本发明涉及防治结直肠癌的黄酮类化合物，属于医药领域。
背景技术：
近年来，随着人口老龄化、生活方式及饮食结构的改变，结直肠癌(colorectalcancer,crc)已成为严重威胁身体健康的恶性肿瘤之一，且患者年轻化趋势明显，多数患者就诊时已为中晚期，治疗效果欠佳，术后复发和转移率高。随着外科手术技术及辅助治疗的进步，crc患者的5年总体生存率得到一定程度的改善，但仍有绝大部分中晚期患者术后死于结直肠癌的复发和转移。因此，如何预防crc的复发和转移便成为治疗结直肠癌的难点之一。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供防治结直肠癌的黄酮类化合物，以解决现有结直肠癌治疗药物效果欠佳，尤其是针对中晚期结直肠癌、结直肠癌复发和转移缺乏有效治疗药物的问题。
本发明提供了式ⅰ所示的化合物、其药学上可接受的盐或其晶体在制备治疗和/或预防结直肠癌的药物中的用途：
进一步地，所述药物是治疗和/或预防中晚期结直肠癌、结直肠癌术后复发、结直肠癌术后转移的药物。
进一步地，所述药物降低结直肠癌干细胞频率。
进一步地，所述药物诱导结直肠癌干细胞分化。
进一步地，所述药物抑制结直肠癌细胞增殖。
进一步地，所述药物促进结直肠癌细胞凋亡。
进一步地，所述药物促进结直肠癌细胞晚期凋亡。
进一步地，所述药物是以式ⅰ所示的化合物、其药学上可接受的盐或其晶体为活性成分，加入药学上可接受的辅料或者辅助性成分制备而成的制剂。
进一步地，所述的制剂为口服制剂、注射剂或灌肠剂。
本发明提供了防治结直肠癌的药物组合物，是以式ⅰ所示的化合物、其药学上可接受的盐或其晶体为活性成分，加入药学上可接受的辅料或者辅助性成分制备而成的制剂。
本发明提供了防治结直肠癌的联合用药物，含有用于同时或分别给药的式ⅰ所示的化合物、其药学上可接受的盐或其晶体与5-氟尿嘧啶。
进一步地，所述的联合用药物中活性成分的重量配比为：式ⅰ所示的化合物：5-氟尿嘧啶＝(5～10)：(1～10)。
优选地，所述的联合用药物中活性成分的重量配比为：式ⅰ所示的化合物：5-氟尿嘧啶＝(5～10)：1。
术语“药学上可接受的”是指某载体、运载物、稀释剂、辅料，和/或所形成的盐通常在化学上或物理上与构成某药物剂型的其它成分相兼容，并在生理上与受体相兼容。
术语“药学上可接受的盐”是指本发明化合物与无机和/或有机酸和碱形成的酸式和/或碱式盐，也包括两性离子盐(内盐)，还包括季铵盐，例如烷基铵盐。这些盐可以是在化合物的最后分离和纯化中直接得到。也可以是通过将上述化合物与一定数量的酸或碱适当(例如等当量)进行混合而得到。这些盐可能在溶液中形成沉淀而以过滤方法收集，或在溶剂蒸发后回收而得到，或在水介质中反应后冷冻干燥制得。本发明中所述盐可以是化合物的盐酸盐、硫酸盐、枸橼酸盐、苯磺酸盐、氢溴酸盐、氢氟酸盐、磷酸盐、乙酸盐、丙酸盐、丁二酸盐、草酸盐、苹果酸盐、琥珀酸盐、富马酸盐、马来酸盐、酒石酸盐或三氟乙酸盐。
本发明化合物或药物组合物的施用方式没有特别限制，代表性的施用方式包括(但并不限于)：口服、肠胃外(静脉内、肌肉内或皮下)、和局部给药。
用于口服给药的固体剂型包括胶囊剂、片剂、丸剂、散剂和颗粒剂。在这些固体剂型中，活性化合物与至少一种常规惰性赋形剂(或载体)混合，如柠檬酸钠或磷酸二钙，或与下述成分混合：(a)填料或增容剂，例如，淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和硅酸；(b)粘合剂，例如，羟甲基纤维素、藻酸盐、明胶、聚乙烯基吡咯烷酮、蔗糖和阿拉伯胶；(c)保湿剂，例如，甘油；(d)崩解剂，例如，琼脂、碳酸钙、马铃薯淀粉或木薯淀粉、藻酸、某些复合硅酸盐、和碳酸钠；(e)缓溶剂，例如石蜡；(f)吸收加速剂，例如，季胺化合物；(g)润湿剂，例如鲸蜡醇和单硬脂酸甘油酯；(h)吸附剂，例如，高岭土；和(i)润滑剂，例如，滑石、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、十二烷基硫酸钠，或其混合物。胶囊剂、片剂和丸剂中，剂型也可包含缓冲剂。
固体剂型如片剂、糖丸、胶囊剂、丸剂和颗粒剂可采用包衣和壳材制备，如肠衣和其它本领域公知的材料。它们可包含不透明剂，并且，这种组合物中活性化合物或化合物的释放可以延迟的方式在消化道内的某一部分中释放。可采用的包埋组分的实例是聚合物质和蜡类物质。必要时，活性化合物也可与上述赋形剂中的一种或多种形成微胶囊形式。
用于口服给药的液体剂型包括药学上可接受的乳液、溶液、悬浮液、糖浆或酊剂。除了活性化合物外，液体剂型可包含本领域中常规采用的惰性稀释剂，如水或其它溶剂，增溶剂和乳化剂，例知，乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、丙二醇、1,3-丁二醇、二甲基甲酰胺以及油，特别是棉籽油、花生油、玉米胚油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油或这些物质的混合物等。
除了这些惰性稀释剂外，组合物也可包含助剂，如润湿剂、乳化剂和悬浮剂、甜味剂、矫味剂和香料。
除了活性化合物外，悬浮液可包含悬浮剂，例如，乙氧基化异十八烷醇、聚氧乙烯山梨醇和脱水山梨醇酯、微晶纤维素、甲醇铝和琼脂或这些物质的混合物等。
用于肠胃外注射的组合物可包含生理上可接受的无菌含水或无水溶液、分散液、悬浮液或乳液，和用于重新溶解成无菌的可注射溶液或分散液的无菌粉末。适宜的含水和非水载体、稀释剂、溶剂或赋形剂包括水、乙醇、多元醇及其适宜的混合物。
用于局部给药的本发明化合物的剂型包括软膏剂、散剂、贴剂、喷射剂和吸入剂。活性成分在无菌条件下与生理上可接受的载体及任何防腐剂、缓冲剂，或必要时可能需要的推进剂一起混合。
本发明所述药学上可接受的辅料，是指除活性成分以外包含在剂型中的物质。
本发明所述药学上可接受的辅助性成分，它具有一定生理活性，但该成分的加入不会改变上述药物组合物在疾病治疗过程中的主导地位，而仅仅发挥辅助功效，这些辅助功效仅仅是对该成分已知活性的利用，是医药领域惯用的辅助治疗方式。若将上述辅助性成分与本发明药物组合物配合使用，仍然应属于本发明保护的范围。
本发明提供了防治结直肠癌的黄酮类化合物。体内和体外实验结果表明，本发明化合物能够显著降低结直肠癌干细胞频率，诱导结直肠癌干细胞分化，明显抑制结直肠肿瘤生长，且没有明显的毒副作用，为临床治疗结直肠癌提供了一种全新的、安全的、有效的选择。
附图说明
图1为实施例3中结直肠癌干细胞形态图；
图2为实施例3中pcr法检测结肠分化标记物结果图；
图3为实施例3中免疫荧光检测结肠分化标记物结果图；
图4为实施例4中化合物ys434对结直肠癌干细胞的细胞毒性、增殖及凋亡的影响图；
图5为实施例4中斑马鱼体内检测化合物ys434毒性结果图；
图6为实施例4中化合物ys434与结直肠癌传统化疗药物的联合用药结果图；
图7为实施例5中化合物ys434对源于结直肠癌干细胞源性移植瘤的影响图；
图8为实施例5中化合物ys434在体内诱导结直肠癌干细胞分化图。
具体实施方式
本发明具体实施方式中使用的原料、设备均为已知产品，通过购买市售产品获得。
本发明提供了式ⅰ所示的化合物、其药学上可接受的盐或其晶体在制备治疗和/或预防结直肠癌的药物中的用途：
研究发现在结直肠癌中存在结直肠癌干细胞(cocscs)。cocscs对放化疗都表现出高度耐受性，crc的复发和转移是术后结直肠癌干细胞(cocscs)残留或因为病期相对较晚cocscs已经进入循环所致，cocscs在crc的复发和转移中发挥重要功能。诱导cocscs分化后，肿瘤的致瘤性明显减弱。
针对上述情况，发明人合成了结构如式ⅰ所示的小分子黄酮类化合物ys434。细胞实验表明，化合物ys434能够诱导cocscs的分化，用该化合物处理cocscs两周后，发现可明显减少干细胞频率，从最初的8.7个细胞中就有一个结直肠癌干细胞，减少到22140个细胞中才有一个结直肠癌干细胞；体内实验表明，对移植瘤小鼠腹腔注射化合物ys434，能够将cocscs频率由1/35.2降低至1/240.4。以上实验证明本发明化合物ys434能够在极大程度上耗竭cocscs，诱导cocscs终末分化，提示该化合物在某种程度上可预防crc术后的复发和转移，为综合治疗中晚期结直肠癌提供了一种新的策略和手段。
此外，本发明化合物ys434在细胞实验和体内实验中均没有表现出明显的毒副作用，表明其安全性良好。
进一步地,ys434与现有结直肠癌一线化疗药物5-氟尿嘧啶联合应用时可达到协同增效的作用，使5-氟尿嘧啶在低剂量时就达到很好的抗肿瘤效果,为临床治疗结直肠癌提供了一种全新的、安全的、有效的选择。
实施例1本发明化合物ys434的制备
制备操作步骤包括：
a、将1克中间体1加入到6毫升原甲酸三乙酯中，在常温(15～25℃)下缓慢滴加600微升高氯酸，滴加完毕，常温(15～25℃)搅拌2小时后，再于反应液中加入60毫升乙醚至析出沉淀，抽滤，得红色滤饼；将该红色滤饼溶于30毫升水中，80度加热搅拌4小时，停止反应，用乙酸乙酯对反应液萃取三次，将合并的乙酸乙酯萃取液浓缩、拌样、柱层析纯化。得到600毫克中间体2。
b、将1克间硝基苯胺、3克碳酸钾加入20毫升四氢呋喃，常温(15～25℃)下缓慢加入2毫升氯乙酰氯，滴加完毕，移至60度反应8小时，tlc薄层监控反应完全，将反应液过滤，滤液浓缩，再对浓缩液用乙酸乙酯和水萃取，将乙酸乙酯萃取液浓缩、拌样、柱层析纯化。得到中间体3。
c、将100毫克中间体2、146毫克中间体3、100毫克dbu加入到3毫升正丁醇，先将反应液常温(15～25℃)搅拌0.5小时，再升温至90度反应8小时，冷却，将反应液过滤，滤饼用少量乙醇洗涤，得偏黄白色滤饼，即为中间体4。
d、将100毫克中间体4、30毫克氯化铵加入到16毫升乙醇和4毫升水的混合液中，将反应液升温至80度搅拌10分钟后，缓慢加入60毫克铁粉，再80度反应3小时,tlc薄层监控反应完毕，将反应液过滤，滤液浓缩得偏黄色固体，即为中间体5。
e、将100毫克中间体5加入到10毫升吡啶中，常温搅拌10分钟后，于反应液中加入80毫克酰氯，65度加热反应8小时，tlc薄层监控反应完全，将反应液浓缩，对浓缩液用乙酸乙酯和水萃取，再将乙酸乙酯萃取液浓缩、拌样、柱层析纯化。得到淡黄色化合物ys434。
本发明化合物ys434的结构鉴定：
1hnmr(400mhz,dmso)δ10.20(s,1h),9.89(s,1h),8.22(d,j＝6.0hz,1h),8.14(s,1h),7.98(d,j＝9.5hz,1h),7.87(d,j＝9.0hz,2h),7.45(s,1h),7.33(s,1h),7.26(d,j＝8.1hz,1h),7.21–7.14(m,2h),6.75(d,j＝9.0hz,2h),6.28(d,j＝6.0hz,1h),4.90(s,2h),3.00(s,6h).
13cnmr(101mhz,dmso)δ176.12(s),166.07(s),165.67(s),162.85(s),158.02(s),157.03(s),152.87(s),140.54(s),138.85(s),129.65(s),129.10(s),126.96(s),121.48(s),118.96(s),116.40(s),115.43(s),115.05(s),112.68(s),112.37(s),111.21(s),102.30(s),67.85(s).
ms(esi,正离子)m/z458.05[m+h]+.
实施例2本发明化合物ys434对结直肠癌干细胞频率的影响
1)实验材料
主要试剂：dmem/f2培养基、egf、fgf、b27、glutamax、胰酶等购自gibcobrl公司(invitrogencorporation，usa)，dmso(二甲基亚砜)为sigma公司(usa)产品。实验时用100％dmso配制成10mm储存液，置-20℃冰箱避光保存备用，临用时用完全培养液稀释至所需浓度。体内测试的模型均使用购自北京维通利华实验动物技术有限公司spf级的balb/c裸鼠构建。
结直肠癌干细胞培养及传代
培养：本实验所用的人结直肠癌干细胞均为发明人从结直肠癌患者的肿瘤组织行原代培养所得。用机械和酶方法分离直肠癌细胞原代细胞，利用添加有egf、fgf等无血清添加物及100u/ml青霉素、100μg/ml链霉素的无血清dmem/f12培养基在5％co2、37℃条件下进行结直肠癌干细胞原代培养。
传代：当细胞成球生长至直径为60-100μm时，600rpm，5min收集细胞球，用accutase消化5-10min，培养基终止消化，800rpm，5min，弃上清，用培养基将细胞沉淀重悬细胞，种在新的培养皿中。
2)实验方法
结直肠癌肿瘤干细胞频率分析：肿瘤成球能力分析(tumorsphereformationassay)，是检测肿瘤干细胞自我更新能力的最常用方法。使用流式细胞仪，将单个肿瘤细胞无菌分选至96孔板中，然后对每个孔中肿瘤细胞形成肿瘤球，进行计数和统计。基本步骤如下：
(一)体外检测化合物ys434对cocscs干细胞频率的影响
(1)提前用不同浓度(5μm、10μm)的化合物ys434及等体积dmso分别处理cocscs72小时、1周、2周，用胰酶将不同组的cocscs消化成单细胞后，收集生长状态良好的肿瘤细胞球，分别消化成单个细胞。细胞计数，用无菌pbs重悬细胞至适当浓度。
(2)流式细胞仪的无菌准备：用消毒液清洁流式细胞仪的表面和周围的物品，再将流式细胞仪的管道系统用次氯酸溶液浸泡过夜；第二天，先用次氯酸溶液反复冲洗流式管道系统30分钟，然后用75％的乙醇冲洗流式管道系统30分钟，最后用无菌的含0.5％胎牛血清的pbs冲洗30分钟；调整好液流，准备样品上样。
(3)用流式细胞仪，以单细胞模式分选不同数量组的cocscs单个细胞至相应该孔板中。1个细胞、10个细胞及100个细胞分选至96孔板中；1000个细胞及10000个细胞分选到48孔板中。
(4)37℃，5％co2的细胞培养箱内培养。期间每天用olympusix71倒置显微镜对肿瘤细胞的成球生长进行连续观察，培养12至14天后，对孔板中新形成的肿瘤细胞球数量及不同数量组的cocscs的肿瘤球形成的孔数进行统计，并用有限稀释法软件进行计算。
(二)检测化合物ys434对体内干细胞频率的影响
(1)移植瘤模型的构建：将结直肠癌细胞球用0.05％胰酶消化成单细胞悬液，计数，将细胞重悬成1×106/ml，分装成100μl/管与matrigel1：1混合；常规消毒后，于接种部位(侧腹壁皮下)用1ml胰岛素医用注射器皮下潜行一段后注入准备的细胞悬液，共注射9只balb/c裸鼠；次日开始连续监测小鼠移植瘤成瘤的情况，并对移植瘤体积进行测量，当肿瘤体积达到约200mm3时将9只balb/c裸鼠随机分成3组(两个实验组及一个对照组)，每天给予ys434(两个实验组，给药量分别为25mg/kg和50mg/kg)及等体积溶剂(对照组，5％dmso+10％tween80+10％peg400+75％水)，腹腔注射，持续10天；
(2)将各组移植瘤取下，按原代培养方法消化成单细胞，用流氏细胞仪分选，按体外干细胞频率检测方法进行检测。
3)实验结果
采用以上方法，使用不同浓度的化合物ys434及等体积溶剂分别对结直肠癌干细胞分别处理72小时、1周及2周后，用流氏无菌分选的有限稀释法，对干细胞频率进行检测，具体干细胞频率计算方法采用在线软件进行计算(http://bioinf.wehi.edu.au/software/elda/index.htm)，结果见表1～3：
表1化合物ys434处理72小时后结直肠癌干细胞频率
表2化合物ys434处理1周后结直肠癌干细胞频率
表3化合物ys434处理2周后结直肠癌干细胞频率
从表1的结果可以看出，用化合物ys434处理72小后，结直肠癌干细胞频率从对照组的1/15.7，降低至5μm的1/19.4，当药物浓度为10μm时，干细胞频率进一步降至1/260。
从表2可以看出，用化合物ys434处理1周后，结直肠癌干细胞频率下降得更为明显，降低至5μm的1/51.5，和10μm的1/2737.3。
从表3可以看出，用化合物ys434处理2周后，结直肠癌干细胞频率降低至5μm的1/84，和10μm的1/22140.4。
为了进一步验证化合物ys434降低结直肠癌干细胞频率的作用，又在体内检测了结直肠癌干细胞频率，按方法中的说明进行操作，以等体积溶剂(5％dmso+10％tween80+10％peg400+75％水)作为对照组，将化合物ys434作为实验组，其中实验组分为两个亚组，分别为25mg/kg和50mg/kg组。经药物处理10天，将肿瘤取出按前述方法进行干细胞频率检测，结果见表4：
表4化合物ys434处理后体内结直肠癌干细胞频率
从表4可以看出，将本发明化合物按25mg/kg、50mg/kg给药时，体内干细胞频率由1/35.2分别降低至1/95.4、1/240.4。
以上实验结果表明，本发明化合物ys434能够明显降低结直肠癌干细胞频率，极大程度地耗竭结直肠癌干细胞。
实施例3本发明化合物ys434诱导结直肠癌肿瘤干细胞分化的作用
1)实验材料
primescripttmrtreagentkit购自宝生物(大连)，mucin2、anpep、ck20抗体(abcam)，sybr荧光定量pcr试剂盒(qiagen)。
2)实验方法
(一)细胞形态鉴定：将结直肠癌干细胞球用0.25％胰酶消化成单细胞，计数；每孔1×105～3×106细胞接种于6孔板中，培养4小时；分别加入5um,10um的化合物ys434进行处理48及72小时；采用倒置显微镜观察细胞形态并照相。
(二)realtimert-pcr法检测结肠分化标记物：收集结直肠癌干细胞球，800rpm，离心5min，弃上清；加入预热pbs洗涤细胞一次，加入0.25％胰酶，37℃消化成单个细胞；取1mlfbs培养基重悬细胞，将消化后的细胞按一定比例种于6孔板中，置co2培养箱内，5％co2培养24小时，然后用不同浓度(1μm、5μm、10μm)的化合物ys434处理72小时；达到处理时间后,吸掉培养基，加入预热的pbs洗涤细胞一次，向每孔加入0.5mltrzol吹打充分裂解细胞,按rna提取protocol提取总rna并测定浓度；取1μgrna按takara公司的cdna反转录试剂盒primescripttmrtreagentkit操作说明对提取的rna进行逆转录，稀释5倍后进行pcr。
realtimepcr：针对结肠分化标记物设计特异性引物，杯状细胞标记物tff3、潘氏细胞标记物lysozyme、内分泌细胞标记物chga、吸收细胞标记物anpep、泛分化标记物ck20，行pcr体系如下：
在bioradcfx96实时定量pcr仪上使用退火温度60℃进行pcr。
(三)免疫荧光检测结肠分化标记物：收集结直肠癌干细胞球，800rpm，离心5min，弃上清；加入预热pbs洗涤细胞一次，加入0.25％胰酶，37℃消化成单个细胞；取1mlfbs培养基重悬细胞，将消化后的细胞按一定比例种于提前准备的细胞爬片上，置co2培养箱内，5％co2培养24小时，然后用终浓度为5μm的化合物ys434处理72小时；达到处理时间后,吸掉培养基，加入预热的pbs洗涤细胞一次，加入适量的4％的多聚甲醛，以覆盖住玻片为宜，室温下静止30min对细胞进行固定；pbs洗涤2遍，0.5％的tritonx-100，室温静置20min进行打孔；吸掉tritonx-100，pbs洗涤3次，加入3％的bsa，室温静置30min进行封闭；吸掉3％的bsa，组化笔圈定组织，滴加一抗(结肠细胞分化特异性标记)，置于湿盒中，4℃过夜；吸掉一抗，用pbs洗涤两次，每次5min，避光滴加荧光二抗，室温静置60min，然后避光滴加dapi，室温下静置1min；吸掉dapi，用pbs洗涤三次，每次5min；最后用100％甘油封片，置于正置荧光显微镜下观察并照相。
3)实验结果
为了了解化合物ys434是否能够诱导cocscs分化，分别从细胞形态学和肠细胞特异性分化标记物两种途径检测cocscs的分化。
采用以上方法，用10％fbs、化合物ys434(10μg/ml)及等量溶剂dmso分别对结直肠癌干细胞处理72小时，显微镜下观察细胞形态的变化，见图1。
从图1可以看出，对照组结直肠癌干细胞仍呈悬浮的球形生长，而10％的fbs处理后可以看出其贴壁生长成典型的多边形结直肠癌细胞形态，化合物ys434处理后细胞形态更具多形性。
为了进一步检测化合物ys434是否能够诱导cocscs分化，分别从mrna水平和蛋白水平检测了多种肠终末分化细胞特异性生物标记物，结果见图2、3。
从图2和图3可以看出，用化合物ys434处理后，肠泛分化标记物ck20，肠杯状细胞标记物tff3/mucin2，肠吸收细胞标记物anpep，肠潘氏细胞标记物lysozyme表达明显，提示化合物ys434能能够诱导结直肠癌干细胞向肠终末细胞分化。
实施例4本发明化合物ys434对结直肠癌干细胞毒性、增殖、凋亡及细胞周期的影响1)实验材料
cck8购自medchemexpress公司、edu、
2)实验方法
cck8法检测细胞毒性：将结直肠癌干细胞球用0.25％胰酶消化成单细胞，计数；将细胞按2*104/孔接种到96孔板中，37℃培养箱中培养4小时；分别加入不同浓度的化合物ys434或10％fbs；继续培养72小时后每孔加入10μlcck8，轻敲培养培养板使其混匀；继续培养2-4小时后在450nm测序吸光值。
edu检测细胞增殖：将结直肠癌干细胞球用0.25％胰酶消化成单细胞，计数；每孔1×105～3×106细胞接种于6孔板中，培养4小时；分别加入不同浓度的化合物ys434进行处理48及72小时；用细胞培养基稀释edu溶液，加入6孔板中终浓度约20μm孵育2小时；离心收集细胞，用0.25％胰酶将处理后的结直肠癌干细胞消化成单细胞；pbs重悬细胞，1500rpm离心5min，弃上清；每管加入100～500μl的
annexinv-fitc/pi检测细胞凋亡：将结直肠癌干细胞球用0.25％胰酶消化成单细胞，用pbs洗涤细胞二次(2000rpm离心5min)，计数，收集1～5×105细胞/管；加入500μl的bindingbuffer重悬细胞；加入5μlannexinv-fitc混匀后，加入5μlpropidiumiodide，混匀；室温、避光、反应5～15min；流式细胞仪检测。
斑马鱼体内测试化合物ys434细胞毒性：收取同一时期的斑马鱼卵约600枚，均分到6个培养皿中，分别用不同浓度的化合物ys434处理鱼卵，在同时发育时期在体视显微境下观察斑马鱼发育情况，观察是否有发育畸形、运动异常并照相。
3)实验结果
采用以上方法，分别检测了化合物ys434对结直肠癌干细胞的体外细胞毒性，结果并未发现明显的细胞毒性(图4a)；进一步edu摄入检测细胞增殖发现本发明化合物ys434对细胞增殖具有明显的抑制作用，特别是在较高浓度时对细胞的抑制作用尤其明显(图4)；同样，凋亡检测发现本发明化合物ys434能明显促进细胞的晚期凋亡，但对细胞早期凋亡影响不明显(图4)；斑马鱼体体内检测同样未发现对斑马鱼的发育造成影响(图5)。
5-fu作为一个传统的结直肠癌一线化疗药物目前仍具有不可取代的地位，但其具有骨髓抑制、消化道症状及神经系统症状，特别是在高剂量时尤其明显。在与结直肠癌传统化疗药物5-氟尿嘧啶的联合应用中发现，不管是在48小时还是72小时，1ug/ml5-fu与本化合物ys434联合应用时，能达到单用5-fu10ug/ml的效果(见图6)。这说明本发明化合物ys434与5-fu存在协同作用，能够大大降低5-氟尿嘧啶的用药剂量。
以上实验结果表明，本发明化合物ys434无明显的细胞毒性但可抑制细胞增殖及促进细胞死亡。
实施例5本发明化合物ys434的体内模型实验
1)实验材料
6～8周龄裸鼠购自北京华阜康、matrigel购自bdpharmingen公司、dmso、tween80、peg400均购自sigma上海公司、1ml注射器购自四川新世纪医用高分子制品有限公司。
2)实验方法
将结直肠癌干细胞用0.25％胰酶消化成单细胞后计数，以1×105个/0.1ml与matrigel按1:1混合后接种于小鼠皮下后肋部，待肿瘤长到200mm3后(约10-14天)，小鼠随机分组(n＝8)并开始腹腔注射给药。
实验分组：药物溶剂对照组(5％dmso+10％tween80+10％peg400+75％水)；
化合物ys434：20mg/kgq.d.；
化合物ys434：40mg/kgq.d.；
各组药物溶解于5％dmso+10％tween80+10％peg400+75％水。
观察指标：每3天测量一次小鼠体重及肿瘤长径、短径并计算肿瘤体积(长径×短径2×π/6)，观察有无腹泻，抽搐，皮疹，体重明显降低等反应。
3)实验结果
为了体内验证本发明化合物ys434对cocscs来源的结直肠癌的治疗效果，采用以上方法，用化合物ys434处理源于结直肠癌干细胞的移植瘤，分别采用两个药物浓度处理荷瘤小鼠，结果发现肿瘤生长明显受到抑制，取下肿瘤进行称量进一步验证化合物ys434确实能够抑制cocscs来源的结直肠癌的生长(见图7)。为了了解该化合物的副作用，在监测肿瘤生长的同时，对荷瘤小鼠体重进行监测发现，应用本化合物后并无明显的体重减轻的副作用(图7)。
为了初步了解本发明化合物在体内抑制结直肠癌生长的机制，进一步免疫荧光检测了结直肠细胞的终末分化标记物ck20,杯状细胞标记物mucin2和吸收细胞标记物anpep，结果见图8。从图8可以看出，应用本发明化合物ys434能够在体内明显诱导这些终末分化标记物的表达，这就提示该化合物ys434的体内治疗效果是由于诱导细胞终末分化所致。