本发明属于纳米药物领域，涉及一种核酸蛋白纳米复合物及其制备方法和应用。
背景技术：
蛋白质在生命体内发挥着重要的功能，例如转运蛋白运输货物，细胞表面蛋白受体接收并传递信号，蛋白酶催化一系列生化反应等。当这些具有特定功能的蛋白表达发生异常，相应疾病便会发生，于是蛋白质疗法应运而生。蛋白质疗法是指将一些体内天然存在的功能性蛋白或者对疾病有治疗效果的蛋白质类似物输送到靶向部位并发挥特定功能。相比于传统的小分子化疗药物，蛋白质疗法给肿瘤治疗提供了新思路。研究表明，核糖核酸酶a可以通过快速水解核糖核酸达到抑制肿瘤细胞增殖的目的。由于蛋白质的功能特异性和生物相容性，蛋白质类药物在机体内不易引起明显的免疫刺激反应和毒副作用，因而在癌症治疗领域展现出良好的应用前景。
然而，蛋白质类药物作为生物大分子不易进入肿瘤细胞，并且在体内循环过程中较易被生物降解。于是，各类传递蛋白质类药物的功能化载体被陆续报道，主要包括无机纳米粒子，纳米脂质体，聚合物胶束等纳米材料。基于纳米传递技术，上述各类功能化蛋白运载体系已经取得了一定的研究成果，但是要想实现蛋白类药物的靶向运输和可控释放，仍存在许多关键问题没有解决。因此，制备新型的高效且无毒副作用的蛋白质类药物传递载体并进行相应的抗肿瘤治疗具有重要的研究价值和应用潜力。
生物大分子脱氧核糖核酸(deoxyribonucleicacid，dna)可通过严格的碱基互补配对自组装形成具有特定尺寸和形貌的纳米结构(nature,2006,440,297-302)。相对于传统的药物传递体系，dna纳米结构可被用作蛋白类生物大分子的运输载体，其优势主要表现在：结构可设计，尺寸可控，位点可寻址，生物相容性好，无明显细胞毒性，易于功能化修饰等方面。因此，具有靶向修饰和刺激响应能力的dna纳米结构可很好地应用于药物载体的研究，特别是用以实现对蛋白类药物的靶向运输和可控释放，具有重大的理论和实际意义。
cn107488661a公开了一种核酸纳米结构及其制备方法和应用，所述核酸纳米结构为通过dna折纸技术构建的六个三角形dna折纸结构组装形成的六边形dna纳米结构，具体是通过脚手架链与订书钉链和捕获链进行杂交，再通过连接链分别与六个三角形dna折纸结构的脚手架链杂交而自组装形成的六边形dna纳米结构。此方法仅仅制备了核酸纳米结构，没有拓展纳米结构的应用，应用较为局限。
cn104840966a公开了一种核酸纳米结构抗癌复合药物，所述核酸纳米结构抗癌药物由核酸纳米结构、化学抗癌药物和金纳米颗粒制备得到，用dna修饰金纳米颗粒，备用；将核酸纳米结构与化学抗癌药物进行组装；将负载化学抗癌药物的核酸纳米结构与dna修饰的金纳米颗粒进行组装，分离纯化，得到所述核酸纳米结构抗癌复合药物。但是此方法局限于金纳米颗粒和化学药物，仅局限于具有化学药物的疗效。
因此，如何开发一种蛋白药物与核酸纳米结构的复合物，这对于蛋白药物的应用具有重要的意义。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种核酸蛋白纳米复合物及其制备方法和应用。
为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供了一种核酸蛋白纳米复合物，所述功能性蛋白和偶联试剂相偶联后与核酸链连接，所述核酸纳米结构与捕获链连接，所述核酸链与捕获链通过碱基互补配对相连接。
本发明通过以核酸纳米结构为模板，可以实现蛋白类生物大分子的精确组装，从而达到高效负载和运输蛋白类药物的目的。
同其他无机金属纳米粒、纳米脂质体以及聚合物胶束相比，本发明提供的核酸蛋白纳米复合物具有更好的生物安全性和低毒副作用，因而作为药物载体有更好的潜力。核酸纳米结构引导的蛋白自组装复合物在肿瘤治疗、抗蛋白类药物耐药机制的研究和疾病的早期诊断等方面有潜在应用价值。
进一步地，相比于现有的聚合物和胶束等蛋白类药物运输载体，本发明的优势在于：
(1)通过核酸纳米结构可以更精确地组装蛋白质于特定的位点，并可以通过调节捕获链的数量来控制上载的蛋白的量；
(2)不需要涉及到复杂的有机合成等化学过程，只需要简单的偶联小分子就可以实现蛋白质与核酸链的偶联并精确定量；
(3)从生物安全性方面考虑，核酸纳米载体可以应用于更广泛的生物模型。
优选地，所述核酸纳米结构为通过dna折纸术制备的二维和/或三维结构。
优选地，所述核酸纳米结构的形状为长方形、三角形或纳米管形中的任意一种，优选为长方形。
优选地，所述功能性蛋白包括核糖核酸酶a，脱氧核糖核酸酶，核酸外切酶，凝血酶，氧化还原酶，利妥昔单克隆抗体，奥法木单克隆抗体，维妥珠单克隆抗体，托西莫单克隆抗体，阿托珠单克隆抗体，曲妥珠单克隆抗体，西妥昔单克隆抗体，贝伐单克隆抗体等中的任意一种或至少两种的组合，优选为核糖核酸酶a。
优选地，所述偶联试剂为4-(n-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐(sulfo-smcc)。
4-(n-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐是一种水溶性、双异官能团交联试剂，将胺以及巯基反应性合并入扩展间隔片，可用于制备酶的免疫交联物以及半抗原载体分子结合体。
优选地，所述核酸链包括荧光基团。
优选地，所述荧光基团包括cy5、cy5.5、cy3、cy3.5、cy2、异硫氰酸荧光素、羧基荧光素、四氯-6-羧基荧光素、六氯-6-甲基荧光素或2,7-二甲基-4,5-二氯-6-羧基荧光素中的任意一种，优选为cy5。
在本发明中，核酸链和捕获链可以为任意互补序列，例如互补的序列可以是：核酸链为tttttttttttttttacgc，捕获链为gcgtaaaaaaaaaaaaaaa。
第二方面，本发明提供了一种如第一方面所述的核酸蛋白纳米复合物的制备方法，所述制备方法包括：将功能性蛋白与偶联剂进行共价偶联，将偶联后的产物修饰上核酸链，将核酸纳米结构修饰上捕获链，然后将得到的连接有核酸链的功能性蛋白偶联产物与连接有捕获链的核酸纳米结构进行组装得到所述核酸蛋白纳米复合物。
本发明提供的制备方法操作过程简单，反应重复性好，可实现大规模生产。
优选地，所述制备方法具体包括以下步骤：
(1)将捕获链修饰于核酸纳米结构，进行组装和纯化，得到捕获链修饰的核酸纳米结构；
(2)将功能性蛋白与偶联剂反应得到偶联剂修饰的功能性蛋白，将二硫键修饰的核酸链进行还原得到巯基修饰的核酸链，而后将偶联剂修饰的功能性蛋白与巯基修饰的核酸链反应得到核酸链功能性蛋白偶联产物；
(3)将步骤(1)得到的捕获链修饰的核酸纳米结构与步骤(2)得到的核酸链功能性蛋白偶联产物进行共组装，得到所述核酸蛋白纳米复合物。
本发明中步骤(2)和步骤(3)中的制备方法，是一种创新的制备方法，该方法能够高效实现功能性蛋白和核酸链的共价偶联，进而可被精确定位到核酸纳米结构上。
优选地，步骤(1)中所述核酸纳米结构以长脚手架链、短订书钉链和捕获链碱基互补配对得到。
优选地，所述长脚手架链、短订书钉链和捕获链的摩尔比为1:(5-10):(5-10)，例如可以是1:5:5、1:6:8、1:7:8、1:8:8、1:9:7或1:10:10，优选为1:10:10。
在本发明中步骤(1)中修饰上捕获链的核酸纳米结构的组装和纯化采用现有技术方法制备得到。该方法将一条长的脚手架链和设计好的订书钉短链以及捕获链混合，通过经典的程序降温方式，按照碱基互补配对原则，组装得到预先设计的核酸纳米结构。脚手架链是m13噬菌体基因组，订书钉链是设计好的与脚手架链互补配对的核酸短序列。组装温度是从95℃逐渐降温退火到10℃。自组装完成后，采用纯化柱(100kda截留分子量)在5000-8000转/分下，离心2-3min进行浓缩，或通过琼脂糖凝胶分离回收的方式纯化核酸纳米结构，收集纯化柱内截留的液体于新的ep管中。
优选地，步骤(2)所述功能性蛋白与偶联剂的摩尔比为1:10-50，例如可以是1:10、1:20、1:25、1:30、1:35、1:40、1:45或1:50。
在此摩尔比范围内，能够很好地控制功能性蛋白修饰上偶联剂的个数，偶联剂过多或过少都不能保证适当量偶联剂的引入。
优选地，步骤(2)中所述功能性蛋白与二硫键修饰的核酸链的摩尔比为1:2-10，例如可以是1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9或1:10。
在本发明中，步骤(2)中核酸链与功能蛋白的偶联可以是任何生物相容的交联反应，优选为利用4-(n-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐(sulfo-smcc)作为偶联试剂进行共价偶联。
其中步骤(2)中功能性蛋白与sulfo-smcc进行共价偶联的条件为：取50μl浓度为50μm的功能性蛋白于1.5mlep管中，向其中加入1-5μl浓度为25mm的sulfo-smcc溶液(功能蛋白同sulfo-smcc的比例为1:10-1:50)，震荡混匀，再加入180-220μl的1×pbs缓冲液，震荡混匀，快速离心10-20秒，用封口膜密封住，置于摇床上震荡4-5h。
优选地，取50μl浓度为50μm的功能性蛋白与2μl25mm的sulfo-smcc反应，以更好的控制功能性蛋白与sulfo-smcc的摩尔比为1:20。反应完成后，多余的sulfo-smcc用g25吸附柱，在2500-3000转/分下，离心2-3min进行去除，即可得到纯化后的sulfo-smcc修饰的蛋白产物。
而后，将步骤(2)中功能性蛋白与二硫键修饰的核酸链混合均匀，静置于室温反应12-24h。优选地，功能性蛋白与核酸链以1:2的比例混合均匀，静置于室温反应12h。反应完成后的混合体系用离心纯化柱(10kda截留分子量)，在12000-12500转/分下，离心2-3min进行浓缩，收集纯化柱内截留的液体于新的ep管中。
在本发明中，步骤(2)中功能性蛋白与核酸链偶联产物以非变性凝胶分离回收，电泳洗脱和冻干的方式进行分离纯化。
在本发明中，步骤(2)中纯化后的功能性蛋白与核酸链偶联产物以荧光光谱分析法和bca法进行定量。
优选地，步骤(3)中所述共组装为捕获链修饰的核酸纳米结构中的捕获链与核酸链功能性蛋白偶联产物中的核酸链为互补序列，进行碱基互补配对。
在本发明中，互补配对序列的长度可以是任意长度，并且序列无特定的选择，任意互补序列均可。
优选地，步骤(3)中所述共组装的条件为：升温至42-45℃，然后降温至4-16℃，每摄氏度保持2-10分钟，重复3-6个循环，完成组装。
在本发明中，共组装的条件是特定的过程，最高温度的条件不可改变，如果温度高出本发明限定的范围，会影响功能性蛋白的活性。
在本发明中，步骤(3)中所述核酸链功能性蛋白偶联产物的工作浓度为5-108nm，且蛋白的浓度是dna纳米结构上每条捕获链的8-10倍。
优选地，核酸链功能性蛋白偶联产物的工作浓度为54nm，且蛋白的浓度是核酸纳米结构上每条捕获链的10倍。
步骤(3)中所述功能性蛋白与核酸纳米结构的组装条件为：在1×tae/mg2+的缓冲条件下，升温至42-45℃，然后降温至4-16℃，每摄氏度保持2-10分钟，重复3-6个循环。优选地，升温至42℃，然后降温至10℃，每摄氏度保持5分钟，重复5个循环。组装完成后，经过纯化柱(100kda截留分子量)，在5000-8000转/分下，离心2-3min进行浓缩，收集纯化柱内截留的液体于新的ep管中。用原子力显微镜(afm)对自组装产物进行形貌表征。afm样品扫描方式可以是固相或液相模式。优选为液相扫描模式。
作为优选技术方案，本发明提供的核酸蛋白纳米复合物的制备方法，具体包括以下步骤：
(1)将脚手架链，订书钉链和捕获链以1:10:10的比例组装，温度是从95℃逐渐降温退火到10℃。组装完成后，采用纯化柱(100kda截留分子量)在5000转/分下，离心3min进行浓缩，收集纯化柱内截留的液体于新的ep管中备用。
(2)末端巯基修饰的核酸链通过4-(n-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐(sulfo-smcc)同功能性蛋白以2:1的比例进行交联，静置放于室温反应12h。反应完成后的混合体系用离心纯化柱(10kda截留分子量)，在12000转/分下，离心3min进行浓缩，收集纯化柱内截留的液体于新的ep管中。核酸链功能性蛋白偶联产物以非变性凝胶分离回收，电泳洗脱和冻干的方式进行分离纯化。对纯化后的核酸链功能性蛋白偶联产物以荧光光谱分析法和bca法进行定量。
(3)将步骤(2)得到的核酸链功能性蛋白偶联产物与步骤(1)得到的修饰上捕获链的核酸纳米结构进行组装，所述核酸蛋白偶联产物的工作浓度为54nm，且蛋白的浓度是dna纳米结构上每条捕获链的10倍，升温至42℃，然后降温至10℃，每摄氏度保持5分钟，重复5个循环。组装完成后，经过纯化柱(100kda截留分子量)，在5000转/分下，离心3min进行浓缩，收集纯化柱内截留的液体于新的ep管中。
第三方面，本发明提供了一种如第一方面所述的核酸蛋白纳米复合物在制备肿瘤治疗药物中的应用。
优选地，所述肿瘤包括卵巢癌、乳腺癌、非小细胞癌、前列腺癌、肝癌、头颈癌或非何金氏淋巴瘤中的任意一种。
相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
本发明通过以核酸纳米结构为模板，可以实现蛋白类生物大分子的精确组装，从而达到高效负载和运输蛋白类药物的目的。
同其他无机金属纳米粒、纳米脂质体以及聚合物胶束相比，本发明提供的核酸蛋白纳米复合物具有更好的生物安全性和低毒副作用，因而作为药物载体有更好的潜力。核酸纳米结构引导的蛋白自组装复合物在肿瘤治疗、抗蛋白类药物耐药机制的研究和疾病的早期诊断等方面有潜在应用价值。
进一步地，相比于现有的聚合物和胶束等蛋白类药物运输载体，本发明的优势在于：
(1)通过核酸纳米结构可以更精确地组装蛋白质于特定的位点，并可以通过调节捕获链的数量来控制上载的蛋白的量；
(2)不需要涉及到复杂的有机合成等化学过程，只需要简单的偶联小分子就可以实现蛋白质与核酸链的偶联并精确定量；
(3)从生物安全性方面考虑，核酸纳米载体可以应用于更广泛的生物模型。
附图说明
图1是本发明实施例1中制备得到的核酸蛋白纳米复合物的凝胶电泳检测结果图。
图2是本发明实施例1中核酸纳米结构的原子力显微镜图。
图3是本发明实施例1中核酸蛋白纳米复合物原子力显微镜图。
图4是本发明实施例1中核酸纳米结构与核酸蛋白纳米复合物的高度测量曲线图。
图5是本发明实施例6中单独的核糖核酸酶a与负载核糖核酸酶a的核酸蛋白纳米结构对人非小细胞肺癌a549的活力抑制结果图。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
本发明以下实施例所用仪器和材料如下：
器材：mastercyclerpro梯度pcr仪(eppendorf，德国)，5810r小型高速离心机(eppendorf，德国)，uv-2450紫外-可见分光光度计(岛津，日本)，全波长酶标仪(tecan，瑞士)，veecomultimode8原子力显微镜(veeco，美国)。
原料：短链核苷酸序列(订书钉链和捕获链)购自上海英潍捷基生物技术有限公司，m13噬菌体基因组dna购自newenglandbiolabs公司。
试剂：实验中所用的缓冲溶液有tae/mg2+缓冲溶液(ph8.3)和pbs缓冲溶液(ph7.4)。其中，1×tae/mg2+缓冲溶液(ph8.3)的组分为：4×10-2mol·l-1tris，2×10-2mol·l-1乙酸，2.0×10-3mol·l-1edta和1.25×10-2mol·l-1醋酸镁；1×pbs缓冲溶液(ph7.4)的组成为：136.9×10-3mol·l-1(8.00gl-1)nacl，2.68×10-3mol·l-1(0.20gl-1)kcl，9.75×10-3mol·l-1(1.56gl-1)na2hpo4·h2o和1.47×10-3mol·l-1(0.20g·l-1)kh2po4；这些缓冲溶液所用的试剂均为分析纯，购自sigma-aldrich公司。细胞活力实验所使用的细胞计数试剂盒购自日本同仁化学。
细胞：人非小细胞肺癌a549细胞系购自中国协和医科大学基础医学研究所细胞中心。
培养基：r1640培养基，添加10％胎牛血清，细胞接种于100mm2培养皿中，置于5％co2培养箱，37℃培养，当细胞生长至融合度80％左右时传代；所用培养基和胎牛血清购自thermofisherscientific公司。
实施例1
制备核酸蛋白纳米结构复合物
(1)修饰上捕获链的核酸纳米结构的组装和纯化
将一条长的脚手架链和设计好的订书钉短链以及捕获链混合，过经典的程序降温方式，按照碱基互补配对原则，组装得到预先设计的核酸纳米结构。所述脚手架链是m13噬菌体基因组，订书钉链是设计好的与脚手架链互补配对的核酸短序列，温度是从95℃逐渐降温退火到10℃，脚手架链，订书钉链和捕获链的摩尔比是1:10:10。自组装完成后，可采用离心纯化柱(100kda截留分子量)在5000转/分下，离心3min进行浓缩，收集纯化柱内截留的液体于新的ep管中。
(2)核酸链功能性蛋白偶联产物的制备，纯化和定量
利用4-(n-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐(sulfo-smcc)进行共价偶联，实现对蛋白的核酸修饰。此方法有以下主要步骤：蛋白与sulfo-smcc反应，二硫键修饰的核酸链的还原，核酸链与sulfo-smcc修饰的蛋白的偶联。
a)核糖核酸酶a与sulfo-smcc反应
取50μl浓度为50μm的核糖核酸酶a(rnasea)于1.5mlep管中，向其中加入2μl浓度为25mm的sulfo-smcc溶液，震荡混匀，再加入200μl的1×pbs缓冲液，震荡混匀，快速离心10秒，用封口膜密封住，置于摇床上震荡5h。控制核糖核酸酶a与sulfo-smcc的摩尔比为1:20。反应完成后，多余的sulfo-smcc用g25吸附柱，在3000转/分下，离心2min进行去除，即可得到纯化后的sulfo-smcc修饰的蛋白产物。
b)二硫键修饰的核酸链的还原
取30μl浓度为130μm的二硫键修饰的核酸链于200μl的ep管中，向其中加入5μl浓度为100mm的三(2-羧乙基)膦(tcep)还原剂，震荡混匀，快速离心10秒，将ep管放于预热好的37℃金属浴中2h。反应完成后，多余的tcep用g25吸附柱，在3000转/分下，离心2min进行去除，即可得到纯化后的巯基修饰的核酸链。
c)核糖核酸酶a与核酸链的偶联
将纯化后的sulfo-smcc修饰的蛋白产物和巯基修饰的核酸链以1:2的比例混合均匀，静置放于室温反应12h。反应完成后的混合体系用离心纯化柱(10kda截留分子量)，在12000转/分下，离心3min进行浓缩，收集纯化柱内截留的液体于新的ep管中。
本发明中，核酸链功能性蛋白偶联产物的纯化包括以下三个步骤：非变性凝胶电泳胶回收，电泳洗脱，冻干。
a)非变性凝胶电泳胶回收
4％非变性聚丙烯酰胺凝胶配方：3.5ml40％聚丙烯酰胺，3.5ml10×tbe缓冲液，25ml去离子水，300μl过硫酸铵(aps)，30μln,n,n',n'-四甲基二乙胺(temed)。凝胶电泳电压150v，电泳时间1.5h。电泳结束后，将目的条带切下来，以备后用。
b)电泳洗脱
利用电泳洗脱仪对含有核酸链功能性蛋白偶联产物的凝胶条带进行洗脱，将洗脱电压设置为120v，洗脱时间为4h。
c)冻干
将电泳洗脱的产物放入冻干样品台进行冻干，400μl样品需要的冻干时间为24h。冻干后的样品用1×pbs缓冲液重新溶解。
本发明中，核酸链功能性蛋白偶联产物的定量采用荧光光谱分析法和bca法。
a)荧光光谱分析法
将带有cy5荧光基团标记的核酸链进行浓度梯度稀释，分别稀释成30nm，60nm，90nm，120nm，150nm，180nm的稀释液，然后用荧光光谱仪测定各个浓度下cy5的荧光发射强度，利用各个浓度的稀释液在670nm处的荧光强度制作标准曲线。将纯化后的核酸链功能性蛋白偶联产物稀释一定比例，测定其在670nm处的荧光强度，依照标准曲线计算出核酸链功能性蛋白偶联产物中核酸链的浓度。
b)bca法
按照bca试剂盒的标准操作，利用酶标仪测定各个浓度下的标准样品在562nm处的吸收值，并制作标准曲线。然后测定经一定比例稀释后的核酸链功能性蛋白偶联产物在562nm处的吸收值，依照标准曲线计算出偶联产物中蛋白的浓度。
最终通过计算纯化后的核酸蛋白偶联产物中核酸链浓度与蛋白浓度的比例确定偶联产物中每个蛋白分子上偶联的核酸链数目：n＝cdna/cprotein。例如，当n为1时，可控制一个蛋白连接一条核酸链。
其中c代表浓度，n为数目。
(3)捕获链修饰的核酸纳米结构与核酸链功能性蛋白偶联产物的共组装
取一定体积的修饰上捕获链的dna纳米结构母液于新的pcr管中，使其终浓度为54nm，然后加入纯化后的核酸蛋白偶联产物，使蛋白终浓度是dna纳米结构上每条捕获链的10倍。然后使得组装体系在1×tae/mg2+的缓冲条件下进行。用移液枪吹打混匀，进行程序性升温降温退火共组装。共组装的温度可以是从42℃逐渐降温到10℃，每摄氏度保持5分钟，重复5个循环。组装完成后，经过纯化柱(100kda截留分子量)，在5000转/分下，离心3min进行浓缩，收集纯化柱内截留的液体于新的ep管中，用原子力显微镜(afm)在液相模式下对自组装产物进行形貌表征。得到核酸蛋白纳米复合物。
将核酸蛋白纳米复合物进行凝胶电泳检测，结果如图1所示。
图1是实施例1得到的核酸蛋白纳米复合物的凝胶电泳检测结果，其中泳道1为m13噬菌体基因组；泳道2为长方形dna纳米结构；泳道3为修饰上捕获链的长方形dna纳米结构；泳道4为制备的核酸蛋白纳米复合物。由结果可知，核酸蛋白纳米复合物的电泳迁移率较慢，明显滞后于未负载上蛋白类药物的核酸纳米结构本身。
将核酸蛋白纳米复合物进行原子力显微镜照片观察及其高度测量，具体结果如图2、图3和图4所示。
图2是核酸纳米结构的原子力显微镜图。
图3是实施例1得到的核酸蛋白纳米复合物原子力显微镜图，标尺为200纳米。由结果可知，我们组装出了预先设计的核酸纳米结构，且形貌规整，有较好的分散性。通过nanoscopeananlysis1.5分析，dna纳米结构的长为120nm，宽90nm。通过对功能性蛋白的负载，可以清晰观察到核糖核酸酶a按照预先设计的捕获位点连接到了核酸纳米结构上。
通过高度分析，如图4所示，可以观察到明显的高度变化，峰高约3.5-4.0nm。
实施例2
本实施例与实施例1不同之处在于，步骤(1)中在制备修饰上捕获链的dna纳米结构时，脚手架链，订书钉链和捕获链的摩尔比设定为1:5:5，自组装完成后，可采用离心纯化柱(100kda截留分子量)在8000转/分下，离心2min进行浓缩，收集纯化柱内截留的液体于新的ep管中。步骤(2)中取50μl浓度为50μm的核糖核酸酶a(rnasea)于1.5mlep管中，向其中加入5μl浓度为25mm的sulfo-smcc溶液，震荡混匀，再加入180μl的1×pbs缓冲液，震荡混匀，快速离心20秒，用封口膜密封住，置于摇床上震荡4h。控制核糖核酸酶a与sulfo-smcc的摩尔比为1:50。反应完成后，多余的sulfo-smcc用g25吸附柱，在2500转/分下，离心3min进行去除。将纯化后的sulfo-smcc修饰的蛋白产物和巯基修饰的核酸链以1:10的比例混合均匀，静置放于室温反应24h。反应完成后的混合体系用离心纯化柱(10kda截留分子量)，在12500转/分下，离心2min进行浓缩，收集纯化柱内截留的液体于新的ep管中。步骤(3)中取一定体积的修饰上捕获链的dna纳米结构母液于新的pcr管中，使其终浓度为5nm，然后加入纯化后的核酸蛋白偶联产物，使蛋白终浓度是dna纳米结构上每条捕获链的8倍。然后使得组装体系在1×tae/mg2+的缓冲条件下进行。用移液枪吹打混匀，进行程序性升温降温退火共组装。共组装的温度可以是从45℃逐渐降温到4℃，每摄氏度保持2分钟，重复3个循环。组装完成后，经过纯化柱(100kda截留分子量)，在8000转/分下，离心2min进行浓缩，收集纯化柱内截留的液体于新的ep管中，用原子力显微镜(afm)在固相模式下对自组装产物进行形貌表征。其余原料选用以及制备方法和反应条件均与实施例1相同，同样制备得到了核酸蛋白纳米复合物。
实施例3
本实施例与实施例1不同之处在于，步骤(1)中在制备修饰上捕获链的dna纳米结构时，脚手架链，订书钉链和捕获链的摩尔比设定为1:7:7，自组装完成后，可采用离心纯化柱(100kda截留分子量)在7000转/分下，离心2.5min进行浓缩，收集纯化柱内截留的液体于新的ep管中。步骤(2)中取50μl浓度为50μm的核糖核酸酶a(rnasea)于1.5mlep管中，向其中加入1μl浓度为25mm的sulfo-smcc溶液，震荡混匀，再加入220μl的1×pbs缓冲液，震荡混匀，快速离心15秒，用封口膜密封住，置于摇床上震荡4.5h。控制核糖核酸酶a与sulfo-smcc的摩尔比为1:10。反应完成后，多余的sulfo-smcc用g25吸附柱，在2750转/分下，离心2.5min进行去除。将纯化后的sulfo-smcc修饰的蛋白产物和巯基修饰的核酸链以1:7的比例混合均匀，静置放于室温反应18h。反应完成后的混合体系用离心纯化柱(10kda截留分子量)，在12250转/分下，离心2.5min进行浓缩，收集纯化柱内截留的液体于新的ep管中。步骤(3)中取一定体积的修饰上捕获链的dna纳米结构母液于新的pcr管中，使其终浓度为108nm，然后加入纯化后的核酸蛋白偶联产物，使蛋白终浓度是dna纳米结构上每条捕获链的9倍。然后使得组装体系在1×tae/mg2+的缓冲条件下进行。用移液枪吹打混匀，进行程序性升温降温退火共组装。共组装的温度可以是从43℃逐渐降温到16℃，每摄氏度保持10分钟，重复6个循环。组装完成后，经过纯化柱(100kda截留分子量)，在6500转/分下，离心2.5min进行浓缩，收集纯化柱内截留的液体于新的ep管中。其余原料选用以及制备方法和反应条件均与实施例1相同，同样制备得到了核酸蛋白纳米复合物。
实施例4
本实施例与实施例1不同之处在于，步骤(3)中共组装的温度是从55℃逐渐降温到16℃，每摄氏度保持10分钟，重复6个循环。组装完成后，经过纯化柱(100kda截留分子量)，在6500转/分下，离心2.5min进行浓缩，收集纯化柱内截留的液体于新的ep管中。其余原料选用以及制备方法和反应条件均与实施例1相同，同样制备得到了核酸蛋白纳米复合物。
结果显示，该复合物中核糖核酸酶a的活性有较大程度降低，说明了本发明共组装的温度是特定的选择。
实施例5
本实施例与实施例1不同之处在于，将功能性蛋白替换成利妥昔单克隆抗体。其余原料选用以及制备方法和反应条件均与实施例1相同，同样制备得到了核酸蛋白纳米复合物。
实施例6
本实施例测定dna蛋白纳米复合物对肿瘤细胞的杀伤作用
人非小细胞肺癌a549细胞接种于100mm2培养皿中，置于5％co2培养箱，37℃培养。当细胞生长至融合度80％左右时传代。培养细胞至对数生长期，胰蛋白酶消化，收集细胞，调整细胞悬液浓度为5×104个/ml，接种96孔板，每孔100μl。将96孔板置于co2培养箱中培养过夜，吸出培养液，加入不同浓度(核糖核酸酶a：0，2，4，8μg/ml)的游离核糖核酸酶a或载药核酸纳米结构，每个浓度组3个复孔。另设一组为空白对照组(只接种细胞，不加药)。将已加药处理的a549细胞继续置于培养箱中培养48h，弃掉含药培养基，每孔加入0.5mg/ml的3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐(mtt)溶液100μl，继续孵育4h，弃掉液体，加入二甲亚砜(dmso)溶解蓝紫色结晶甲臢，用酶标仪(570nm)检测每孔的od值。根据od值计算出肿瘤细胞存活率，计算公式为：存活率％＝实验组od值/对照组od值×100。
具体的测试结果如图5所示。图5显示，游离核糖核酸酶a无法内化进入细胞而无明显的细胞毒性。dna纳米结构引导的核糖核酸酶a组装结构则有明显的细胞毒性，在含核糖核酸酶a为2μg/ml细胞活力即受到明显抑制(<60％)；在含核糖核酸酶a为8μg/ml细胞毒性作用非常明显(<20％)。由此可见，核糖核酸酶a在dna纳米载体的辅助下能更多的被细胞摄取，在细胞内部具有非常明显的毒性作用，细胞活力因而受到明显的抑制。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的核酸蛋白纳米复合物及其制备方法和应用，但本发明并不局限于上述工艺步骤，即不意味着本发明必须依赖上述工艺步骤才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明所选用原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。