本发明涉及一种掺锶的多孔丝素微球的制备方法，属于生物医用材料
技术领域：
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背景技术：
：骨、软骨组织对人体起着非常重要的支持、保护等作用，传统的骨修复方法是利用自体骨和异体骨进行骨移植治疗，这样的方法不仅受限于供骨资源，且价格昂贵，同时使用异体骨还容易产生免疫排斥等不良反应。随着组织工程和再生医学的发展，其在骨再生方面已取得了巨大成功，再生的骨具有正常的功能和生物活性。在骨修复过程中，需要构建负载细胞及生长因子的三维支架，如多孔海绵支架、纤维网格支架和水凝胶等，相比于这些支架形式，微载体具有可直接注射于组织缺陷部位而免除外科手术过程的优点，同时作为细胞载体，它可以扩大细胞的三维培养、提高细胞培养面积并维持细胞表型。其中多孔微载体表面具有开孔，内部具有贯通孔结构，可方便细胞进入到微载体内部，避免细胞在培养过程中造成损伤。此外，多孔微载体还可以加强细胞营养物质和代谢产物运输，为细胞生长提供更多比表面积，能极大地提高细胞接种数量。丝素蛋白是由18种人体氨基酸组成的一种天然大分子蛋白，在体内能被分解重新降解成单体氨基酸，降解产物无毒，且能被吸收。相比于常用的合成材料如聚乳酸等，丝素蛋白可以模拟组织中蛋白质组分和功能，且具有良好的生物相容性、降解性和易加工修饰、低免疫原性等优点，更易于满足生物材料的要求。锶是骨骼组成的重要微量元素，具有促进成骨和抑制破骨的作用。锶还可以促进多功能干细胞向成骨细胞分化，能提高骨矿物质密度，增强骨硬度、骨诱导能力及骨传导性，最终改善骨微细结构和骨质量，促进新骨再生与修复。技术实现要素：本发明针对现有微载体在组织工程应用中存在的制备材料性能不稳定和结构形貌研究不够完善等主要问题，结合丝素蛋白优势特点，提供了一种以丝素蛋白和氯化锶为主要材料，采用乳液法结合冷冻干燥技术制备的掺锶丝素蛋白基多孔微球。本发明制备的掺锶丝素多孔微球主要用于骨的修复，可有效避免细胞流失、骨量不足等问题，增强对关节骨的支撑。本发明的具体技术方案如下：本发明公开了一种掺锶的丝素多孔微球，多孔微球的组成成分是丝素和氯化锶，所述的多孔微球的孔隙率在80％以上，孔径为5-40μm，氯化锶重量比占总重量的5％-38％。本发明是一种制备掺锶多孔丝素微球的方法，所采用的具体制备步骤如下：1)将蚕茧剪碎、脱胶、溶解后，再经过过滤、透析、浓缩成丝素蛋白溶液；2)取石油醚于烧杯中，在-30℃—-50℃预冷3.5h以上；在这个温度范围和时间内才能做出来，温度太低太高形貌都会变化，时间太短冷冻效果不好，也无法成型。3)再另取石油醚于新烧杯中，加入乳化剂，使两者混合均匀；4)将2％-6.5％(w/v)丝素蛋白溶液、0.1％-4％(w/v)氯化锶混合均匀，加入3)中的溶液，搅拌成均匀球形；掺锶的好处在于：目前研究主要是在丝素蛋白材料中添加BMP-2等与干细胞体外向成骨细胞分化和成骨，及VEGF等与成血管有关细胞因子提高治疗效果。然而，细胞因子在临床应用中仍面临：半衰期短，释放浓度不易控制，主要从动物身上获得，代价高，易变质，常伴有免疫排斥反应等重要问题。因此，寻找新的促血管化和促进成体干细胞向成骨分化的组织工程来源因子，是采用组织工程技术修复骨缺损的研究热点；5)将4)溶液迅速倒入2)中预冷的石油醚中，再置于冷冻环境静置沉淀；6)在冷冻氛围下除去5)溶液中的石油醚，获得含冰晶的掺锶丝素蛋白微球，将该丝素蛋白微球进行冷冻，再通过冷冻干燥可获得干燥的掺锶的多孔丝素蛋白微球。作为进一步地改进，本发明所述的步骤6)中的掺锶多孔丝素蛋白微球通过后续醇类处理增强其力学性能。未经过醇类处理的丝素会溶于水中，同时此步有利于洗去残留的乳化剂。作为进一步地改进，本发明所述的掺锶多孔丝素蛋白微球根据生物矿化原理获得具有锶离子稳定缓释能力的碳酸锶矿化的丝素蛋白多孔微球。经过矿化，锶离子可以达到缓释效果，未经过矿化放入水中，锶离子会很快释放完，无法达到预期效果。与现有技术相比，本发明具有以下突出特点：1)优良的生物相容性：丝素蛋白作为一种天然蛋白分子，已普遍用于保健食品行业，不会对人体产生刺激作用；2)可注射性：丝素蛋白微球相比于水凝胶、多孔海绵支架等，可以直接注射于组织缺陷部位，可克服特殊部位、复杂结构等引起的骨缺损不易操作等问题；3)促进骨骼修复：锶是人体不可缺少的一种微量元素，具有成骨诱导等能力，可提高骨修复的效果；同时丝素蛋白作为细胞载体的主要材料，可模拟细胞外基质的蛋白成分；4)通过本发明制备得到的掺锶丝素多孔微球，可以进行锶的缓释，有效地克服了从动物身上获取生长因子使用存在等多种问题；5)成本低廉，环保无污染。具体实施方式下面通过具体实施例对本发明的技术方案作进一步的详细说明，以下实施例是对本发明的解释而本发明并不局限于以下实施例。实施例11)将蚕茧剪碎、脱胶、溶解后，再经过过滤、透析、浓缩成2％(w/v)的丝素蛋白溶液；2)取450ml石油醚于500ml烧杯中，在-50℃预冷4h；3)再取40ml石油醚于100ml新烧杯中，加入0.7mlspan-80，使两者混合均匀；4)将10ml的丝素蛋白溶液、0.01g氯化锶混合均匀，加入3)中的溶液，搅拌成均匀球形；5)将4)溶液迅速倒入2)中预冷的石油醚中，再置于-50℃静置沉淀；6)在冷冻氛围下除去5)溶液中的石油醚，获得含冰晶的掺锶丝素蛋白微球，将该丝素蛋白微球进行冷冻，再通过冷冻干燥可获得干燥的掺锶的多孔丝素蛋白微球。所得的多孔微球的组成成分是丝素和氯化锶，所述的多孔微球的孔隙率在80％以上，孔径为5μm—40μm，氯化锶重量比占总重量的5％-38％。实施例21)将蚕茧剪碎、脱胶、溶解后，再经过过滤、透析、浓缩成4％(w/v)的丝素蛋白溶液；2)取450ml石油醚于500ml烧杯中，在-50℃预冷4h；3)再取40ml石油醚于100ml新烧杯中，加入0.7mlspan-80，使两者混合均匀；4)将10ml的丝素蛋白溶液、0.01g氯化锶混合均匀，加入3)中的溶液，搅拌成均匀球形；5)将4)溶液迅速倒入2)中预冷的石油醚中，再置于-50℃静置沉淀；6)在冷冻氛围下除去5)溶液中的石油醚，获得含冰晶的掺锶丝素蛋白微球，将该丝素蛋白微球进行冷冻，再通过冷冻干燥可获得干燥的掺锶的多孔丝素蛋白微球。实施例31)将蚕茧剪碎、脱胶、溶解后，再经过过滤、透析、浓缩成6.5％(w/v)的丝素蛋白溶液；2)取450ml石油醚于500ml烧杯中，在-50℃预冷4h；3)再取40ml石油醚于100ml新烧杯中，加入0.7mlspan-80，使两者混合均匀；4)将10ml的丝素蛋白溶液、0.01g氯化锶混合均匀，加入3)中的溶液，搅拌成均匀球形；5)将4)溶液迅速倒入2)中预冷的石油醚中，再置于-50℃静置沉淀；6)在冷冻氛围下除去5)溶液中的石油醚，获得含冰晶的掺锶丝素蛋白微球，将该丝素蛋白微球进行冷冻，再通过冷冻干燥可获得干燥的掺锶的多孔丝素蛋白微球。实施例41)将蚕茧剪碎、脱胶、溶解后，再经过过滤、透析、浓缩成2.5％(w/v)的丝素蛋白溶液；2)取450ml石油醚于500ml烧杯中，在-50℃预冷4h；3)再取40ml石油醚于100ml新烧杯中，加入0.7mlspan-80，使两者混合均匀；4)将10ml的丝素蛋白溶液、0.01g氯化锶混合均匀，加入3)中的溶液，搅拌成均匀球形；5)将4)溶液迅速倒入2)中预冷的石油醚中，再置于-50℃静置沉淀；6)在冷冻氛围下除去5)溶液中的石油醚，获得含冰晶的掺锶丝素蛋白微球，将该丝素蛋白微球进行冷冻，再通过冷冻干燥可获得干燥的掺锶的多孔丝素蛋白微球。实施例51)将蚕茧剪碎、脱胶、溶解后，再经过过滤、透析、浓缩成2.5％(w/v)的丝素蛋白溶液；2)取450ml石油醚于500ml烧杯中，在-50℃预冷4h；3)再取40ml石油醚于100ml新烧杯中，加入0.7mlspan-80，使两者混合均匀；4)将10ml的丝素蛋白溶液、0.05g氯化锶混合均匀，加入3)中的溶液，搅拌成均匀球形；5)将4)溶液迅速倒入2)中预冷的石油醚中，再置于-50℃静置沉淀；6)在冷冻氛围下除去5)溶液中的石油醚，获得含冰晶的掺锶丝素蛋白微球，将该丝素蛋白微球进行冷冻，再通过冷冻干燥可获得干燥的掺锶的多孔丝素蛋白微球。实施例61)将蚕茧剪碎、脱胶、溶解后，再经过过滤、透析、浓缩成2.5％(w/v)的丝素蛋白溶液；2)取450ml石油醚于500ml烧杯中，在-50℃预冷4h；3)再取40ml石油醚于100ml新烧杯中，加入0.7mlspan-80，使两者混合均匀；4)将10ml的丝素蛋白溶液、0.2g氯化锶混合均匀，加入3)中的溶液，搅拌成均匀球形；5)将4)溶液迅速倒入2)中预冷的石油醚中，再置于-50℃静置沉淀；6)在冷冻氛围下除去5)溶液中的石油醚，获得含冰晶的掺锶丝素蛋白微球，将该丝素蛋白微球进行冷冻，再通过冷冻干燥可获得干燥的掺锶的多孔丝素蛋白微球。实施例71)将蚕茧剪碎、脱胶、溶解后，再经过过滤、透析、浓缩成2.5％(w/v)的丝素蛋白溶液；2)取450ml石油醚于500ml烧杯中，在-50℃预冷4h；3)再取40ml石油醚于100ml新烧杯中，加入0.7mlspan-80，使两者混合均匀；4)将10ml的丝素蛋白溶液、0.4g氯化锶混合均匀，加入3)中的溶液，搅拌成均匀球形；5)将4)溶液迅速倒入2)中预冷的石油醚中，再置于-50℃静置沉淀；6)在冷冻氛围下除去5)溶液中的石油醚，获得含冰晶的掺锶丝素蛋白微球，将该丝素蛋白微球进行冷冻，再通过冷冻干燥可获得干燥的掺锶的多孔丝素蛋白微球。实施例81)将蚕茧剪碎、脱胶、溶解后，再经过过滤、透析、浓缩成2.5％(w/v)的丝素蛋白溶液；2)取450ml石油醚于500ml烧杯中，在-30℃预冷4h；3)再取40ml石油醚于100ml新烧杯中，加入0.7mlspan-80，使两者混合均匀；4)将10ml的丝素蛋白溶液、0.2g氯化锶混合均匀，加入3)中的溶液，搅拌成均匀球形；5)将4)溶液迅速倒入2)中预冷的石油醚中，再置于-50℃静置沉淀；6)在冷冻氛围下除去5)溶液中的石油醚，获得含冰晶的掺锶丝素蛋白微球，将该丝素蛋白微球进行冷冻，再通过冷冻干燥可获得干燥的掺锶的多孔丝素蛋白微球。以下表格提供了对比例1-2与实施例2作对比，对比例1-2仅仅改变了丝素浓度这一技术特征，其余技术特征均与实施例2相同，从而通过形貌观察得出了丝素浓度的选择对于本发明技术方案的重要性。丝素浓度氯化锶含量形貌观察对比例11％0.01g微球容易崩塌，粘连严重实施例24％0.01g表面呈多孔状，内部有孔洞对比例27％0.01g孔径和孔隙率过小以下表格提供了对比例3与实施例4、7作对比，对比例3仅仅改变了氯化锶含量，其余技术特征均与实施例4相同，从而通过形貌观察得出了氯化锶含量选择对于本发明技术方案的重要性。丝素浓度氯化锶含量形貌观察实施例42.5％0.01g表面呈多孔状，内部有孔洞实施例72.5％0.4g表面呈多孔状，内部有孔洞对比例32.5％0.8g不能获得多孔微球以下表格提供了对比例4-5与实施例5作对比，对比例3仅仅改变了预冷温度这一技术特征，其余技术特征均与实施例5相同，从而通过形貌观察得出了预冷温度选择对于本发明技术方案的重要性。丝素浓度氯化锶含量预冷温度形貌观察对比例42.5％0.05g-20℃不能获得多孔微球实施例52.5％0.05g-50℃表面呈多孔状，内部有孔洞对比例52.5％0.05g-80℃孔径和孔隙率过小实施例91)将蚕茧剪碎、脱胶、溶解后，再经过过滤、透析、浓缩成2.5％(w/v)的丝素蛋白溶液；2)取450ml石油醚于500ml烧杯中，在-50℃预冷4h；3)再取40ml石油醚于100ml新烧杯中，加入0.7mlspan-80，使两者混合均匀；4)将10ml的丝素蛋白溶液、0.05g氯化锶混合均匀，加入3)中的溶液，搅拌成均匀球形；5)将4)溶液迅速倒入2)中预冷的石油醚中，再置于-50℃静置沉淀；6)在冷冻氛围下除去5)溶液中的石油醚，获得含冰晶的掺锶丝素蛋白微球，将该丝素蛋白微球进行冷冻，再通过冷冻干燥可获得干燥的掺锶的多孔丝素蛋白微球。7)将6)获得的多孔丝素微球与NH4HCO3混合放置2d后，用乙醇固定30min后，用去离子水冲洗干净乙醇和NH4HCO3，再经过冷冻干燥获得具有锶离子稳定缓释能力的碳酸锶矿化的丝素蛋白多孔微球。实施例101)将蚕茧剪碎、脱胶、溶解后，再经过过滤、透析、浓缩成2.5％(w/v)的丝素蛋白溶液；2)取450ml石油醚于500ml烧杯中，在-50℃预冷4h；3)再取40ml石油醚于100ml新烧杯中，加入0.7mlspan-80，使两者混合均匀；4)将10ml的丝素蛋白溶液、0.05g氯化锶混合均匀，加入3)中的溶液，搅拌成均匀球形；5)将4)溶液迅速倒入2)中预冷的石油醚中，再置于-50℃静置沉淀；6)在冷冻氛围下除去5)溶液中的石油醚，获得含冰晶的掺锶丝素蛋白微球，将该丝素蛋白微球进行冷冻，再通过冷冻干燥可获得干燥的掺锶的多孔丝素蛋白微球。7)将6)获得的多孔丝素微球与乙醇混合固定30min后，用去离子水冲洗干净乙醇，再经过冷冻干燥获得不溶于水的掺锶的丝素蛋白多孔微球。最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的几个具体实施例子以及对比例子。显然，本发明不限于以上实施例子，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。当前第1页1 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