本发明涉及一种用于预防和辅助治疗牙周炎的口腔喷剂及其制备方法，属于医药
技术领域：
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背景技术：
：牙周炎是牙菌斑中的微生物所引起的牙周支持组织的慢性感染性疾病，并会导致牙周支持组织的破坏，最后可导致牙槽骨吸收、牙齿松动和被拔除。口腔中的致病微生物是引起牙周炎的主要致病原因。生活中对口腔卫生的不甚注意以及不良的口腔习惯会引起口腔致病菌聚集、繁衍并引起牙周炎。牙周炎若治疗不及时会造成牙槽骨吸收严重，附着丧失严重，导致牙齿缺失的危机，并有可能由牙周炎而提高其它的口腔疾病如根尖周炎或全身疾病如心血管疾病发病的概率。目前，临床上对牙周炎的治疗多为龈下刮治，龈上洁治等机械性去除菌斑的方法，即去除病源及刺激因素；但是，在机械性治疗之后的牙周维护期，缺少对牙周致病菌的抑制。目前临床可供使用的用于抑制牙周致病菌的产品种类较少，需要增加此类产品的种类，并提高其功能效果、减少副作用，同时可供患者长期使用，并有效预防或治疗牙周炎。中国专利文献cn105343168a公开了一种含黄酮类口腔护理组合物，其特征是护理组合物的提取物的份数如下：木犀草素10份、黄芩素10份、山奈酚5份、橙皮苷20份、芹菜素20份、薄荷油0.2～2份。该发明的组合物可用于危重患者的口腔护理，龋齿、牙周炎、口腔炎长期不愈患者的治疗，但针对牙周炎的致病源作用欠佳，在日常生活中于牙周炎的预防应用较弱，抗菌、抗炎效果欠佳。技术实现要素：针对现有技术存在的不足，本发明提供一种用于预防和辅助治疗牙周炎的口腔喷剂。本发明的口腔喷剂无毒副作用，对牙周炎致病菌中的具核梭杆菌，牙龈卟啉单胞菌，伴放线聚集杆菌等有较强的抑制生长和杀菌作用，同时能够抑制致病菌共聚和生物膜的形成，具有抗细菌粘附功能；并可减少lps(脂多糖)或者其它细菌衍生因子产生的炎症，抑制mmps(基质金属蛋白酶)的表达和破骨细胞的形成，从而具有抗炎和预防牙槽骨吸收的功能。本发明还提供一种用于预防和辅助治疗牙周炎的口腔喷剂的制备方法。本发明的技术方案如下：一种用于预防和辅助治疗牙周炎的口腔喷剂，包括如下百分比的原料制成：各组分之和为百分之百。根据本发明优选的，所述用于预防和辅助治疗牙周炎的口腔喷剂，包括如下百分比的原料制成：各组分之和为百分之百。根据本发明优选的，所述用于预防和辅助治疗牙周炎的口腔喷剂，包括如下百分比的原料制成：各组分之和为百分之百。根据本发明优选的，所述原花青素为原花青素a1。根据本发明优选的，所述薄荷醇为左旋薄荷醇。根据本发明优选的，所述人参皂苷为人参皂苷rb1。根据本发明优选的，所述乙醇为食用酒精，体积浓度≧95.0％。根据本发明优选的，所述表没食子儿茶素没食子酸酯、柠檬酸、木糖醇、杜鹃素、木犀草素、阿魏酸、薄荷醇、大黄素均为纯度≥98％的食品或药品级，所述原花青素、甘草查尔酮a均为纯度≥95％的食品或药品级，所述三七皂苷r1、茶黄素均为纯度≥80％的食品或药品级，所述人参皂苷为纯度≥50％的食品或药品级。上述用于预防和辅助治疗牙周炎的口腔喷剂的制备方法，包括步骤：(1)将表没食子儿茶素没食子酸酯，茶黄素，原花青素，木糖醇，柠檬酸溶于无菌水中，混合均匀得溶液a；(2)将甘草查尔酮a，杜鹃素，木犀草素，阿魏酸，薄荷醇，三七皂苷r1，人参皂苷，大黄素溶于乙醇中，混合均匀得溶液b；(3)将溶液a和溶液b混合均匀，经过滤除菌，灌装于喷瓶中即得。根据本发明，步骤(3)中所述过滤除菌可按现有技术进行。根据本发明，步骤(3)中所述喷瓶可市购获得。本发明中表没食子儿茶素没食子酸酯(egcg)为绿茶多酚主要组成成分，具有抗菌、抗病毒、抗氧化、抗动脉硬化、抗血栓形成、抗炎以及抗肿瘤作用。对牙周炎致病菌中的具核梭杆菌，牙龈卟啉单胞菌，伴放线聚集杆菌有较强的抑制生长和杀菌作用；并可减少lps(脂多糖)或者其它细菌衍生因子产生的炎症，减少mmps(基质金属蛋白酶)的分泌，从而减少牙槽骨的吸收。本发明egcg优选为纯度≥98％的食品或者药品级，可市购获得。本发明中茶黄素(theaflavin，tf1)为红茶发酵产物，对牙龈卟啉单胞菌有较强的抑制作用，并且抑制mmps的表达和破骨细胞的形成，从而具有抗炎和预防牙槽骨吸收的功能；同时其具有调节血脂和预防心血管疾病的功效，并且无毒副作用。本发明茶黄素优选为纯度≥98％的食品或者药品级，可市购获得。本发明中原花青素优选为原花青素a1，来源于葡萄籽提取物，具有极好的抗氧化和抗细菌黏附作用，能够抑制具核梭杆菌和牙龈卟啉单胞菌共聚和生物膜的形成，并可抑制促炎因子和趋化因子的表达，抑制mmps的产生，对牙周致病菌有一定的抑制作用。本发明优选原花青素a1，优选为高纯度食品或者药品级，可市购获得本发明中甘草查尔酮a为天然植物提取物，可辅助原花青素对牙龈卟啉单胞菌的抗菌作用，并且具有一定的抗炎作用，同时含有芳香气味。本发明甘草查尔酮a优选为高纯度食品或者药品级，可市购获得。本发明中杜鹃素为天然植物提取物，可抑制牙龈卟啉单胞菌，并且下调促炎基因的表达。本发明杜鹃素优选为高纯度食品或者药品级，可市购获得。本发明中木犀草素为天然植物提取物，具有消炎止血作用；本发明木犀草素优选为高纯度食品或者药品级，可市购获得。本发明中阿魏酸为天然植物提取物，具有抗炎作用；本发明阿魏酸优选为高纯度食品或者药品级，可市购获得。本发明中三七皂苷r1为天然植物提取物，具有消炎止血止痛作用；本发明三七皂苷r1优选为高纯度食品或者药品级，可市购获得。本发明中人参皂苷优选为人参皂苷rb1，为天然植物提取物，具有维护牙周血管、辅助止血作用；本发明人参皂苷rb1优选为高纯度食品或者药品级，可市购获得。本发明中大黄素为天然植物提取物，辅助增强抗菌活性；本发明大黄素优选为高纯度食品或者药品级，可市购获得。本发明中薄荷醇优选为左旋薄荷醇，为天然植物提取物，具有清凉止痛，辅助抗炎，调节口味的作用；本发明薄荷醇优选为高纯度食品或者药品级，可市购获得。本发明中木糖醇为甜味剂，柠檬酸为调味剂，均为天然植物提取物，优选为高纯度食品或者药品级，可市购获得。有益效果：(1)本发明的目的是为了在牙周炎洁治和刮治等机械性去除牙石菌斑等致病原之后，辅助抑制牙周致病菌的重新附着和滋生，并有利于牙周炎症的消除；同时在日常生活中帮助口腔环境不洁及有遗传倾向的人群，通过抑制牙周致病菌的生长和附着从而帮助预防牙周炎的发生及防止牙周炎向更为严重的方向发展。并且本发明主要功能成分全部为天然植物提取物，对口腔组织刺激性小，无毒副作用，同时有较单一成分有更强效快速的杀菌消炎作用；并且对部分牙周炎主要致病菌针对性高，抑制效果明显。(2)本发明原料中egcg，茶黄素，甘草查尔酮a，原花青素，杜鹃素为主要成分，结合其它原料发挥协同作用，相辅相成，在抑制牙周炎主要致病菌的同时，也可起到抗炎作用来消除牙周炎的症状，即达到从病因上去除，又可以达到症状缓解，并可大大降低起效浓度；本发明的口腔喷剂能够对牙周炎致病菌中的具核梭杆菌，牙龈卟啉单胞菌，伴放线聚集杆菌等有较强的抑制生长和杀菌作用，同时能够抑制致病菌共聚和生物膜的形成，具有抗细菌粘附功能，从病因上治疗或防止牙周炎；并可减少lps(脂多糖)或者其它细菌衍生因子产生的炎症，抑制mmps(基质金属蛋白酶)的表达和破骨细胞的形成，从而具有抗炎和预防牙槽骨吸收的功能；并且同时能起到止血止痛的效果。具体实施方式下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明，但不限于此。同时下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。下述中，表没食子儿茶素没食子酸酯，食品级，纯度98％，陕西森弗天然制品有限公司有售；茶黄素，药品级，纯度99％，泰克生物科技公司有售；原花青素a1，食品级，纯度为95％，陕西森弗天然制品有限公司有售；甘草查尔酮a，药品级，纯度为98％，康宝泰精细化工有限公司有售；杜鹃素，药品级，纯度98％，西安昊轩生物科技有限公司有售；木犀草素，药品级，纯度98％，陕西森弗天然制品有限公司有售；阿魏酸，药品级，纯度98％，陕西森弗天然制品有限公司有售；左旋薄荷醇，食品级，纯度为99％，深圳鼎诚植物香料公司有售；三七皂苷r1，药品级，纯度为85％，西安艾诺医药科技有限责任公司有售；木糖醇，食品级，纯度为99％，山东龙力生物科技股份有限公司有售；柠檬酸，食品级，纯度为99％，陕西森弗天然制品有限公司有售；大黄素，药品级，纯度98％，维珍生物科技有限公司有售；人参皂苷rb1，药品级，纯度50％，宁波金艾农生物科技有限公司有售；乙醇为食用酒精，食品级，体积浓度为95％，中和盛泰公司有售。实施例1一种用于预防和辅助治疗牙周炎的口腔喷剂，包括如下百分比的原料制成：各组分之和为百分之百。上述用于预防和辅助治疗牙周炎的口腔喷剂的制备方法，包括步骤：(1)分别称取5g表没食子儿茶素没食子酸酯、1g茶黄素、1g原花青素a1、5g木糖醇、2g柠檬酸溶于500g无菌水中，混合均匀得溶液a；(2)分别称取1g甘草查尔酮a、1g杜鹃素、0.5g木犀草素、0.5g阿魏酸、3g左旋薄荷醇、1g三七皂苷r1、0.1g人参皂苷rb1、0.1g大黄素用50g乙醇配置成溶液b；(3)将溶液a和溶液b混合均匀，加入无菌水至1000g，将所得溶液过滤除菌，灌装于喷瓶中即得。实施例2一种用于预防和辅助治疗牙周炎的口腔喷剂，包括如下百分比的原料制成：各组分之和为百分之百。上述用于预防和辅助治疗牙周炎的口腔喷剂的制备方法，包括步骤：(1)分别称取2g表没食子儿茶素没食子酸酯，0.5g茶黄素、0.5g原花青素a1、0.2g木糖醇、1g柠檬酸溶于500g无菌水中，混合均匀得溶液a；(2)分别称取0.5g甘草查尔酮a、0.5g杜鹃素、0.2g木犀草素、0.2g阿魏酸、1g左旋薄荷醇、0.5g三七皂苷r1、0.05g人参皂苷rb1、0.05g大黄素用20g乙醇配置成溶液b；(3)将溶液a和溶液b混合均匀，加入无菌水至1000g，将所得溶液过滤除菌，灌装于喷瓶中即得。实施例3一种用于预防和辅助治疗牙周炎的口腔喷剂，包括如下百分比的原料制成：各组分之和为百分之百。上述用于预防和辅助治疗牙周炎的口腔喷剂的制备方法，包括步骤：(1)分别称取8g表没食子儿茶素没食子酸酯、3g茶黄素、3g原花青素a1、1g木糖醇、3g柠檬酸溶于500g无菌水中，混合均匀得溶液a；(2)分别称取3g甘草查尔酮a、3g杜鹃素、1g木犀草素、1g阿魏酸、5g左旋薄荷醇、3g三七皂苷r1、0.5g人参皂苷rb1、0.5g大黄素用80g乙醇配置成溶液b；(3)将溶液a和溶液b混合均匀，加入无菌水至1000g，将所得溶液过滤除菌，灌装于喷瓶中即得。对比例1一种口腔喷剂，原料组成如实施例1所述，所不同的是：组分中无表没食子儿茶素没食子酸酯，其它与实施例1一致。上述口腔喷剂的制备方法与实施例1一致。对比例2一种口腔喷剂，原料组成如实施例1所述，所不同的是：组分中无茶黄素，其它与实施例1一致。上述口腔喷剂的制备方法与实施例1一致。对比例3一种口腔喷剂，原料组成如实施例1所述，所不同的是：组分中无原花青素a1，其它与实施例1一致。上述口腔喷剂的制备方法与实施例1一致。对比例4一种口腔喷剂，原料组成如实施例1所述，所不同的是：组分中无甘草查尔酮a，其它与实施例1一致。上述口腔喷剂的制备方法与实施例1一致。对比例5一种口腔喷剂，原料组成如实施例1所述，所不同的是：组分中无杜鹃素，其它与实施例1一致。上述口腔喷剂的制备方法与实施例1一致。对比例6一种口腔喷剂，原料组成如实施例1所述，所不同的是：组分中无木犀草素，其它与实施例1一致。上述口腔喷剂的制备方法与实施例1一致。对比例7一种口腔喷剂，原料组成如实施例1所述，所不同的是：组分中无阿魏酸，其它与实施例1一致。上述口腔喷剂的制备方法与实施例1一致。对比例8一种口腔喷剂，原料组成如实施例1所述，所不同的是：组分中无三七皂苷r1，其它与实施例1一致。上述口腔喷剂的制备方法与实施例1一致。对比例9一种口腔喷剂，原料组成如实施例1所述，所不同的是：组分中无人参皂苷rb1，其它与实施例1一致。上述口腔喷剂的制备方法与实施例1一致。对比例10一种口腔喷剂，原料组成如实施例1所述，所不同的是：组分中无大黄素，其它与实施例1一致。上述口腔喷剂的制备方法与实施例1一致。试验例1对牙周致病菌的杀菌效果测试1、待测样品的制备将实施例1和对比例1-10制备的口腔喷剂分别与无菌水混合配制不同浓度的喷雾剂溶液(8000、4000、2000、1000、500、250、125、62.5、32.15、15.625、7.8、3.9ug/ml)，作为待测样品；待测样品浓度的计算方法为：口腔喷剂的密度*口腔喷剂的体积/(口腔喷剂和无菌水的总体积)，不同口腔喷剂密度均约为1mg/ml。同时分别配制不同浓度(8000、4000、2000、1000、500、250、125、62.5、32.15、15.625、7.8、3.9ug/ml)的egcg的水溶液、原花青素a1的水溶液、茶黄素的水溶液，作为待测样品。2、试验方法将上述待测样品分别加入灭菌的96孔细胞培养板中；将具核梭杆菌或牙龈卟啉单胞菌悬浊液浓度调至0.5麦氏比浊，用bhi肉汤稀释1000倍后，向上述每孔中加入100ul，密封后于37℃培养18-24h后进行观察；以孔内完全抑制细菌生长的最低药物浓度为mic；继续培养48h后观察细菌生长情况，涂平板观察，无菌生长孔所含药物最低浓度为mbc；测试结果如下表1、2所示：表1对具核梭杆菌最小抑菌浓度mic和最小杀菌浓度mbc测试数据表2对牙龈卟啉单胞菌最小抑菌浓度mic和最小杀菌浓度mbc测试数据样品mic(ug/ml)mbc(ug/ml)原花青素a110001000egcg5001000对比例1125250对比例2125125对比例362.5250对比例432.1562.5对比例562.562.5对比例632.1532.15对比例732.1562.5对比例815.62532.15对比例915.62515.625对比例1015.62515.625实施例13.97.8结论：由表1和2可知，本发明制备的口腔喷剂较对比例以及单一组分的杀菌效果要好，效果明显；说明本发明各原料之间发挥协同作用以达到优异的抗菌性能。试验例2对生物膜形成的影响1、待测样品的制备将实施例1和对比例1-10制备的口腔喷剂和无菌水混合分别配制浓度为试验例1所得最小杀菌浓度的喷雾剂溶液，作为待测样品；同时分别配制浓度2mg/ml(足以达到最小杀菌浓度)的egcg的水溶液、茶黄素的水溶液、原花青素a1的水溶液、甘草查尔酮a的乙醇水溶液(乙醇水溶液中乙醇的质量浓度为10％)，作为待测样品。2、试验方法将培养24h后的具核梭杆菌(或培养5-7天后的牙龈卟啉单胞菌)用bhi肉汤稀释至655nm吸光度为0.2；取灭菌的96孔细胞培养板，向板孔中加入待测样品和100ul上述菌液，37℃无氧条件下培养48h后；吸除培养液和悬浮细菌，只留下形成的生物膜，并用无菌蒸馏水冲洗孔中的生物膜3次，向孔中加入0.4wt％结晶紫对生物膜染色15min；无菌水冲洗孔中经染色后的生物膜4次除去未结合的结晶紫，37℃干燥2h；向上述每孔中加入100ul体积浓度为95％乙醇溶液，摇板10min将生物膜中的色素释放至乙醇中，测试吸光度；将只加无菌水的对照组的吸光度作为100％，测试结果如下表所示：表3不同样品对生物膜形成的影响结论：各单独组分以及对比例中的口腔喷剂虽然在一定程度下也能抑制致病菌形成生物膜，但是明显不如本发明实施例1制备的口腔喷剂对致病菌生物膜形成的抑制效果，说明本发明各原料之间发挥协同作用才能有效抑制致病菌生物膜的形成。试验例3对致病菌生物膜去除能力测试1、待测样品的制备将实施例1和对比例1-10制备的口腔喷剂和无菌水混合分别配制浓度为试验例1所得最小杀菌浓度的喷雾剂溶液，作为待测样品；同时分别配制浓度为2mg/ml(足以达到最小杀菌浓度)的茶黄素水溶液、egcg的水溶液、原花青素a1的水溶液、甘草查尔酮a的乙醇水溶液(乙醇水溶液中乙醇的质量浓度为10％)，作为待测样品。2、试验方法将培养24h后的具核梭杆菌(或培养5-7天后的牙龈卟啉单胞菌)用bhi肉汤稀释至655nm吸光度为0.2，并分别取100ul加入96孔细胞培养板的孔中，37℃厌氧培养48h至生物膜形成；分别向上述每孔中加入待测样品；37℃厌氧培养20min后，吸除培养液和悬浮细菌，孔中只留下生物膜，用无菌水冲洗三次，孔中的生物膜用0.4wt％结晶紫染色15min，再用无菌水冲洗4次，干燥；然后向含有经染色的生物膜的孔中加入100ul体积浓度为95％乙醇，摇板10min将生物膜中的色素释放至乙醇中，测试吸光度；将只加无菌水的对照组的吸光度作为100％，测试结果如下表所示：表4不同样品对生物膜形成的影响结论：各组分以及对比例的口腔喷剂虽然也能去除已形成的致病菌生物膜，但效果明显不如本发明制备的口腔喷剂，说明本发明各原料组分发挥协同作用从而对已形成的致病菌生物膜具有的优异的去除能力。试验例4对口腔上皮细胞的粘附作用的测试1、待测样品的制备将实施例1和对比例1-10制备的口腔喷剂和dmem分别配制浓度为试验例1所得最小杀菌浓度的喷雾剂溶液，作为待测样品；同时分别配制浓度为2mg/ml(足以达到最小杀菌浓度)的茶黄素dmem溶液、egcg的dmem溶液、原花青素a1的dmem溶液、甘草查尔酮a的dmem溶液、杜鹃素的dmem溶液，作为待测样品。2、试验方法将培养24h的具核梭杆菌或者培养5-7天的牙龈卟啉单胞菌用fitc标记；准备口腔上皮细胞悬液，向96孔细胞培养板的孔中分别加入100ul上述细胞悬液进行过夜培养12-16h后，吸除培养液。然后加入100ul待测样品继续培养30min；向上述每孔加入100ul致病菌，在37摄氏度，含有5wt％二氧化碳的培养箱中培养4h；吸除上述孔中未粘附的细菌，pbs冲洗两次，使未黏附于上皮细胞的混合菌彻底清除，测孔中剩余混合物的相对荧光单位代表黏附程度；同时设置对照组，对照组只加入100uldmem，对照组荧光光度为基础荧光度。测试结果如下表所示：表5粘附程度测试数据结论：本发明制备的口腔喷剂较对比例和单一组分明显减少了口腔致病菌对口腔上皮细胞的黏附，说明本发明各原料之间发挥协同作用，从而对口腔各种致病菌如具核梭杆菌，牙龈卟啉单胞菌等具有较好的清除和抗黏附作用。当前第1页12