本发明属于保健食品及药品生产的技术领域，具体涉及一组改善由甲状腺功能亢进导致高转换型骨丢失及骨生物力学性能下降的药物组合物的配方及生产工艺。
背景技术：
甲状腺功能亢进症是指人体内甲状腺激素水平升高，引起机体神经、循环、消化等系统兴奋性增高，以全身代谢亢进为主要特征的临床疾病总称,是临床上常见的器官特异性自身免疫性甲状腺疾病，也是人体内能量消耗过多的一种高耗能疾病。临床上此病常表现为心悸、失眠、易怒、消瘦等高代谢症候群。以甲状腺功能亢进症为代表的甲状腺疾病已成为内分泌科的第二大常见疾病，仅次于糖尿病。甲状腺功能亢进症可在任何年龄段发生，男女均可发病，中青年女性多发，年龄大多在20-40岁，据统计，甲亢正以发病率逐年上升及低龄化的趋势影响人们的健康。甲状腺功能亢进症可引起继发性骨质疏松症，临床研究表明，甲亢导致的骨质疏松呈现高转换型，即过量甲状腺素（th）通过对骨骼的直接作用，促使破骨细胞和成骨细胞活性均增强，破骨作用增加，成骨作用也增加，但是由于破骨细胞的破骨活性大于成骨细胞的成骨活性，从而导致骨量的丢失进，形成了高转换型的骨质疏松。临床从甲亢患者血清骨转换指标的检测中发现，骨形成标记物碱性磷酸酶（alkalinephosphatase,akp）、骨钙素（boneglaprotein,bgp）和ⅰ型前胶原氨基末端前肽（pinp）水平升高，表明甲亢状态下成骨细胞活性增强；与此同时，ⅰ型胶原交联羧基末端肽（ictp）水平明显升高，说明甲亢时伴有过度破骨细胞活性增强，出现过度骨吸收。从骨组织形态计量学测量可见，甲亢患者骨小梁数量减少，皮质骨变薄伴骨髓腔变大，说明甲亢时骨吸收超过骨形成，进而导致净骨量减少，从而出现骨质疏松。骨质疏松症是以骨强度下降、骨量减少，骨微结构退化为特征进而导致骨的脆性和骨折风险增加的一种全身性骨骼疾病。目前，随着老龄化进程的加速，骨质疏松症已经成为世界多发病、常见病，位居慢性病的第3位，排名前2位的分别是心血管疾病和糖尿病。目前我国骨质疏松发病人数呈现明显上升趋势，严重影响中老年人身体健康和生活质量，同时给国家、社会和家庭带来沉重负担。据一项研究显示，我国骨质疏松症的总患病率为6.6%~19.3%，平均占13%。我国2013年人口普查结果显示，岁数>60的人数约为2.02亿，预计到2050年该群体可能达到4亿，罹患骨质疏松症或者骨密度值低的患者将会达到2.12亿，骨质疏松症将成为更加严重的公共健康问题，因此找到骨质疏松症的治疗方法刻不容缓。
甲亢性骨质疏松的发病机制尚未被完全阐明，正常水平的甲状腺激素对骨骼的生长和发育至关重要，假如缺乏将导致呆小症，目前已知th可能通过调节ihh-pthrp负反馈通路、生长激素/胰岛素样生长因子1信号、成纤维细胞生长因子信号及wnt-β信号通路来参与膜内成骨和软骨内成骨。切除甲状腺的甲减大鼠肥大性软骨细胞分化受到抑制，甲状旁腺激素相关蛋白（pthrp）mrna增加，而高剂量补充t4的甲亢大鼠甲状旁腺激素相关蛋白受体（pthrp-r）mrna表达减少，pthrp作为一个负性调控信号抑制肥大化软骨细胞分化进而致生长迟缓，而pthrp-r的缺失导致未接收到pthrp的负性调节从而促进肥大化软骨细胞分化和加速线性生长。不仅如此，trαo/o小鼠生长板ghr、igf-ⅰr、stat、akt及fgfr1/3表达减少，相反地trβ-/-小鼠ghr、igf-1r及fgfr3表达上升，说明t3可通过gh-igfⅰ信号通路触发软骨细胞成熟，调控生长期的骨骼生长；但不同的是fgfs是在胚胎发育期中正常骨骼发育、骨形成和骨重塑中起重要作用。wnt/β-catenin通路是t3介导生长板软骨细胞最终分化的主要机制之一，t3的促关节软骨分化作用可被wnt拮抗剂阻断，但骺板软骨细胞wnt-4、β-catenin、runx2/cbfa1蛋白在t3作用下可使x型胶原形成增加，促进关节软骨分化。小鼠基因剔除实验表明甲状腺激素亦通过骨骼细胞trα受体调节成年动物的骨重塑，一方面t3可通过fgfs、tgf-β、igf-1信号促进成骨细胞的增殖和分化，另一方面t3又可通过rankl-rank信号通路促进成熟成骨细胞-破骨细胞偶联激活，并诱导il-6、前列腺素e2（pge2）参与破骨细胞的活化。促甲状腺激素（tsh）可能通过抑制破骨细胞的活性，促进成骨细胞增殖使骨重建失偶联。促甲状腺激素（tsh）抑制破骨细胞的骨吸收而促成骨细胞骨形成使骨重建解偶联。tshr-/-小鼠及tshr信号缺陷的hrt/hrt小鼠均表现为破骨细胞的活性增加而致骨量净丢失，机制研究表明tsh的抗破骨细胞作用可通过nf-κβ、jnk信号及tnf-α的产生介导。tsh通过结合两个高移动性组框蛋白质（hmgb1及hmgb2）抑制tnf-α合成，从而减少破骨细胞前体ocps数量；与之相似的是在tshr-/-小鼠tnf-α表达上调，加入抗tnf-α抗体抑制破骨激活。通过减弱jnk/c-jun和nf-kb信号对rankl和tnf-α的应答可抑制破骨细胞分化。相对于破骨细胞，tsh调节成骨细胞的作用机制目前所知较少，大鼠去卵巢模型予tsh治疗可抑制骨质流失，促进骨形成，在小鼠胚胎干细胞中发现tsh可通过激活蛋白激酶cδ和上调非经典wnt通路下的卷曲相关蛋白和wnt5a刺激es成骨细胞方向分化。然而trαo/o，trα1pv/+，trα1r384c/+小鼠在tsh水平正常的情况下表现为骨小梁质量升高，但是trβ-/-、trβpv/pv、trα1-/-和trβ-/-小鼠都在tsh水平明显上升情况下表现为骨质疏松或者骨矿化率下降。说明甲亢性骨质疏松并非单由th异常所致，tsh的降低也参与其中，且可能独立于th的作用。
甲亢性骨质疏松症的药物治疗，目前推荐在治疗原发性疾病的基础上，配合抗骨质疏松策略以降低未来的骨折风险。临床上发现，甲亢伴随骨质疏松症的患者在经过抗甲亢治疗后其骨密度几乎得到逆转，但是也有研究显示积极抗甲亢治疗后bmd仍然低于正常对照组;或者有甲亢病史的患者其bmd仍较无此病史者低。故有科研工作者主张在治疗甲亢的同时进行补钙或者加用双膦酸盐类或联合补钙和双膦酸盐来增加bmd值，治疗骨质疏松症。从甲亢性骨质疏松症的病理生理机制上看，补钙可对症治疗甲亢导致的钙磷失衡，而双膦酸盐类药物可通过抑制破骨细胞骨吸收对因治疗甲亢引起骨转换频率过快。目前没有研究可证实双膦酸盐类药物可降低女性绝经后骨质疏松症患者的骨折风险，甚至可能增加其骨折风险，因为有研究发现长期服用双膦酸盐的老年人有增加髋部骨折的风险，未来需要研究证实应用双磷酸盐类和（或）其他药物增加其bmd能降低骨折风险的可行性。一项meta分析运用z值来预测显示未进行治疗的甲亢患者骨折风险远远高于治疗以后，手术、i131或者药物治疗均可降低骨折风险，但也有研究发现i131治疗或许可能增加其风险。
骨化三醇是治疗甲状腺功能亢进性骨质疏松症的常用药物，它是维生素d3的活性代谢产物之一，通常在肾脏内由其前体25-羟基维生素d3转化而来。骨化三醇也是糖皮质激素性骨质疏松症的一线治疗药物。骨化三醇可有效促进在骨形成过程中肠胃对钙的吸收，升高血钙浓度，为骨矿化提供原料。研究发现，甲状腺功能亢进症伴随有轻度高水平的血钙/磷症，尿钙/磷排泄增加，加上甲亢常导致腹泻，肠钙吸收率下降，导致pth、ct及1,25（oh）2d3受抑制表达水平降低，这些因素都可导致骨质疏松的发生，提示此可能是甲亢性骨质疏松的病因之一。也有研究发现，骨化三醇可通过增加增加肠道对钙的吸收间接抑制甲状腺素，也可以直接抑制甲状旁腺细胞生成，从而抑制甲状腺素的合成，故表明骨化三醇除具有传统观点上认为的升高血钙，改善骨形成的作用外，还具有免疫调节的功能。研究发现，服用骨化三醇的甲亢患者血清25-(oh)d3水平明显升高伴有甲状腺自身抗体水平下降。因此，骨化三醇在甲亢性骨质疏松中起到重要作用。研究发现老年人中维生素d水平的下降与肌肉质量变差有密切关系，活性维生素d3能提高老年人肌肉的质量和增强其力量和平衡力，故推测骨化三醇有可能改善慢性甲亢性肌病。
本课题组已经证明中药丹参对骨质疏松有很好的预防作用，特别是对糖皮质激素导致的骨质疏松有明显的防治作用，我们发现，丹参水提液主要为丹参多酚类物质，可通过抗氧化、抗炎和改善微循环，促进成骨细胞的活性进而发挥抗骨质疏松的作用。以丹参水溶性成分为主的丹参注射液和丹参多酚酸盐已广泛用于治疗冠心病的胸闷和心绞痛，尽管以丹参酮为代表的脂溶性成分在骨质疏松方面的作用已早有研究，但因为丹参通常采用水煎煮方式来治疗疾病，因此有理由认为是水溶性成分在起作用。结合丹参的药理学作用，提出了丹参水溶性成分预防甲亢性骨质疏松的几点依据：（1）具有扩张血管、抗脂质氧化，抗血栓形成和改善微循环等药理作用，可能可预防甲亢引起的心肌肥大。（2）具有抗脂质氧化作用可能可对抗甲亢性骨质疏松的骨髓脂肪化形成的作用。（3）具扩张微循环的作用可能可对抗甲亢的骨髓微循环压力升高作用。（4）具促进骨合成的药理作用。（5）具抗炎、调节免疫机能作用，丹参可能可预防甲亢引起的骨骼-肌肉系统以及心血管系统的不良反应。我们的研究发现，丹参水溶性化合物丹参素等成分对抗骨质疏松起到重要作用，有极大的抗骨质疏松潜力，研究发现丹参水提物能提高糖皮质激素性骨质疏松大鼠的有机羟脯胺酸含量，改善血钙紊乱、增加骨小梁面积百分数，提高骨形成率。此外丹参水提物和丹参素可提高从乳鼠颅骨分离带到的成骨细胞碱性磷酸酶alp的活性，提示丹参水提物有促骨形成作用。也有研究通过hplc法确定三种丹参水提有效部位群中丹参素、丹酚酸b和原儿茶醛这三种成分的含量和比例，发现这三种丹参水提有效部位群均可有效的抵抗糖皮质激素性骨质疏松大鼠松质骨的骨丢失，丹参素、原儿茶醛和丹酚酸b的比例为2:1:2时对股骨的修复作用最佳。我们课题采用的盐酸水提法制备的丹参水提液（丹参骨宝2号）与传统水提方法比较发现丹参素含量提高了3.28倍，体外实验发现含有较高含量的丹参素和具有一定比例的丹酚酸b、原儿茶醛的丹参骨宝2号可有效提高成骨细胞alp活性。丹参水溶性成分主要包含丹参素和丹酚酸b,体外实验发现丹参素和丹酚酸b促进骨髓基质细胞往成骨方向分化，提高alp的表达，抑制成脂分化;丹参素抑制氧化应激，上调β-catenin表达水平，抑制foxo3aa表达，上调wnt信号，从而促进成骨细胞的增殖、分化和矿化，进而导致骨形成增加。丹参素可改善地塞米松性骨质疏松斑马鱼模型造成的骨质流失，提高骨钙素和碱性磷酸酶活性水平。在动物实验方面，丹参素可预防糖皮质激素诱导的骨质疏松，这主要与丹参素的抗氧化应激有关。另有研究发现丹参对糖尿病大鼠早期牙槽骨骨质疏松有抑制作用，可能与丹参在一定程度上升高血清骨钙素含量，降低血清抗酒石酸酸性磷酸酶含量有关；丹参素能逆转甲状腺素引起的血管收缩舒张反应，对甲亢大鼠血管平滑肌有保护作用，可能与丹参素改善平滑肌钙通道功能和保护nos有关。丹参素可通过减少肌肉泛素化水平来降低糖皮质激素引起的肌肉蛋白降解，提示丹参素可能对甲亢引起的肌肉病变有抵抗作用。因此，我们认为丹参中主要水溶性成分丹参素具有抗炎、抗氧化、改善微循环的特点，该特点可以针对甲亢性骨质疏松和肌肉病变的共同发病机制进行治疗，然而目前丹参素对甲亢性骨质疏松和肌肉病变的治疗尚未见报道。本研究探讨丹参素对甲亢性骨质疏松和肌肉病变的大鼠模型的作用及影响，为寻找理想的防治甲亢性骨质疏松和肌肉病变的药物提供科学依据。
果糖是一种最常见的己酮糖，属于单糖，为葡萄糖的同分异构体。大量存在于水果和蜂蜜中，由于其升糖指数远低于葡萄糖等传统糖，也被称为“健康糖”，和葡糖糖结合构成日常生活中食用的蔗糖。果糖主要由肝脏代谢，与葡萄糖代谢不一样，果糖可绕过糖酵解途径的关键酶（磷酸果糖激酶），故在肝脏中，果糖的分解速度大于葡萄糖，而且果糖的代谢不需要依赖胰岛素，进入血液后在没有胰岛素的情况下也可迅速转化为肝糖原，参与代谢，有效迅速地降低血糖波动。在某些国家已成为仅次于葡萄糖的第二大高能量营养输液，因为果糖的摄入不刺激胃分泌抑胃肽，可刺激胰岛素分泌，而且胰腺不含glut5，使其不能摄取果糖从而刺激胰岛素分泌，故果糖在短期内可用于糖尿病病人补充能量而不影响血糖浓度。果糖与肠粘膜上皮细胞载体蛋白结合后，能顺利地被吸收(尽管慢于葡萄糖的吸收)，在肝(是最主要的部位)、肾和小肠内被特异性果糖激酶作用而生成1-磷酸果糖。之后，在1-磷酸果糖醛缩酶的催化下生成磷酸二羟丙酮和甘油醛。后者通过甘油醛激酶的磷酸化而生成3-磷酸甘油醛。果糖入肝后，在特异的1-磷酸果糖醛缩酶的作用下，可迅速转变成葡萄糖并加入“cori循环”：果糖在肝内被转化成葡萄糖→肝糖元→血糖→肌糖元→血乳酸→肝糖元。这一重要循环的存在，有助于机体维系血糖的正常水平；有助于运动中堆积之乳酸的消散和充分利用；有助于机体肝糖元和肌糖元的再合成。肝、肾、小肠和神经系统等多个组织可表达gult5、gult2特异性转运果糖的跨膜蛋白。裸鼹鼠（nakedmole-rat）是一种大脑可以耐受缺氧长达18分钟而无功能损害的代表，科学家发现其机制是在缺氧条件下，裸鼹鼠利用果糖进行糖无氧酵解而达到快速供应能量而保证大脑组织的正常，果糖代谢在在此过程中备受关注。有研究指出，骨骼可能参与能量代谢，大量研究表明日常糖的摄入量与骨形态和骨强度呈负相关，因此高糖饮食可能通过改变代谢进而影响骨量和骨质量。目前骨组织中尚未发现果糖特异性转运蛋白的表达，有关单糖中的果糖和葡萄糖对骨骼的影响鲜有研究。有研究发现，与普通饮食的动物相比，高果糖饮食并没有给动物带来骨组织方面的不良影响，甚至于与高葡萄糖饮食相比，高果糖饮食可改善骨微结构提高骨质量，对果糖代谢和果糖是如何保持骨组织良好健康状态的，研究者目前尚不清楚，但是均猜测可能与能量代谢过程有关，通过维持能量循环供应的良好状态而达到骨微环境的动态平衡。1,6二磷酸果糖作为糖酵解的中间物质，近几十年来用于治疗心肌缺血、急性肺损伤、缺氧性脑损伤、缺血性急性肾功能损伤。体外研究发现1,6二磷酸果糖可促进骨形成过程中钙积累来调节骨代谢，可能是因为1,6二磷酸果糖有抗氧化能力，可抵抗氧化应激对骨的破坏作用。体外细胞实验也发现果糖可减少肌小管脂肪堆积，升高pampk，降低lipin1和mttp，表明果糖对骨组织和肌肉是有保护作用的，而且可能与能量代谢相关。能量代谢是伴随细胞组织分化过程中常见的生理活动，有研究证明糖酵解-三羧酸循环-氧化磷酸化在成骨及破骨细胞增殖分化的不同步骤及过程中扮演不同角色；而过量甲状腺激素可促进多个组织如肌肉组织、肝组织及脑等多个组织热量产生增加，其机制均与诱导糖代谢的多个不同酶表达相关。我们的前期研究中通过itqar技术检测甲亢性骨质疏松大鼠骨组织蛋白质组发现大部分糖酵解-三羧酸循环-氧化磷酸化能量代谢酶包括所有关键酶表达增高，随后我们在成骨细胞实验中证实糖酵解-三羧酸循环-氧化磷酸化的关键酶均在过量的甲状腺激素作用下表达增高。这表明甲状腺功能亢进通过提高骨组织及成骨细胞的糖酵解-三羧酸循环-氧化磷酸化能量代谢与其高骨转化型的骨代谢相关联，至少成骨细胞的能量活跃是甲亢性骨重建失偶联的机制之一。鉴于果糖可能通过改变能量代谢改善骨质量，我们认为，果糖与丹参结合，应该是一组理想的防治甲亢性骨质疏松症的药物组合物。
技术实现要素：
本项目申请人提出，用果糖和丹参组成的以改善甲亢病人能量代谢为目标的保健食品，可以通过改善甲亢病人的糖代谢，脂肪代谢及蛋白质代谢的作用，从而发挥防治甲亢这种高能量消耗导致的骨质疏松症等，保证人体健康并延缓衰老。我们的发明是这样实现的：选择中药丹参，或者丹参的提取物丹参素和果糖组成一种新的组合物，按照药学工艺制备成可用于临床的制剂，这种组合物可以改善由于体内内分泌激素失调，特别是甲状腺功能亢进导致骨高转换型丢失的骨质疏松症及骨的生物力学性能下降，这些药物组合物可以按照下述药物配方组合及工艺制备成注射液。
（1）丹参素果糖注射液的配方及生产工艺：
（2）丹参素原儿茶醛果糖注射液的配方及生产工艺：
（3）复方丹参素果糖注射液的配方及生产工艺是：
（4）丹参果糖注射液的制备工艺：把丹参500g，甘草200g粉碎为粗粉，加15倍水蒸煮两次，第一次3小时，第二次2.5小时，合并蒸液，过滤，滤液浓缩至1500ml，加乙醇使含醇量达75%，静置冷藏24小时，过滤，滤液减压回收乙醇并浓缩至800ml，再加乙醇使含量达85%，静置冷藏24小时，过滤，滤液减压回收乙醇并浓缩至700ml，添加结晶果糖，加注射用水稀释至4000ml，静置冷藏24小时，过滤，滤液浓缩至1000ml，用10%氢氧化钠调ph6.8~7，加入活性炭，煮沸20分钟，过滤，将亚硝酸钠加入滤液中，溶解后，滤液再精滤，在滤器上加注射用水至1000ml，灌封，灭菌，即得。
本发明提到的一组由丹参提取物与果糖组成的可改善由甲状腺功能亢进导致高转换型骨丢失及骨力学性能下降的药物组合物，还可按下述配方及生产工艺制成颗粒制剂。
（1）丹参果糖颗粒的制备：
（2）丹红果糖颗粒的制备：
（3）丹草果糖颗粒的制备：
本发明提到的一组由丹参提取物与果糖组成的可改善由甲状腺功能亢进导致高转换型骨丢失及骨力学性能下降的药物组合物，还可按下述配方及生产工艺制成饮料。
（1）丹参果糖饮料的制备工艺：
（2）丹参果葡糖饮料的制备工艺：
具体实施方式：
以上列举的丹参提取物与果糖组成的可改善由甲状腺功能亢进导致高转换型骨丢失及骨力学性能下降的药物组合物，可以按照上述配方与生产工艺制备成临床可以应用的药物制剂，是本发明的具体实施例，但是本发明的保护范围并不限于这些实施例，凡是不背离本发明构思的改变或等同替代均包括在本发明的保护范围之内。
实施例一
为了验证本发明的丹参果糖组合物对甲状腺功能亢进导致骨高转换型丢失及骨力学性能的改善作用，发明人做了如下的动物实验。
动物实验采用spf级雄性sd大鼠96只，3月龄，体重325±25g，由广西医科大学提供，合格证号：scxk桂2014-0002。饲养环境：清洁，室温23℃，相对湿度70%，自由摄水、摄食，分笼饲养。大鼠用标准饲料喂养（钙含量为1.11%，磷含量0.74%，维生素d为1510iu/kg），购自北京科澳协力有限公司。适应性喂养1周后，进行实验，周期为12周。实验过程中每天观察大鼠进食、饮水、活动情况并记录，每周称重，并按体重变化调整给药量。实验用的建立甲亢动物模型的药物为左甲状腺素钠片（50ug/片x100片，批号：209731，由德国merckkgaa生产），实验时取左甲状腺素钠片（50ug/片）43片研磨，加入生理盐水50ml，即得浓度为43ug/ml的药物混悬液，按5ml/kg/d的大鼠灌胃量进行灌胃建立甲亢动物模型。
在实验开始前两周，按随机区组法即配伍分组法原则，先将动物分别按体重区分为若干个区组，然后将各区组通过microsoftexcel软件随机函数rand平均分配到12组，每组8只，其中1组为空白对照（con）组，2组为模型（hyp）组，3组为hyp+罗盖全（cal）组，4组为hyp+阿仑膦酸钠（aln）组，5组为hyp+果糖（fru）组，6组为hyp+丹参水提液组（dst）组，7组为hyp+丹参素（ds）组，8组为hyp+丹参素+阿仑膦酸钠（ds+aln）组，9组为hyp+丹参素+果糖（ds+fru）组，10组为hyp+丹参水提液+果糖（dst+fru）组，11组为停药对照（t-con）组，12组为停药模型（t-hyp）组，实验设计分组与药物干预见表1。
表1：实验设计分组与药物干预。
具体给药方法。
①空白对照组（con）：实验小鼠给予正常饮食，灌胃给予生理盐水5ml/kg/d。
②模型（hyp）组，实验小鼠给予正常饮食，上午灌胃给予左甲状腺素片0.25mg/kg/d，下午灌胃给予生理盐水5ml/kg/d。
③hyp+罗盖全（cal）组，实验小鼠给予正常饮食，上午灌胃给予左甲状腺素片0.25mg/kg/d，下午灌胃给予罗盖全0.045ug/kg/d。
④hyp+阿仑（aln）组，实验小鼠给予正常饮食，上午灌胃给予左甲状腺素片0.25mg/kg/d，下午灌胃给予阿仑膦酸钠1mg/kg/d。
⑤hyp+果糖（fru）组，实验小鼠给予正常饮食，上午灌胃给予左甲状腺素片0.25mg/kg/d，下午灌胃给予12%果糖溶液5ml/kg/d。
⑥hyp+丹参水提液（dst）组，实验小鼠给予正常饮食，上午灌胃给予左甲状腺素片0.25mg/kg/d，下午灌胃给予丹参果糖水提液5ml/kg/d；丹参水提液是按本发明的制备，将一定的丹参药材制丹参水提液，不加入果糖，浓缩成一定体积，以丹参素为含量计算，得到的丹参水提液含丹参素浓度为1-1.2mg/ml，用来与第⑩组含果糖组进行对照比较。
⑦hyp+丹参素（ds）组，实验小鼠给予正常饮食，上午灌胃给予左甲状腺素片0.25mg/kg/d，下午灌胃给予丹参素25mg/kg/d。
⑧hyp+丹参素+阿仑（ds+aln）组，实验小鼠给予正常饮食，上午灌胃给予左甲状腺素片0.25mg/kg/d，下午灌胃给予阿仑膦酸钠0.5mg/kg/d和丹参素25mg/kg/d。
⑨hyp+丹参素+果糖（ds+fru）组，实验小鼠给予正常饮食，上午灌胃给予左甲状腺素片0.25mg/kg/d，下午灌胃给予丹参素25mg/kg/d和12%果糖5ml/kg/d。
⑩hyp+丹参水提液+果糖（dst+fru）组，实验小鼠给予正常饮食，上午灌胃给予左甲状腺素片0.25mg/kg/d，下午灌胃给予丹参果糖水提液5ml/kg/d；丹参果糖水提液是按本发明的制备，将一定的丹参药材制丹参水提液，加入果糖，浓缩到果糖含量达12%，同时检测，丹参素的含量，得到的丹参果糖水提液中含丹参素浓度为1-1.2mg/ml，用来与第⑥组不含果糖组进行对照比较。
实验过程中每天观察大鼠进食、饮水、活动情况并记录，每周称重，按体重变化调整给药量。给药3个月后，心脏取血处死动物。
大鼠体内双荧光标记：所有实验大鼠在实验结束的前第14天、13天和第4天、3天按7mg/kg的剂量进行颈部皮下注射钙黄绿素，两次荧光标记间隔时间为10天，即可在骨表面形成绿色双荧光标记。这样，可根据荧光标记周长百分率或两次以上荧光标记之间距离，判断实验动物在这段时间骨形成的情况和骨形成的速率。
动物取材：取材当天，用3%戊巴比妥钠以0.17ml/100g给药剂量给予大鼠腹腔注射戊巴比妥钠，将其麻醉，左心室取血。分离左右腿，迅速取出大鼠双侧股骨、双侧胫骨、第四腰椎、第五腰椎、第六腰椎、左侧腓肠肌、心脏、甲状腺、称取腓肠肌、心脏、的湿重。左胫骨用低速锯沿着额状面锯开干骺端，使骨髓腔暴露，然后在右胫骨近心端的1/3处进行横向锯断，即为胫骨上段。余下部分在胫腓结合位置进行横向锯断，即可得到胫骨中段，剩余部分丢弃。
标本的固定与保存：将采取的大鼠血液置于10ml离心管中，放置于4℃冰箱4-6小时，再进行冰冻离心（3000xrmp,10min），得到的血清保存到-80℃冰箱中，用于做各项指标检测。将左测胫骨上段、左侧胫骨中段和第四腰椎放入装有10%中性福尔马林的尿杯不超过12h，再置于70%乙醇保存，用于制作不脱钙骨，通过半自动图像分析系统进行骨形态计量学测量。左股骨放入装有4%多聚甲醛的尿杯不超过12h，放入装有50%乙醇-生理盐水的10ml离心管中保存，采用双能x线骨密度仪检测整根股骨、股骨近端和远端的骨密度。用生物力学仪测试大鼠右侧股骨的骨生物力学性能，再进行micro-ct扫描检测骨微结构。腓肠肌、第六腰椎和右胫骨、右股骨用浸过生理盐水的纱布和锡纸包裹后，先在液氮中浸4小时，再冻存到-80℃冰箱，以方便进行后续的wb、pcr、he染色等实验。
血液分析方法：将置于-80℃冰箱的血清取出，并放在4℃环境下解冻。采用tba-2000fr全自动生化检测仪检测碱性磷酸酶活性(alp)、抗酒石酸酸性磷酸酶活性(trap)、总t3、总ft4、tsh、采用化学发光反应方法测定血清骨钙素（ocn）、i型胶原c端肽（ctx-i）和trap水平。均按试剂盒操作说明进行。
大鼠离体骨组织骨密度和骨矿盐检测：取大鼠左侧股骨和第四第五腰椎用生理盐水湿纱布包裹保湿，保存于-20℃，待用。测试时，将股骨和腰椎常温解冻，去除肌肉、韧带，生理盐水复湿。然后用prodigydexa骨密度仪进行测定，得出骨密度（bmd）和骨矿含量（bmc）。
骨生物力学检测：在进行骨生物力学测试时，将-80℃冰箱里的左侧股骨进行常温解冻，去除股骨周围的肌肉和肌腱，生理盐水复湿。采用lloydlr5kplus骨生物力学检测系统检测和分析标本的生物力学指标。本实验采用三点弯曲法，步骤如下：将大鼠左侧股骨至于试验机上，用1mm直径的压头，加载速度为2mm/min，跨距l为20mm，在股骨正中部位加压，直至发生骨折，获得屈服点和骨折参数的数据，仪器能及时记录出每个时刻点的载荷（f）和桡度(d)变化值，绘制出载荷-位移曲线，然后读取最大载荷、断裂载荷和弹性载荷，并计算刚度数据。
micro-ct三维离体扫描：将大鼠离体右股骨用micro-ct观察骨微结构和骨密度的变化，测量时把股骨和塑料板一起推进micro-ct扫描舱口处进行扫描。扫描完成后，三维重建区域定位均为距右股骨生长板远端1mm、层厚3mm骨组织为松质骨感兴趣区域，选取具体参数如下：x线能量70kvp，114ua;扫描模式bh：alu;扫描分辨率0.038mm，2048x2048，曝光时间200ms，以最低阈值为190提取图像信息，获取重建图像后，使用micro-ct自带的软件进行定量分析，测量的物理参数如下：骨体积分数(bonevolume/totalvolume,bv/tv)、连接密度(connectivitydensity,conn.d)、骨小梁数量(trabecularnumber,tb.n)、骨小梁分离度(trabecularseparation,tb.sp)、骨小梁厚度(trabecularthickness,tb.th)、骨密度（bonemineraldensity,bmd）。
实验结果。
对大鼠体重的影响：各药物组大鼠体重结果见表2，从表2的结果可知，与con组相比，前两周hyp组大鼠体重下降，第四周后开始增加，增长幅度没有con组大，直至实验结束，这两组间体重差异存在统计学意义（p<0.01）。与hyp组比较，前两周cal组、aln组、fru组、ds组、ds+aln组体重有下降趋势，dst组、ds+fru组、dst+fru组体重增加，但仍比con组轻。第四周以后各组体重随着时间而增加，各给药组间体重没有统计学差异。与con组比较，取材前第12周hyp组体重仍然轻（p<0.01）。与hyp组相比，各给药组间体重差异无统计学意义(p>0.05)。分别与aln组及ds组相比，ds+aln组体重无差异(p>0.05)。分别与ds组及fru组相比，ds+fru组体重无差异(p>0.05)。分别与dst组及fru组相比，dst+fru组体重无差异(p>0.05)。与t-con组相比，给药期间t-hyp组体重低，差异有统计学意义(p<0.05)，停止灌胃左甲状腺素钠后，体重开始回升，18w后体重没有统计学差异(p>0.05)。
表2：各药物组大鼠体重结果。
对大鼠血清生化指标的影响：各药物组大鼠血清甲状腺功能指标及血糖结果见表3，由表3的结果可见，与con组相比，hyp组ft3和ft4上升（p<0.01）。与hyp组相比，t-hyp组ft3下降（p<0.01），其他组均无变化（p>0.05）；t-hyp组及aln组ft4下降（p<0.05）,其他组间ft3及ft4均无差异（p>0.05）。分别与aln组及ds组相比，ds+aln组ft3水平均下降（p<0.01），ft4水平无变化（p>0.05）。分别与fru组及ds组相比，ds+fru组各项参数均无变化（p>0.05）。与fru组及dst组相比，dst+fru组各项参数均无变化（p>0.05）。与t-con组相比，t-hyp组ft3及ft4均无差异（p>0.05），降回正常水平。与con组相比，hyp组血糖无变化（p>0.05）。与hyp组相比，各治疗组血糖均无差异（p>0.05）。分别与aln组及ds组相比，ds+aln组血糖均无差异(p>0.05)。分别与ds组及fru组相比，ds+fru组血糖均无差异(p>0.05)。分别与dst组及fru组相比，dst+fru组血糖均无差异(p>0.05)。
表3：各药物组大鼠血清甲状腺功能指标及血糖结果。
对大鼠血清骨代谢指标的影响：各药物组大鼠血清骨代谢指标结果见表4，由表4的结果可见，与con组相比，hyp组大鼠ctx和trap水平上升（p<0.01）。与hyp组比较，cal组大鼠ctx水平下降（p<0.01），其他组无变化；ds+aln组大鼠trap水平上升（p<0.01），其他组无变化。与分别与aln组和ds组相比，ds+aln组ctx及trap均无差异（p>0.05）。分别与ds组及fru组相比，ds+aln组ctx及trap均无差异（p>0.05）。与dst组及fru组相比，dst+fru组ctx及trap均无差异（p>0.05）。t-con组相比，t-hyp组ctx及trap均无差异（p>0.05）。与con组相比，hyp组大鼠alp及ocn水平上升（p<0.01）。与hyp组相比，ds组alp水平下降（p<0.01），其他组无变化；fru组、dst组、ds+aln组、ds+fru组及dst+fru组ocn水平下降（p<0.05），其他组无变化。与aln组相比，ds+aln组alp及ocn均无差异（p>0.05）；与ds组相比，ds+aln组alp水平上升（p<0.01），ocn水平下降（p<0.05）。分别与fru组及ds组相比，ds+fru组alp水平无变化（p>0.05）；与fru组相比，ds+fru组ocn水平无变化（p>0.05）；与ds组相比，ds+fru组ocn水平下降（p<0.05）。分别与dst组及fru组相比，dst+fru组alp及ocn水平均无差异（p>0.05）。与t-con组相比，t-hyp组alp及ocn水平上升（p<0.01）。
表4：各药物组大鼠血清骨代谢指标结果。
各给药组大鼠股骨远端松质骨micro-ct定量参数的变化：各药物组大鼠股骨远端松质骨micro-ct定量参数1结果见表5，各药物组大鼠股骨远端松质骨micro-ct定量参数2结果见表6，由表5与表6可见，与con组对比，hyp组大鼠连接密度conn-d、骨密度vbmd、骨体积分数bv/tv、骨小梁数量tb.n均明显下降（p<0.01），骨小梁分离度tb.sp明显上升（p<0.01）,tb.th有下降趋势，差异无统计学意义（p>0.05）。与hyp组相比，cal组conn-d、vbmd、bv/tv、tb.n均明显上升（p<0.01），tb.sp明显下降（p<0.01）；aln组conn-d、tb.n均明显上升（p<0.01），vbmd显著上升（p<0.05），tb.sp明显下降（p<0.01）；ds+aln组conn-d、vbmd、bv/tv、tb.n均明显上升（p<0.01），tb.sp明显下降（p<0.01）；ds+fru组conn-d、vbmd、bv/tv、tb.n均明显上升（p<0.01），结构指数模型值smi显著下降（p<0.05），tb.sp明显下降（p<0.01）；t-hyp组vbmd、tb.n增加（p<0.05），tb.sp下降（p<0.05），fru组、dst组、ds组及dst+fru组各项参数无变化（p>0.05）。与aln组相比，ds+aln组大鼠tb.th上升（p<0.05），conn-d下降（p<0.05），其他参数无变化（p>0.05）；与ds组相比，ds+aln组conn-d、bv/tv、tb.n上升（p<0.05），vbmd上升（p<0.01）,tb.sp下降（p<0.01）。与fru组比较，ds+fru组conn-d上升及tb.n上升（p<0.05），其他参数无变化（p>0.05）;与ds组相比，ds+fru组conn-d上升（p<0.01）,tb.n上升（p<0.05），tb.sp下降（p<0.05）。分别与dst组和fru组相比，dst+fru组各项参数均无差异（p>0.05）。与t-con组比较，t-hyp组conn-d、vbmd、tb.n增加（p<0.05），tb.sp下降（p<0.05）。
表5：各药物组大鼠股骨远端松质骨micro-ct定量参数1结果。
表6：各药物组大鼠股骨远端松质骨micro-ct定量参数1结果。
对股骨骨密度（bmd）和骨矿盐（bmc）的影响：各药物组大鼠股骨骨密度结果见表7，由表7的结果可知，与con组相比，hyp组大鼠股骨整根股骨骨密度wholebmd、股骨远端骨密度distalbmd、股骨近端骨密度proximalbmd均明显下降（p<0.01）。与hyp组比较，cal组wholebmd、distalbmd、proximalbmd均明显上升（p<0.01）；ds+aln组wholebmd、distalbmd均上升（p<0.05，p<0.01）；ds+fru组wholebmd、distalbmd均显著上升（p<0.05）；aln组、fru组、dst组、ds组、dst+fru组各项参数均无变化（p>0.05）。与aln组相比，ds+aln组各项参数均无差异（p>0.05）;与ds组相比，ds+aln组wholebmd、distalbmd均上升（p<0.05）。分别与ds组和fru组相比，ds+fru组各项参数均无差异（p>0.05）。分别与dst组和fru组相比，dst+fru组各项参数均无差异（p>0.05）。
表7：各药物组大鼠股骨骨密度结果。
各药物组对大鼠股骨骨矿盐的影响：各药物组大鼠股骨骨矿盐结果见表8，由表8的结果可知，与con组相比，hyp组大鼠股骨整根股骨骨矿盐wholebmc、股骨近端骨矿盐proximalbmc均下降（p<0.05）,股骨远端骨矿盐distalbmc下降（p<0.01）。与hyp组比较，cal组wholebmc、proximalbmc均上升（p<0.05），distalbmc明显上升（p<0.01）；ds+fru组wholebmc、distalbmc、proximalbmc均上升（p<0.05），其他组各项参数均无变化（p>0.05）。与aln组相比，ds+aln组各项参数均无差异（p>0.05）;与ds组相比，ds+aln组wholebmc、distalbmc均上升（p<0.05）。分别与ds组和fru组相比，ds+fru组各项参数均无差异（p>0.05）。分别与dst组和fru组相比，dst+fru组各项参数均无差异（p>0.05）。
表8：各药物组大鼠股骨骨矿盐结果。
对大鼠骨生物力学参数的影响：各药物组大鼠骨生物力学参数结果见表9，由表9可见，与con组相比，hyp组大鼠最大载荷maximunload、断裂载荷fractureload、弹性载荷elasticload及刚度stiffness均下降（p<0.05）。与hyp组比较，cal组maximunload和stiffness上升（p<0.05）;ds+aln组elasticload明显上升（p<0.01），其他参数无变化（p>0.05）;ds+fru组maximunload、fractureload、elasticload和stiffness增加（p<0.01）；aln组、fru组、ds组及t-hyp组各项参数均无变化（p>0.05）。与aln组相比，ds+aln组elasticload增加（p<0.05），其他参数无变化（p>0.05）；与ds组相比，ds+aln组各项参数均无变化（p>0.05）。与fru组相比，ds+fru组各项参数均无差异（p>0.05）；与ds组相比，ds+fru组maximunload和stiffness上升（p<0.05）。分别与dst组和fru组相比，dst+fru组各项参数均无差异（p>0.05）。与t-con组相比，t-hyp组fractureload和elasticload增加（p<0.05），stiffness下降（p<0.05）。
表9：各药物组大鼠骨生物力学参数结果。
讨论。
甲状腺激素可以引起与人类甲亢性骨质疏松症患者的典型特征相一致的大鼠甲亢性骨质疏松动物模型：本课题通过前期模型的摸索已经证明大鼠灌胃给予左甲状腺素钠0.25mg/kg/d，每天灌胃一次，连续干预12周，与对照组大鼠（con组大鼠）相比，hyp组大鼠体重、骨组织形态计量学参数、骨组织骨微结构、骨密度、骨生物力学等指标均有不同程度的降低，与人类生化学和形态学指标相似，据此，我们建立了甲亢性骨质疏松的动物模型，用来观察和筛选对抗甲亢性骨质疏松的有效药物。本研究发现hyp组大鼠体重出现降低现象，自第2周开始一直低于con组，这可能与甲状腺素通过促进蛋白质分解加快分解代谢有关，也可能是因为过量甲状腺素加速骨转换，降低全身骨骼矿物质含量，从而降低体重有关。血清生化指标是常用的评价骨代谢的方法，甲状腺功能指标和骨转换指标可分别放映大鼠体内的甲状腺和骨骼的功能情况。ocn是成骨细胞分泌合成的一种活性多肽，可反应成骨细胞的功能和活性。而有研究表明甲亢状态下成骨细胞的功能和活性是升高的，其合成和分泌ocn能力也是增强的，本研究发现hyp组大鼠的血清ocn水平升高，这提示甲亢大鼠骨形成增加。trap是破骨细胞释放的一种酶，而ctx-i是破骨细胞骨吸收过程中的产物，本研究发现，hyp组大鼠血清ctx-i和trap水平显著升高，提示甲亢状态下骨吸收增强。与con组比较，hyp组大鼠血清游离三碘甲状腺原氨酸和游离甲状腺素明显升高，主要是由于灌胃进去的左甲状腺素在体内转化和脱碘形成甲状腺素和游离三碘甲状腺原氨酸导致的，这些结果表明甲状腺素促使骨骼呈高转换型进行代谢，这与以往的研究结果一致。骨密度测量是估量骨矿盐含量和预测骨折风险的重要指标，也是预防、诊断和治疗骨质疏松症的重要组成内容。有研究发现，甲亢与骨质疏松症存在相关性。本实验结果显示，与con组相比，hyp组大鼠全股骨骨密度、股骨远端骨密度、股骨近端骨密度均明显降低，同时，相对应的最大载荷、断裂载荷、弹性载荷和刚度也一并下降，提示过量甲状腺素会导致骨密度和骨质量降低，抗骨组织变形能力下降，生物性能减弱，增加骨折的风险，这与既往的研究发现甲亢会继发骨质疏松症相一致。本实验采用micro-ct检测大鼠右侧股骨远端骨微结构，从三维的角度直观比较和分析骨骼的变化，结果显示，与con组相比，hyp组大鼠股骨连接密度、体积骨密度、骨体积分数、骨小梁数量均明显减少，骨小梁分离度明显增宽，结果提示，hyp组大鼠股骨松质骨骨量减少，骨组织网状结构遭到破坏，结构不完整，呈现为骨质疏松的症状。以上结果与最近tsourdie等[26]的实验结果基本一致。
经典治疗骨质疏松症药物骨化三醇对大鼠甲亢性骨质疏松模型有预防作用：骨化三醇即1，25羟化维生素d3，是维生素d3的最重要活性代谢产物之一，通常在肾脏内由其前体25-羟基维生素d3转化而来。本研究发现，骨化三醇对大鼠甲亢性骨质疏松模型有明显的预防作用，骨化三醇能有效减少血清ctx水平，对alp和ocn指标有下降趋势，提示骨化三醇可对抗过量甲状腺激素引起的骨重建过度活跃，此外，骨化三醇对骨组织形态计量学参数、骨组织骨微结构、骨密度、骨生物力学等指标均有不同程度的改善。骨化三醇主要是通过与靶器官上的维生素d受体结合，促进肠道钙的吸收和肾小管钙的回吸收，抑制甲状旁腺激素的合成及分泌，从而保持钙磷代谢平衡，使得骨的代谢与矿化呈正常化。既往研究已明确活性维生素d3对骨重建过程起到重要的作用，在国内已被sfda批准为治疗骨质疏松的药物，临床上骨化三醇常常与钙剂结合在一起作为治疗原发性骨质疏松的基础药物，同时也是治疗糖皮质激素性骨质疏松症的一线药物。适当水平的活性维生素d3可促进骨形成，刺激成骨细胞分化和碱性磷酸酶、骨钙素、骨桥蛋白和胶原的合成，抑制骨吸收细胞因子分泌，如肿瘤坏死因子-α（tnf-α）等。流行病学研究发现，适量的血清维生素d浓度对维持人体骨骼的完整性起着重要的作用。骨化三醇可对成骨细胞介导的骨矿化过程起直接促进作用。近年来的研究报道进一步发现，活性维生素d3除了对骨骼有影响外，对自身免疫性疾病比如graves’病可能也有联系，可能通过其受体在甲状腺功能亢进症病情的发展中起到了作用。因此，骨化三醇作为临床治疗各种类型骨质疏松的一线药物，具有多重作用，不仅体现在骨骼方面的作用，还体现在可作用于其他系统从而产生广泛的作用，除参与钙磷代谢调节，还参与到多种细胞的增殖、分化、凋亡、免疫反应及代谢等。鉴于骨化三醇以上特点，本研究选择其作为对照药物。临床研究发现，甲亢患者血清中活性维生素d3水平明显低于正常健康人群，因此服用活性维生素d3和钙剂有助于保护甲亢导致的骨质疏松症，改善由甲亢带来的并发症。
另一经典治疗骨质疏松症药物阿仑膦酸钠是一种骨吸收抑制剂，通过抑制破骨细胞活性来减少破骨细胞数量从而抑制骨吸收，降低骨转换率，增加骨量，提高骨密度和骨矿盐含量，降低骨折发生率，改善骨微结构，进而控制骨质疏松发生率。本研究发现，阿仑膦酸钠可降低甲亢性大鼠的骨吸收和骨形成指标，但无统计学差异，ctx有所下降，提示阿伦磷酸钠可降低骨基质胶原纤维的降解，破骨活动受到一定抑制；既往研究已明确阿仑膦酸钠对骨重建过程起到重要的作用，在国内已被sfda批准为治疗骨质疏松的药物，临床上阿仑膦酸钠主要用于治疗绝经后骨质疏松、老年男性骨质疏松、继发性骨质疏松（例如糖皮质激素性骨质疏松、糖尿病性骨质疏松、甲状腺功能亢进性骨质疏松）、血管钙化引起的疾病、骨纤维结构不良疾病、骨髓瘤疾病。阿仑膦酸钠对破骨细胞的作用分为三个方面：第一，破坏破骨细胞的结构，干扰其活性；第二，抑制破骨细胞前体的转化；第三，促进破骨细胞的凋亡。从以上这几个方面影响破骨细胞的功能，减弱对骨结构的破坏，增强骨质量。阿仑膦酸钠除了对破骨细胞有抑制作用外，也可抑制成骨细胞介导的破骨抑制细胞因子，间接影响破骨细胞的活性，还可抑制骨细胞和成骨细胞的凋亡。近年来的研究报道进一步发现，因阿仑膦酸钠可抑制破骨细胞活性，在临床上已被用于治疗甲状腺功能亢进性骨质疏松的治疗，在抗甲亢的基础上进行阿仑膦酸钠的治疗，疗效显著，可明显升高患者的骨密度，改善骨质疏松症状，降低骨折发生率因此本研究选用阿仑磷酸钠作为对照药物。临床研究发现，甲亢患者血清中骨吸收指标水平明显高于正常健康人群，因此服用阿仑膦酸钠有助于保护甲亢导致的骨质疏松症，改善由甲亢带来的并发症。
对骨代谢的评价主要包括骨组织形态计量学、骨生物力学、骨密度和骨转换标志物生化指标的检验。骨组织二维形态计量学是能定量地观察和研究细胞和组织形态结构的一门技术，该技术可测量松质骨和皮质骨的骨量以及对骨形成和骨吸收参数进行测量，是进行骨质疏松药物研究的一个重要指标，然而骨组织形态计量学存在切片的不固定性及二维平面局限性的缺点，但是micro-ct三维图像处理技术能极大地解决了这一漏洞，可更加全面地获得立体结构信息，全面地评价骨结构整体变化。通常骨骼的骨微结构的变化是在骨质量变化之前出现的。本研究采用micro-ct和骨形态计量学两种方法来评估骨化三醇对hyp大鼠的骨组织骨微结构和二维形态的影响，这样更能为骨化三醇和阿仑膦酸钠防治甲亢性骨质疏松提供参考意义。
本研究结果显示，在给予药物干预12周后，与hyp组相比，骨化三醇给药组的股骨骨组织三维结构的骨体积分数bv/tv、骨连接密度conn-d、骨小梁数量tb.n、骨密度bmd明显增加，骨小梁分离度tb.sp明显下降，这提示了骨化三醇具有改善股骨骨微结构受损和骨量丢失的作用，这可能与骨化三醇有促进骨矿化和免疫调节有密切关系，从而可对抗甲亢致骨微结构受损和骨密度降低的作用，这些提示骨化三醇可对抗甲亢大鼠所致骨量丢失、皮质骨抑制和纵向生长率抑制，降低骨转换率，改善甲亢引发的骨微结构受损。在给予药物干预12周后，与hyp组相比，阿仑膦酸钠组的股骨骨组织三维结构的conn-d、tb.n和bmd明显增加，tb.sp明显下降，提示阿仑磷酸钠具有改善股骨骨微结构受损和骨量丢失的作用，这可能与阿仑膦酸钠抑制甲状腺功能亢进症引起的破骨细胞骨吸收增强，抑制其生物活性，降低大鼠体内破骨细胞数量，从而对抗骨吸收及甲亢致骨微结构受损和骨密度降低的作用，研究结果提示阿仑膦酸钠可对抗甲亢大鼠所致骨量丢失、皮质骨抑制和纵向生长率抑制，降低骨转换率。
骨密度和骨生物力学特性是反映骨的生长代谢状态的一个重要指标，对骨骼进行骨密度和骨生物力学性能的检测不但可对骨质量进行直接客观的评价，而且也是评价抗骨质疏松治疗药物的最佳方法之一。在甲亢大鼠模型中，骨密度检测结果显示，骨化三醇组大鼠全股骨骨密度、股骨远端骨密度和股骨近端骨密度均增加，骨矿盐含量也增加，提示骨化三醇可抵抗甲状腺素导致的骨矿盐丢失，改善大鼠骨质疏松状况。骨化三醇干预后能恢复骨小梁数量和骨小梁面积百分数，改善骨小梁连接密度与空间结构，对股骨生物力学性能从而产生积极的影响。骨生物力学主要是研究骨在外力作用下的力学性能及受力后产生的生物学效应，是骨组织、骨质量与骨强度的集中体现。刚性系数是反映骨材料力学性能和内在特性的指标，与骨的大小和几何结构无关，而最大载荷、弹性载荷和断裂载荷则是反映骨结构力学性能和外在特性的指标。与hyp组相比，骨化三醇组的最大载荷和刚度增加，但是断裂载荷和弹性载荷有上升的趋势，提示骨化三醇提高骨的抗变形能力。阿仑组的股骨骨密度和骨矿含量较hyp组有上升趋势，但没有统计学意义，这与骨生物力学指标参数结果相呼应，阿仑组各项力学指标均无差异，说明阿仑膦酸钠对改善骨生物力学作用不大，可能与阿仑组大鼠正处于骨矿化阶段，骨质中的有机物还未形成有关。目前没有研究可证实双膦酸盐类药物可降低女性绝经后骨质疏松症患者的骨折风险，甚至可能增加其骨折风险，因为有研究发现长期服用双膦酸盐的老年人有增加髋部骨折的风险。阿仑膦酸钠与维生素d作用机理不一样，前者通过抑制破骨活性而使整个骨转化频率降低，这意味着骨骼中“旧骨”沉积较多，且不易被清理，这导致新骨生成降低，而对增加骨骼抗变形能力并无太大好处，这可能是阿仑膦酸钠对改善甲亢大鼠骨生物力学的作用不大的原因之一。本研究观察到骨化三醇给药组的大鼠骨形成指标下降，骨吸收指标ctx-i和trap低于hyp组，阿仑组ctx-i和骨形成指标下降，这提示骨化三醇和阿仑膦酸钠可通过抑制骨吸收和骨形成来抵抗甲亢导致的高转换型导致的骨微结构受损和骨量丢失，发挥保护骨组织的作用。
综上所述，经骨化三醇治疗后，可抑制甲亢带来的破骨活跃，但不降低成骨矿化，因此松质骨的骨形成率下降而有利于骨量的恢复，松质骨骨量增加，骨骼的支撑强度增大，从而阻止甲状腺功能亢进症对骨小梁结构的退化影响，增强力学性能，降低骨质疏松的骨折风险，可能与适当水平的活性维生素d3可促进骨形成，抑制骨吸收过程有关，因此骨化三醇可治疗甲亢继发引起的骨质疏松症。经阿仑膦酸钠治疗后，松质骨骨量增加，抵抗甲状腺功能亢进症对骨小梁的损坏，但对增加骨抵抗能力不明显，故骨化三醇可能优于阿仑膦酸钠对甲亢性骨质疏松症的治疗。
丹参素（25mg/kg/d）并不能有效改善甲亢大鼠的骨量丢失和骨结构受损：丹参是著名传统中药药材，国内研究者根据中药丹参的传统服用方式为水煎煮的特点，发现药材丹参水溶性有效成分为丹参素、丹酚酸b、原儿茶醛等，这些物质具有抗氧化、抗心肌缺血、抑制脂质氧化，同时具有清除体内氧自由基等优点，在临床上被广泛用于治疗心血管疾病。我们课题组研究发现丹参水溶性成分可抵抗糖皮质激素性骨质疏松症，而且丹参水溶性成分中含量较高的丹参素和丹酚酸b可促进成骨细胞分化和促骨形成作用。丹参素经口服后可快速吸收入血，且分布速度快，然而丹参素的生物半衰期短，t½为16.58±5.768min，难以达到稳态血药浓度。丹酚酸b经口服后也是会被迅速吸收入血，但是生物利用度低。有意思的是研究发现丹酚酸b能够经肝脏、胆汁代谢后转化为丹参素。丹参素是丹参水溶性主要成分。我们前期研究发现丹参素可以促进骨愈合并且能预防糖皮质激素引起的骨质疏松，其作用机制与保护糖皮质激素对成骨细胞的分化和矿化作用有关，并且促进骨髓基质干细胞向成骨细胞分化，抑制脂肪分化，改善骨髓微循环和脂质代谢。另外，本课题组也发现丹参素能对抗氧化应激，逆转h2o2对细胞株c2c12成骨分化的抑制作用，与上调wnt通路和下调foxo信号通路有密切关。在骨代谢过程中，丹参素也通过opg/rankl/rank信号通路抑制骨吸收，提高骨钙素和碱性磷酸酶活性水平。也有研究表明th可通过wnt信号通路作用于成骨、破骨细胞参与骨重塑偶联。鉴于以上特点，本研究选择丹参素来观察其对甲亢性骨质疏松大鼠是否有干预作用。但是，在本实验中发现，丹参素（25mg/kg/d）单独应用在对甲亢大鼠出现的骨量丢失、骨微结构受损无明显预防作用，这可能与丹参素的用量不足，也可能与其在对抗甲亢大鼠高转换型的骨丢失没有及时补充能量有关。成骨和溶骨作用增强是甲亢性骨质疏松症的发病机制的一个重要的因素，与糖皮质激素性骨质疏松症病理机制不同。在干预的过程中，丹参素并不能发挥出较好保护骨组织作用，从micro-ct结果可知，在丹参素药物干预12周后，丹参素药物组的骨微结构参数和骨密度有一定增加趋势，但是差异并没有统计学意义。由骨生物力学结果可知，与hyp组相比，丹参素组各参数均无统计学差异。这提示丹参素在保护甲亢大鼠股骨骨生物力学性能的作用并不明显。因此，丹参素并不能有效改善甲亢大鼠的骨量丢失和骨结构受损。
丹参素联合阿仑膦酸钠组有改善股骨骨微结构破坏及骨生物力学性能的作用：本研究通过对单用阿仑膦酸钠组（1mg/kg/d）和单用丹参素组（25mg/kg/d）和丹参素联合阿仑膦酸钠组（阿仑膦酸钠0.5mg/kg/d）的研究观察发现，三组体重间没有统计学差异，且均比con组低，跟hyp组相近，三组间心脏与腓肠肌湿重无差异，但是丹参素联合阿仑组股骨骨密度上升，差异有统计学意义，阿仑组和丹参素联合阿仑组骨矿含量有上升趋势，表明丹参素联合阿仑膦酸钠对甲亢引起的骨密度和骨无机物质下降有抵抗作用。与此相呼应的是骨生物力学指标显示，丹参素联合阿仑膦酸钠组弹性载荷明显上升，其他力学指标有升高趋势。阿仑膦酸钠组、丹参素组和丹参素联用阿仑膦酸钠组有降低血清ctx水平的趋势，提示破骨细胞骨吸收下降，破骨活动减少。丹参素联合阿仑膦酸钠组ocn水平下降，说明抑制破骨细胞活性的同时偶联着成骨功能下降，使成骨功能恢复正常。丹参素联合阿仑膦酸钠组大鼠股骨骨组织三维结构的conn-d、tb.n、bv/tv和bmd明显增加，tb.sp明显下降，提示丹参素联合阿仑膦酸钠有改善股骨骨微结构破坏的作用，其中丹参素和阿仑膦酸钠都参与调节，丹参素促进骨形成，抑制氧化应激，阿仑膦酸钠抑制骨吸收作用有关，两者合用后从不同方面提高骨量和骨密度。
丹参素联合果糖组可有效地恢复由过量甲状腺素促进分解代谢带来的体重下降：体重及其增长情况是反映机体总体状况的简易指标，本研究发现丹参水提液组、果糖组、丹参素联合果糖组、丹参水提液联合果糖组体重在第二周后开始上升，且在后续的实验过程中均呈上升趋势，但均比con组低。仅仅只有丹参素联合果糖组和丹参水提液组可以使体重超过hyp组，其他各组与hyp组相比较体重始终没有出现统计学差异。说明丹参素联合果糖组可有效地恢复由过量甲状腺素促进分解代谢带来的体重下降，丹参素和果糖单用没有这样的效果。
丹参素联合果糖组可有效地恢复由过量甲状腺素导致的股骨骨密度下降，并使股骨骨矿含量增加：本研究通过对单用果糖组（12%果糖）、单用丹参素组（25mg/kg/d）、单用丹参水提液组和联合用药组（丹参素联合果糖、丹参水提液联合果糖）的研究观察发现，丹参素联合果糖组股骨骨密度上升，果糖组、丹参水提液组和丹参水提液联合果糖组骨密度有上升的趋势，但无统计学差异，提示丹参素联合果糖可有效恢复甲亢带来的骨密度下降，这两种成分单独应用效果就不好。与骨密度相呼应，丹参素联合果糖组股骨骨矿含量上升，丹参水提液组和丹参水提液联合果糖组股骨骨矿含量上升趋势，但无统计学差异。
丹参素联合果糖组可有效地恢复由过量甲状腺素导致的骨生物力学性能下降：骨生物力学检测显示，丹参素联合果糖组和丹参水提液联合果糖组骨生物力学的性能显著增加，丹参水提液组最大载荷、弹性载荷和刚度增加，果糖组力学性能有增加趋势，但统计学没有显著性意义，提示丹参素联合果糖和丹参水提液联合果糖可改善甲亢带来的骨生物力学性能下降，降低了骨折风险，且单用丹参水提液对抗骨折能力与合用果糖效果相当，单用果糖也可对抗甲亢大鼠的骨微结构下降，但不明显。
丹参素联合果糖组具有改善过量甲状腺素导致的股骨骨微结构受损和骨量丢失：本实验micro-ct结果显示，与hyp组相比，丹参素组无论从骨微结构还是从骨组织二维结构上看，均没有显示出抵抗甲亢性骨质疏松的作用，但有一点是明确的，丹参素促使骨转换率下降。丹参水提液组的conn-d、tb.n、bv/tv和bmd分别上升43.4%、22.7%、25%、24.4%，tb.sp和smi分别下降25%、6.3%。果糖组的conn-d、tb.n、bv/tv和bmd分别上升17.1%、13.6%、25%、15.9%，tb.sp和smi分别下降10%、18.8%。丹参素联合果糖组的股骨conn-d、bv/tv、tb.n和bmd明显增加，tb.sp、smi明显下降，比单用丹参素和单用果糖效果好，提示丹参素联合果糖组具有改善股骨骨微结构受损和骨量丢失的作用，这可能与果糖可为甲状腺功能亢进症导致的高骨转换率提供能量，改善骨骼的能量代谢，纠正三羧酸循环-氧化磷酸化-糖无氧酵解信号，而丹参素可促进成骨细胞分化和矿化，抑制脂肪氧化，两者合用产生协同作用，进而对抗甲亢致骨微结构受损和骨密度降低的作用。丹参水提液联合果糖组大鼠的股骨骨组织三维结构的conn-d、tb.n、bv/tv和bmd分别增加43.4%、21.8%、25%、23.9%，tb.sp、smi分别下降22.5%、18.8%，提示丹参水提液中的有效成分丹参素联合果糖对甲亢性骨质疏松症有一定疗效，但是效果没有丹参素联合果糖好，可能与本实验中丹参水提液有效成分丹参素及丹参酸b含量低有关。
我们的研究结果表明，丹参素联合阿仑膦酸钠和丹参素联合果糖均对甲亢性骨质疏松症有良好的治疗作用，可抑制甲亢带来的破骨活跃，但不降低成骨矿化，因此松质骨的骨形成率下降而有利于骨量的恢复，松质骨骨量增加，骨骼的支撑强度增大，从而阻止甲状腺功能亢进症对骨小梁结构的退化影响，增强力学性能，降低骨质疏松的骨折风险，可能与丹参素及果糖可促进骨形成，抑制骨吸收，改善骨骼的能量代谢紊乱有关，因此丹参素联合阿仑膦酸钠和丹参素联合果糖可起到治疗甲亢导致的骨量丢失的作用。经丹参水提液联合果糖治疗后，骨量有恢复但还不明显，力学性能增强，可能与丹参水提液联合果糖中丹参素含量低于丹参素联合果糖有关。
研究结果表明，丹参素联合果糖对甲亢性骨质疏松的骨生物力学性能受损有良好的预防作用，该组合物能够影响大鼠骨代谢，促进骨形成，抑制骨吸收，增加骨量，提高骨密度和骨矿盐含量，改善骨生物力学性能，优化骨小梁内部形态和排列结构，对左甲状腺素钠导致的骨质疏松症具有干预作用。
由丹参素联合果糖组成的药物组合物，或者由含丹参素的丹参提取物与果糖组成的药物组合物，对各种由于疾病或者衰老导致能量代谢紊乱，出现能量消耗过多的高转换型的骨质疏松或者骨骼的生物力学性能下降均有不同程度的预防和治疗作用；此外，对心脏，肝脏及肾脏等耗能大的组织也有很好的保护组织及提供能量帮助组织康复的作用，对心脏病，肝炎和肾脏疾病也有一定的疗效，在临床上可以进一步对这些疾病进行疗效观察。