本发明属于间充质干细胞应用技术领域，具体涉及人脐带来源的间充质干细胞培养物或其培养物上清的用途。
背景技术：
间充质干细胞(mesenchymalstemcell,msc)是一类具有自我更新、多向分化以及免疫调节的成体干细胞，可从骨髓、脂肪以及围产期脐带和胎盘中分离获得，来源广泛，且移植后不宜产生致瘤性，同时也不涉及伦理争议，因此被广泛应用于临床试验和基础研究。
创伤愈合一直以来都是一个重要的难题，皮肤作为机体与外界接触的屏障的特殊器官，在创伤愈合中起着非常重要的作用。以往研究证实，msc被趋化因子等小分子物质募集至炎症部位，损伤微环境可介导msc向表皮细胞、成纤维细胞分化、血管内皮细胞分化，并发挥抑制炎症反应等等作用，达到重构皮肤组织，加速创面愈合和减少瘢痕形成等，被认为是构建全层皮肤的理想种子细胞。但是msc移植仍存在一定潜在的风险，且治疗费较高，为此探索msc治疗皮肤损伤的新策略显得尤为重要。humsc分泌物冻干粉具有易于分离纯化、存储简便、治疗方法快捷等优点，因此具有更好的应用前景。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供人脐带来源的间充质干细胞培养物或其培养物上清在制备促进皮肤损伤修复、促进血管生长、消炎、促进胶原纤维累加药物中的应用。
上述应用中，所述间充质干细胞培养物或其培养物上清制备方法包括：
(1)培养原代人脐带来源的间充质干细胞，并进行传代培养；
(2)传代至p3或p4代，收集p3或p4代的间充质干细胞；
(3)用间充质干细胞无血清培养基培养p3或p4代的间充质干细胞，当p3或p4代的间充质干细胞融合度为60％-80％时，收集培养物或培养物上清。
上述应用中，所述原代人脐带来源的间充质干细胞制备方法为：采用组织贴壁法，取离体的脐带，剥离羊膜和血管后剪碎组织，放入含10％fbs的a-mem完全培养基培养进行，待细胞从组织块中爬出，得到原代人脐带来源的间充质干细胞。
上述应用中，收集培养物或培养物上清的方法为：吸取间充质干细胞培养物或培养物上清，离心，弃死细胞和碎片。
本发明的目的还在于提供人脐带来源的间充质干细胞分泌物在制备促进皮肤损伤修复、促进血管生长、消炎、促进胶原纤维累加药物中的应用。
所述分泌物包括cd105、cd73、cd166、tgf-β、egf、fgf和/或vegf。
所述分泌物的制备方法可以按照间充质干细胞培养物或其培养物上清制备方法进行或者进一步浓缩、提取、纯化。
本发明的目的还在于提供一种不含添加物成分的、制作工艺简便、成本较低的间充质干细胞分泌物组合物。
所述组合物包括间充质干细胞培养物或其培养物上清。
上述组合物中，所述间充质干细胞为人脐带来源的间充质干细胞。
上述组合物中，所述组合物为冻干粉，所述冻干粉的制备方法包括：
(1)培养原代人脐带来源的间充质干细胞，并进行传代培养；
(2)传代至p3或p4代，收集p3或p4代的间充质干细胞；
(3)用间充质干细胞无血清培养基培养p3或p4代的间充质干细胞，当p3或p4代的间充质干细胞融合度为60％-80％时，收集培养物或培养物上清。
(4)将收集的培养物或培养物上清，进行冻干粉的制备，收集粉末。
上述组合物中，所述原代人脐带来源的间充质干细胞制备方法为：采用组织贴壁法，取离体的脐带，剥离羊膜和血管后剪碎组织，放入含10％fbs的a-mem完全培养基培养进行，待细胞从组织块中爬出，得到原代人脐带来源的间充质干细胞。
上述组合物中，所述收集培养物或培养物上清的方法为：吸取无血清的msc培养上清，离心弃死细胞和碎片。
上述组合物中，所述冻干粉制备的制备方法包括：
凝胶过滤除盐脱色后启动冻干程序；冻干程序如下：
预冻阶段：-50℃，2h；
初步蒸发阶段：-40℃—-5℃，8h；
干燥：0-24℃，6h；
冻干：25-30℃，6h。
优选的，所述冻干程序如下：
预冻阶段：-50℃，2h；
初步蒸发阶段：-30℃—-15℃，8h；
干燥：0-12℃，6h；
冻干：25-30℃，6h；
最优选的，所述冻干程序如下：
预冻阶段：-50℃，2h；
初步蒸发阶段：-28℃，8h；
干燥：8℃，6h；
冻干：27℃，6h。
本发明提供了人脐带来源的间充质干细胞培养物或其培养物上清在制备促进皮肤损伤修复、促进血管生长、消炎、促进胶原纤维累加药物中的应用。所述间充质干细胞来源于脐带组织，无需低氧等条件培养，只需正常培养细胞调节即可；细胞传代次数较低，为p3、p4代细胞，不会影响间充质干细胞的干性，为此本申请的间充质干细胞培养上清成分更接近msc的自然生长代谢成分，更为纯粹，治疗效果更好。结果表明，msc上清冻干粉可快速促进皮肤损伤愈合，减轻炎症反应，并可促进新生血管的生成和胶原积累。
本发明的间充质干细胞分泌物组合物，包括间充质干细胞培养物或其培养物上清。所述间充质干细胞培养物或其培养物上清是用无血清培养基培养细胞后得到的，无需分子筛过滤，只需离心去除死细胞和细胞碎片，可以直接冻干成粉末，无需其它添加物(如高辅酶等)即可保持稳定。制备的冻干粉的溶解只用磷酸盐缓冲溶液溶解，不含其它添加物应用更为方便，效果更好。
附图说明
图1为人脐带来源的msc分离、鉴定图(scalebar为800μm)：a为msc表型，b为油红o染色检测msc成脂肪细胞分化能力结果，c为碱性磷酸酶染色检测msc成骨分化能力结果，d为流式细胞术检测msc免疫表型。
图2为msc高表达的生长因子的检测结果。
图3为msc培养物冻干粉对于小鼠皮肤损伤愈合的影响结果；a为皮肤损伤修复的外观变化，b为皮肤损伤修复愈合率。
图4为msc培养物冻干粉对于损伤部位的炎症因子表达以及生长因子的表达的影响。
图5为msc培养物冻干粉对于血管内皮生长因子的表达的影响。
图6为msc培养物冻干粉对于损伤部位的胶原积累的影响(a为对照组；b为实验组，scalebar为200μm)。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明做进一步说明，但本发明的保护范围不限于此。以下实施例中所用到的实验方法如无特殊说明均为常规的方法，所用试剂如无特殊说明，均为市售。
实施例1脐带来源的msc分离、鉴定
取正常分娩的脐带，无菌环境下将脐带剪成1cm的小段，将剪碎的脐带组织放入含10％fbs的α-mem完全培养基培养72h后，每隔2-3d更换一次培养液，待爬出细胞达到80％融合度时，加入0.25％胰蛋白酶消化传代。原代人脐带来源的msc培养5天，显微镜下观察发现脐带组织周围有纤维状、贴壁的msc爬出。随着传代培养msc生长较快，纯度变高，所有细胞都呈长梭形、旋涡贴壁生长，符合msc体外培养的特征，如图1(a)所示。收集p3代msc流式检测发现其高表达cd105、cd73、cd166等，低表达或不表达cd34、cd45以及cd14，如图1(d)所示；体外诱导分化表明培养的msc均可向成脂、成骨诱导分化，如图1(b-c)所示。综上所有结果表明：成功分离培养了脐带来源的msc。
实施例2msc高表达的生长因子
体外培养的msc细胞生长代谢会分泌一些促生长相关因子，为此检测msc表达再生因子情况。0.25％胰酶消化培养p3代的msc，提取msc的总rna，逆转录为cdna，q-pcr结果显示：msc可以高表达tgf-β、egf、fgf、vegf等相关生长因子，其中vegf表达水平最高，如图2所示。
实施例3培养物或培养物上清冻干粉的制备
收集p3代msc，采用无血清培养基培养48h后，吸取无血清的msc培养上清，离心弃死细胞和碎片，收集的培养物或培养物上清。
将收集的收集培养物或培养物上清，采用凝胶过滤除盐脱色，放入真空冷冻干燥机的冻干室，根据蛋白生物学特性设定的程序进行预冷、冻干等程序进行冻干粉的制备，程序运行结束后收集粉末。冻干程序如下：
1、预冻阶段：-50℃，2h；
2、初步蒸发阶段：-28℃，8h；
3、干燥：8℃，6h；
4、冻干：27℃，6h。
称量30mg粉末溶于30mlpbs中，制成1mg/ml的冻干粉溶剂，分装到ep管低温保存，以维持蛋白分子活性。
实施例4msc上清可以促进小鼠皮肤损伤愈合
采用打孔器在小鼠背部打孔(直径为1cm)，建立小鼠皮肤损伤模型。从建模当天起将实施例3制备的1mg/mlmsc上清冻干粉溶剂用棉签涂抹于皮肤损伤处直至伤口愈合，每日三次，作为实验组。对照组则用pbs涂抹，分别在涂抹后0、4、7、10d观察创面愈合情况。
涂抹msc上清的实验组和涂抹pbs的对照组背部伤口动态变化。从第0天开始，实验组小鼠背部创伤发生的炎症反应程度弱与对照组，从第4day开始实验组小鼠的背部的创面愈合速率大于对照组，并且这种现象一直持续到实验结束。观察拍照时测量伤口边缘周长，计算面积大小，根据记录的伤口面积计算创面愈合率，其中实验组愈合率为90.1％±4％，对照组愈合率为53.3％±5.8％，实验组高于对照组，(p<0.05)且具有统计学意义，如图3所示。
实施例5msc上清可以减轻损伤部位的炎症反应以及促进损伤部位皮肤再生
检测修复过程的炎症发生和损伤皮肤再生情况，取实验组、对照组小鼠的创伤部位组织，提取rna，逆转录为检测损伤后创伤部位的炎症因子ifn-γ、tnf-α表达，q-pcr结果显示实验第4天msc上清组的小鼠ifn-γ、tnf-α表达低于对照组，同时，检测促进组织再生的因子fgf、tgf-β，q-pcr结果显示实验第10天msc上清组小鼠表达的这些生长因子水平高于对照组，这些结果提示，msc上清在损伤修复过程中既可以减轻炎症反应，也可促进各类生长因子的表达，从而加速皮肤损伤的修复，如图4所示。
实施例6msc上清也可以促进血管内皮生长因子的表达
新生血管能给创面提供充足氧、营养物质和生长因子是损伤修复过程的关键因素。vegf是促进血管再生的关键因子，为此实验第10天分别取实验组、对照组损伤部位组织，用含有蛋白酶/磷酸酶抑制剂的组织裂解液，裂解组织，提取蛋白并定量，检测血管再生的相关因子vegf表达。westernblot结果显示msc上清组的vegf因子表达高于对照组，提示msc上清可以促进损伤部位的血管形成，如图5所示。
实施例7msc上清可以促进损伤部位的胶原表达
胶原再生对创面修复过程异常重要，皮肤再生时胶原再生能够消除瘢痕，促进伤口愈合等。实验第10天，分别取实验组、对照组损伤部位组织放入含有组织固定液的小青瓶，masson染色。结果显示实验组小鼠的损伤部位胶原纤维(蓝色代表胶原纤维)多于对照组，如图6所示。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。