝脏有轻度炎症活动，G3-4提示肝脏坏死严重；纤维化程度分期(Stage,S)为4期(S1～4)。S1期：肝小叶汇管区纤维化，病变较轻，S4期为肝硬化，病变较重。正常的骨代谢是骨组织不断进行改建活动的一个复杂过程，主要包括破骨细胞介导的骨吸收和成骨细胞介导的骨形成，骨吸收和骨形成主要由1,25-二羟基维生素D介导，当体内的维生素D储存形态的25-羟基维生素D，主要是25-羟基维生素D3和25-羟基维生素D2，偏低时肾脏不足以代谢生成活性的1,25-二羟基维生素D时而引起骨病。92％慢性肝病患者25-羟基维生素D含量低于30ng/ml，因肝脏功能低下或者缺失，肝脏中CYP2A1酶功能低下，使25-羟基维生素D含量偏低。目前可获得的口服维生素D补充剂只有维生素D3和维生素D2，慢性肝病患者不能有效利用维生素D2和维生素D3。维生素D及其衍生物因有特殊的共轭三烯的结构，如下图所示：该特殊的结构对光、热及空气均不稳定，制剂上一般做成软胶囊，会光照转化为反式的维生素D衍生物。用于医疗用途时，其稳定性尤为重要，以确保货架期是安全有效的，特别是光照产生反式的维生素D。已知的遮光的方法是在软胶囊中加入二氧化钛，然而改方法不能有效的达到药用的要求。技术实现要素：本发明的目的在于提供25-羟基维生素D3在制备治疗和预防肝性骨病药物中的应用。优选的，所述肝性骨病包括急慢性肝病患者表现的骨软化症、骨质疏松症或骨矿物密度偏低。优选的，所述肝性骨病包括慢性或急性肝病患者的骨矿物质密度降低的代谢性骨骼疾病。优选的，所述肝性骨病患者包括肝性病变引发的血液中的25-羟基维生素D含量低于40ng/ml的患者。优选的，所述25-羟基维生素D3能显著提高和维持肝性骨病患者的骨矿物质密度；或能显著降低肝脏病变患者骨矿物质密度降低速率。优选的，所述25-羟基维生素D3的用量范围为0.05～12μg/kg体重。优选的，所述25-羟基维生素D3的用量范围为0.2～1μg/kg体重。优选的，所述25-羟基维生素D3的剂型包括软胶囊。优选的，所述软胶囊中25-羟基维生素D3的含量为0.001～0.05％。优选的，所述软胶囊中25-羟基维生素D3的含量为0.003～0.006％。本发明的第二目的在于提供一种药物组合物，包括0.5～5μg/kg体重的25-羟基维生素D3以及其他药学上可接受的辅料。本发明公开了一种生产一水合25-羟基维生素D3的方法，所述的方法为将7-脱氢-25-羟基胆固醇用高压汞蒸气汞灯光照的制备方法。所述的方法还包括将光反应的浓缩液用C8硅胶色谱柱纯化的方法。所述色谱为内径80mm，长500mm粒径为5μm的C8硅胶柱。所述的纯化方法是以80％甲醇的水溶液为流动相。本发明还公开了一种一水合25-羟基维生素D3的纯化方法。所述方法为95％重结晶的方法。制备的一水合25-羟基维生素D3经单晶衍射显示为一水合物。所述一水合物与25-羟基维生素D3的3位羟基形成氢键的结构特征。本发明公开了一种一水合25-羟基维生素D3的软胶囊制备方法。本发明还公开了一种确保25-羟基维生素D3的光稳定性和热稳定，适用于生产的软胶囊剂。发明人经过深入研究，发现25-羟基维生素D3对光、热及空气均不稳定，易被光照生成反式-25-羟基维生素D3，热异构成前-25羟基维生素D3。本发明人经大量的实验发现，在制备软胶囊过程中全程惰性气体保护及添加抗氧化剂可避免25-羟基维生素D3氧化；其中惰性气体包括氩气、氮气，最优选为氩气；抗氧化剂主要指2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚(BHT)及丁基羟基茴香醚(BHA)，更优选的是BHT。本发明人等通过深入研究，结果发现在25-羟基维生素D3的软胶囊的胶囊壳中含有白色颜料和黄色氧化铁和红色氧化铁、或者是焦糖，可达到遮蔽关照的效果，以提高25-羟基维生素D3的光稳定性。6个月稳定期内，反式-25-羟基维生素D3的含量低于0.1％。本发明还公开了一种制备反式-25-羟基维生素D3的方法。所述的方法为将25-羟基维生素D3用高压汞蒸气汞灯光照的制备方法。所述的方法还包括将光反应的浓缩液用C8硅胶色谱柱纯化的方法。所述色谱为内径80mm，长500mm粒径为5μm的C8硅胶柱。所述的纯化方法是以80％甲醇的水溶液为流动相。本发明的有益效果在于首次发现和证实了25-羟基维生素D3对治疗或预防肝性骨病具有良好的效果，有望开发为治疗或预防肝性骨病的药物。附图说明图1为一水合25-羟基维生素D3的单晶结构图；图2为25-羟基维生素D3和反-25-羟基维生素D3混合液相图谱图。具体实施方式以下结合实施例对本发明作进一步作具体描述，但不局限于此。实施例1：(3β,5Z,7E)-9,10-开环胆甾-5,7,10(19)-三烯-3,25-二醇一水合物(骨化二醇一水合物)的制备在5L光化学反应器中，加入7-脱氢-25-羟基胆固醇100g，加四氢呋喃5L溶解，降温到-20℃，氮气流下，经Vycor过滤器用具有高压汞蒸气的1000瓦UV灯光照5h，制得前-25-羟基维生素D3，不经分离，在氮气保护下加热回流3h。减压浓缩后，将残余物用甲醇200ml溶解，以形成供分离的样品。分5次用制备色谱纯化，所述色谱为内径80mm，长500mm粒径为5μm的C8硅胶柱。以80％甲醇的水溶液为流动相，流速100ml/min，在265nm下检测，收集含25-羟基维生素D3的组分。连续重复5次，总共得馏分约30L。减压浓缩到5L，过滤所得固体。所得固体用95％乙醇重结晶，80℃真空干燥，得纯白色固体一水合25-羟基维生素D3(28.5g，收率27.2％)。单晶结构如附图1所示，其中一个水分子与3为羟基形成氢键。HPLC纯度：99.8％(265nm)UV(EtOH):λmax265.5nm(ε25210)1HNMR(CDCl3)δ：6.24(d,J＝11.3Hz,1H,6-CH),6.03(d,J＝11.2Hz,1H,7-CH),5.06(s,1H,19-CH),4.82(d,J＝1.6Hz,1H,19-CH),3.95(m,1H,3-CH),2.81-2.84(m,1H),2.56-2.59(m,1H),2.38-2.42(m,1H),2.29(dd,J＝7.6,13.0Hz,1H),2.16-2.21(m,1H),1.22-2.02(m,22H),1.22(s,6H),0.93(d,J＝6.4Hz,3H,21-CH3),0.54(s,3H,18-CH3)。13CNMR(CDCl3)δ：144.96,142.34,134.95,122.41,117.35,112.46,71.15,69.05,56.32,56.33,45.91,45.87,44.30,40.50,36.27,36.09,35.05,31.88,29.31,29.14,28.95,27.66,23.52,22.19,20.71,18.74,11.92。ESI-MS(m/z):423.38[M+Na]+,823.76[2M+Na]+。HPLC纯度测定：将纯白色固体配制成1mg/ml样品色谱柱：watersC18，4.6mm×150mm,5μm。流动相：甲醇:水＝800:200(V:V)。流速：1.5ml/min。检测波长：265nm。进样量：5μL。实施例2：(3β,5E,7E)-9,10-开环胆甾-5,7,10(19)-三烯-3,25-二醇一水合物(反式-25-羟基维生素D3)的制备在1L光化学反应器中，加入5g一水合25-羟基维生素D3，加甲醇1L溶解，降温到-20℃，氮气流下，经Vycor过滤器用具有高压汞蒸气的1000瓦UV灯光照5min，HPLC检测，约有5％反式25-羟基维生素D3生成，HPLC图谱见附图2。减压浓缩后，将残余物用甲醇20ml溶解，以形成供分离的样品。用制备色谱纯化，所述色谱为内径80mm，长500mm粒径为5μm的C8硅胶柱。以80％甲醇的水溶液为流动相，流速100ml/min，在265nm下检测，收集含反式的25-羟基维生素D3的组分。总共得馏分约3L。减压浓缩得固体反式25-羟基维生素D3(0.15g，收率3％)。HPLC纯度：97.1％。1HNMR(CDCl3)δ：6.60(d,J＝11.3Hz,1H,6-CH),5.88(d,J＝11.2Hz,1H,7-CH),5.12(s,1H,19-CH),4.95(d,J＝1.6Hz,1H,19-CH),3.95(m,1H,3-CH),2.81-2.84(m,1H),2.56-2.59(m,1H),2.38-2.42(m,1H),2.29(dd,J＝7.6,13.0Hz,1H),2.16-2.21(m,1H),1.22-2.02(m,22H),1.22(s,6H),0.93(d,J＝6.4Hz,3H,21-CH3),0.54(s,3H,18-CH3)。实施例3在氩气保护下，将含量99.8％的一水合25-羟基维生素D3重量1.503g溶于300g无水乙醇中，加5.625克BHT制备得到重量比为0.4884％的乙醇溶液，用高效液相检测溶液含量，根据含量进行调整。再向其中加入约29692.872g椰子油分馏甘油三酯，制备得到含量重量比为0.005％的一水合25-羟基维生素D3的油性溶剂，并用高效液相检测含量，相对偏差控制在3％以内,pH＝4.5。另外，将明胶7600g、甘油2200g、纯化水10000g、氧化钛200g及红色氧化铁60g加热搅拌调制成明胶溶液。用连续式软胶囊制造机对上述一水合25-羟基维生素D3的油性溶液进行包囊以制备软胶囊。得到的软胶囊每个平均重量1.0g，内含溶剂600mg。每个胶囊含一水合25-羟基维生素D330微克，装量差异±10％。光加速试验：将上述实施例中制造的软胶囊在3500勒克斯的荧光灯下放置180小时，约总照度为60万勒克斯小时，使用高效液相色谱仪测定含量，测定含量除以0.005％以计算残存率。反式25-羟基维生素D3含量为0.08％。残存率98.7％。含量测定条件：装置:waters高相液相，配UV检测器。色谱柱：watersC18，4.6mm×150mm,5μm。流动相：甲醇:水＝800:200(V:V)。流速：1.5ml/min。检测波长：265nm。进样量：500uL。长期试验：将上述实施例中制造的软胶囊分别在25、40℃下保存1个月、3个月、6个月，使用上述含量测定方法测定其残存率。测定结果如表1所示，本发明具有足够的热稳定性。表1：实施例4：25-羟基维生素D3用于治疗肝性骨病的动物实验以四氯化碳长期注射诱导产生慢性肝炎，以双能X线吸收法(dual-energyX-rayabsorptiometry,DEXA)，其测定值Z值为诊断小鼠。Z评分表示受检测者骨密度与同性别骨峰值的差别，Z评分低于正常参考值2.5个标准差及以上时称为骨质疏松，Z评分降低，介于1～2.5个标准差定义为骨量减少。1、材料和方法1.1实验小鼠：C57/6BL小鼠，雄性，体重20～24g，每组10只/笼群养，共分8组。购于上海斯莱克实验动物有限责任公司，实验动物质量许可证号：SCXK(沪)2007-0005，饲养于清洁级动物房，喂养条件包括标准饲料，自来水，室温保持在(24±2)℃，湿度50-60％，每日光照与黑暗时间各12h。1.2分组及造模方法随机将小鼠分为实验9组，每组8只。实验周期16周。四氯化碳给药：腹腔注射20％四氯化碳(CCl4)乙醇溶液，5ml/kg,每周2次，连续注射16周。2、药物试剂四氯化碳及乙醇够于国药集团化学试剂有限公司。25-羟基维生素D3自制，方法见实施例1。配制：25-羟基维生素D3(25-OH-D3)：含量重量比为0.005％的一水合25-羟基维生素D3的油性溶剂，见实施例3。每天一次，口腔灌注。四氯化碳：20％四氯化碳(CCl4)乙醇溶液，每周两次，腹腔注射。3、分组：试验分为12组，治疗组合预防组。如表2和3所示：表2编号分组小鼠只数CCl425-OH-D3时间1空白组12002～13w2预防对照组105ml/kg02～13w3预防组a105ml/kg0.3μg/kg/d2～13w5预防组b105ml/kg1.5μg/kg/d2～13w6预防组c105ml/kg6μg/kg/d2～13w7预防组d105ml/kg12μg/kg/d2～13w表3试验结束，将老鼠用脊椎脱臼法处死，测小鼠胫骨测Z值。以目前国际公认的骨密度检查方法是双能X线吸收法(dual-energyX-rayabsorptiometry,DEXA)，其测定值Z值。基于DXA测定：骨密度值低于同性别、同种族正常成年人骨峰值不足1个标准差属正常；降低1～2.5个标准差为骨量低下(骨量减少)；降低程度等于或大于2.5个标准差为骨质疏松。符合骨质疏松诊断标准同时伴有一处或多处骨折时为严重骨质疏松。Z值＝(测定值-空白组骨密度均值)/空白组骨密度标准差表4诊断Z值正常＞-1骨量低下-1～-2.5骨质疏松＜-2.525-羟基维生素D含量测定：取眼球血，-70℃液氮保存，以25-羟基维生素D2为内标，用LC-MS/MS测量，25-羟基维生素D包含25-羟基维生素D2和25-羟基维生素D3。测定值如表5所示：表5没有服用25-羟基维生素D3的预防对照组和治疗对照组，体内25-羟基维生素D3含量显著低于空白组和预防组a、预防组b、预防组c、预防组d及治疗组治疗组Ⅰ、治疗组Ⅱ、治疗组Ⅲ、治疗组Ⅳ。口服25-羟基维生素D3能显著提高肝性骨病小鼠体内的25-羟基维生素D水平。同时注射四氯化碳及25-羟基维生素D3每天1.5μg/kg以上，13周以内，肝性骨病发病率显著降低。肝性骨病病变小鼠在14周起，停止腹腔注射四氯化碳，开始服用25-羟基维生素D3每天1.5μg/kg以上，能治疗因肝病引起的骨质疏松。本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。当前第1页1 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