一种新型胶原刺激剂的制备及应用的制作方法

本发明涉及组织工程领域，通过聚脂微球与线性取向凝胶的结合，制备出一款即具有细胞诱导性又能刺激自体胶原分泌的注射美容产品，主要用于软组织缺陷的填充与修复。

背景技术：

随着身体的衰老，人体皮肤会出现不同程度的松弛、褶皱与凹陷，这主要与皮肤中胶原蛋白的流失有关。除了正常的衰老，一些疾病如hiv、肿瘤的治疗也可能会造成皮下软组织的缺损。无论是正常的皮下组织生理变化还是因疾病导致的软组织缺失均会影响患者的外在形象，为了使患者重拾信心，近几十年来，以注射美容填充为代表的产品迅猛发展。透明质酸钠作为一种在生物体内广泛存在的生物多糖，其生物相容性好、可降解、种属间几乎无差异，是目前应用最为广泛的面部填充剂。但透明质酸在体内降解速率较快，即使通过交联技术也只能将其降解时间延长至1年左右，对于更长时间的组织填充，单纯采用透明质酸钠很难达到目的。

为了适应日益增长的长效填充的市场需求，胶原刺激剂应运而生，该类技术是应用了无机或有机化学物的微球的成纤维细胞刺激作用，进而促进机体分泌胶原蛋白。但众所周知该类刺激作用与机体的炎症反应都是生物体对外源物的一种应急免疫反应，因此在该类技术或产品中，生物相容性至关重要。

专利cn101610796a报导了一种用羧甲基纤维素溶液包裹羟基磷灰石微球包制备组织填充剂的方法，对应商品radiesse。因羟基磷灰石微球在体内降解时间很慢，其填充时间可长达15个月甚至更久。但羟基磷灰石本身的硬度与填充部位相差巨大，会影响面部表情的自然表达。羧甲基纤维素虽然安全性较好但仍不及透明质酸，且其仅以溶液状态包裹微球，在注入皮下后羟基磷灰石微球和羧甲基纤维素溶液可能因肌肉的运动而移位。有动物实验研究表明，其皮下注射易产生炎性反应，带来不良反应，重复注射，注射部位有时会出现组织纤维化，主主要是因为产品中的羟基磷灰石微球的含量达30％左右，其本身不被人体制剂吸收，而是通过巨噬细胞的吞噬逐渐排出体外，因此生物相容性差。基于上述原因我们就不难理解，虽然radiesse已在市场上成功应用多年，但在安全性方面仍有不被国内市场所接受，至今还不能进入中国市场。

专利wo2009/014441a2报导了一种聚已内酯微球的制备方法并将其混入羧甲基纤维素溶液中制备成组织填充剂，对应商品为ellanse。由于聚已内酯为合成高分子，其分子量、分子量分布可调，根据不同注射的要求，ellance产品的填充效果可维持1～4年。但由于其仍采用羧甲基纤维素溶液包裹微球，其中聚己内酯微球的含量也非常大，为30％左右，由于体内没有专一性的酶对其进行降解，同时降解产物呈现出一定的酸性，对周围组织造成一定的浸润，最终导致生物相容性不是非常理想。另外一个更为关键的引起生物相容性差的原因是微球外部的分散溶液，该分散溶液为羧甲基纤维素钠本身的分子量低，降解时间快，导致降解完成后再植入部位留下了大量的聚酯微球，这也使得此类产品生物相容性大打折扣。

从上述的两种类型的胶原刺激剂的不足，我们可以看出内部包裹的微球是刺激胶原的主要成分，但含量太大容易引起长期的不良反应，同时外部的分散溶液的体内残留时间短以及生物相容性差，这都是导致生物相容性差的最主要原因。

为此人们逐渐尝试将外部的分散溶液更换成体内生物相容性好的成分，如透明质酸钠凝胶。专利cn105126166a报导了一种透明质酸凝胶包裹两亲性微球的方法，但其采用的两亲性聚合物中含有聚乳酸或聚乳酸-羟基乙酸共聚物，在体内降解时间只有几个月，作为面部填充材料，维持时间有限。包裹微球的透明质酸虽然用二乙烯基砜或者1，4-丁二醇二缩水甘油醚进行交联，但降解时间并未提及。两相之间的降解时间是否匹配关系到面部填充的效果。另外，其在制备微球的过程中采用聚乙烯醇作为表面活性剂，聚乙烯醇为3类致癌物质，如果去除的不充分，会对人体造成潜在的危害。

由此可见，虽然外部的分散介质更换为透明质酸钠凝胶后，但因为其降解时间较短，导致产品的持续时间不理想。因此理想的胶原刺激剂需要具备如下特点：1.微球的含量不能太高；2.外部微球的分散介质需具备良好的生物相容性；3.分散介质应具有较长的降解时间；4.外部分散介质应具有一定的取向诱导性，诱导体内的成纤维细胞取向排列，这样会促使分泌的胶原基质也具有一定的取向性，大大降低组织的炎性反应。

基于上述条件，本发明首先选择线性交联透明质酸钠凝胶作为微球的分散介质，该介质是以透明质酸钠为原料，采用dvs作为交联剂制备而成，它显著区别于市面上现有的颗粒化交联透明质酸钠凝胶产品，为无颗粒线性交联透明质酸钠凝胶。线性交联透明质酸钠凝胶体内具有较长的残留时间，持续时间可达12个月以上，同时在微观结构上，它呈现出一定的取向排列，具有诱导细胞取向迁移的生物学功能；然后本发明对现有的微球制备工艺进行了改进，采用与人体相容性好的几丁糖类乳化剂---温敏性羟丁基几丁糖代替聚乙烯醇，其具有良好的温度敏感性，在微球的制备过程中可以调节其凝胶化温度，达到良好的微球分离效果；最后以具有微观取向结构的线性交联透明质酸钠凝胶为包裹微球的外相，其在一定程度上可以控制微球的取向，进而使得刺激分泌的胶原也呈定向排列。

技术实现要素：

本发明的目的之一是制备一种长效(>15个月)面部微球/凝胶填充体系，用于改善因年龄增长引起的软组织的松弛、褶皱或因疾病引起的软组织萎缩、缺损等情况。该材料的组成为人工合成的可生物降解的聚酯类微球，其可通过乳化法或熔融搅拌法制备得到。乳化法采用安全无毒的几丁糖衍生物作为乳化剂；熔融搅拌法通过将环境温度控制在聚酯的熔点以上，借助机械搅拌制备得到微球。包裹微球的外相为通过线性交联手段制备得到的透明质酸钠凝胶，其流动性好且体内降解时间可长达1年之久，可与微球降解的时间进行精确匹配。

本发明的另一目的是通过引入聚已内酯、聚丙交酯、聚丙交酯-乙交酯共聚物微球来刺激机体产生胶原，在线性透明质酸钠凝胶和微球逐步降解的同时，机会本身分泌的胶原在原位进行富集，达到长效填充之目的。为了进一步延长填充时间和效果，本发明还将表皮生长因子(egf)引入到微球中，提高egf在体内的活性并延长其释放的时间，进一步促进胶原的原位分泌。

本发明中聚酯类微球包括聚已内酯、聚乙交酯、聚丙交酯、聚丙交酯-乙交酯，通过合理的选择聚酯类型、分子量、比例可满足不同注射部位的需求。本发明制备微球的方法有两种，分别为乳化法和熔融搅拌法，分别介绍如下。

(一)乳化法

1.聚酯溶于有机溶剂中形成油相。

2.在机械搅拌的情况下，将上述油相逐滴加入含有乳化剂的水相中形成水包油体系。

3.当油相中的有机溶剂随着搅拌的进行渐渐挥发出来后，聚酯随之固化形成微球。

4.用大量清水洗涤微球以除去杂质。

5.通过合适的筛网，筛选出直径在20～70um内的微球备用。

上述方法中，所述聚酯包含聚已内酯、聚乙交酯、聚丙交酯、聚丙交酯-乙交酯，有机溶剂包含乙酸乙酯、二氯甲烷、三氯甲烷、乙腈、六氟异丙醇。聚酯占有机溶剂的质量分数为1％～20％。

上述方法中乳化剂包含羟丁基几丁糖，其在水相中的质量分数为0.1％～5％。

上述方法中油相与水相的体积比为1:50～1:5。

如需制备包裹egf的聚酯微球，则在上述步骤1之后加一项操作步骤如下：

将egf溶于水中并加入到聚酯有机溶液中进行超声形成初乳，然后再滴加到含有乳化剂的水相中搅拌，其余操作步骤相同。

上述方法中，egf水溶液中egf的质量分数为20％～40％，egf水溶液与聚酯有机溶液的质量比为1:10～1:4。

egf被包裹在聚酯微球中，其在体内会随着聚酯的降解而慢慢释放出来，从而延长egf在体内的活性和作用时间。达到持续刺激细胞生长和胶原分泌的目的。

(二)熔融搅拌法

1.将吐温-80与水按一定比例进行混合，然后加入tritonx-100，升温至70-90℃。

2.加入一定量聚酯，待聚酯完全熔解后开始机械搅拌。

3.搅拌一段时间后停止加热，保持搅拌至体系自然冷却。

4.用大量清水洗涤微球以除去杂质。

5.通过合适的筛网，筛选出直径在20～70um内的微球备用。

上述方法中，吐温-80与水的质量比为4:6～10:0，tritonx-100占吐温-80/水体系的质量分数为0.1％～10％。

上述方法中，聚酯占tritonx-100/吐温-80/水体系的质量分数为5％～20％。

上述方法中，聚酯完全溶解后机械搅拌的时间为5～60分钟。

上述方法中，所述聚酯包含聚已内酯和聚丙交酯-乙交酯。

本发明中包裹聚酯微球的外相为具有取向结构的线性透明质酸钠凝胶，其制备方法如下所述：

(1)透明质酸钠溶于naoh水溶液中并充分搅拌。

(2)加入一定量的二乙烯砜，升温并继续机械搅拌以进行交联。

(3)交联反应进行至一定程度时，停止加热但保持机械搅拌，加入乙醇进行沉降，得到交联粉末。

(4)上述交联粉末用乙醇洗涤3次后，于磷酸盐缓冲液中进行复溶并透析。

(5)透析得到的线性交联透明酸钠凝胶于4℃下进行保存。

上述方法中，透明质酸钠的分子量为100万～200万。

上述方法中，加入的naoh占体系的质量分数为1％～5％。

上述方法中，透明质酸钠在naoh水溶液中的质量分数为1％～8％。

上述方法中，二乙烯砜占反应体系的质量分数为0.1％～1％。

上述方法中，加热时体系的温度为40～50℃，加热时间为1～4小时。

上述方法中，沉降时加入乙醇的体积与交联反应体系的体积比为2:1～6:1。

上述方法中，最终透析得到的凝胶中透明质酸钠的的浓度为10～20mg/ml。

聚酯微球凝胶体系的制备：

将聚酯微球或包裹有egf的聚酯微球与透明质酸钠凝胶按1:9～4:6的质量比进行混合，然后灌装灭菌即可得到成品。

本发明的优点在于：

1.使用羟丁基几丁糖作为乳化剂，其生物相容性和安全性较其他乳化剂高。

2.不同于传统的软组织填充剂，在物理填充的基础上引入胶原刺激生长概念，聚酯微球在注射原位降解的同时可持续刺激细胞分泌胶原，从而长时间保持(>15个月)填充状态。

3.本发明所用的外相透明质酸钠凝胶具有层状取向结构，可在一定程度上诱导细胞的取向生长(如附图1)。

4.受外相凝胶层状取向结构的影响，包裹在基中的聚酯微球的排列也具有一定的方向性(如附图2所示)，进而导致胶原的分泌生长也呈一定的取向性(如附图3所示)。

5.通过将egf载入聚酯微球，可显著延长egf在体内的作用时间和活性，提高注射部位细胞的生长速率和胶原分泌量，进一步提高填充效果。

说明书附图

图1线性交联透明质酸钠凝胶微观结构

图2实施例6的微球凝胶体系的扫描电镜照片

图3实施例8的微球凝胶体系皮下植入1个月后的he染色照片

具体实施方式

下面通过实施例进一步描述本发明，但不限于这些实施例。

实施例1

这个实施例描述了聚乙交酯-丙交酯微球的制备过程。

称取1g聚乙交酯-丙交酯(mw＝20000)溶于10ml二氯甲烷中，然后滴加到100ml去离子水中(含有2％wt羟丁基几丁糖为乳化剂)，同时伴有机械搅拌(500rpm)，保持此转速6个小时以使二氯甲烷充分挥发。然后通过抽滤装置滤除液相得到微球，微球以大量清水进行洗涤以充分除去杂质。再通过不锈钢筛网筛出直径在20～70um范围内的微球。常温真空干燥1天后于-20℃下保存备用。

实施例2

这个实施例描述了聚已内酯微球的制备过程。

称取3g聚已内酯(mw＝14000)溶于10ml乙腈中，然后滴加到80ml去离子水中(含有3％wt羟丁基几丁糖为乳化剂)，同时伴有机械搅拌(600rpm)，保持此转速过夜以使乙腈充分挥发。然后通过抽滤装置滤除液相得到微球，微球以大量清水进行洗涤以充分除去杂质。再通过不锈钢筛网筛出直径在20～70um范围内的微球。常温真空干燥1天后于-20℃下保存备用。

实施例3

这个实施例描述了聚已内酯微球的制备过程。

称取50ml吐温和50ml水充分混合，然后加入10mltritonx-100并搅拌均匀。将上述体系加热到80℃后再加入10g聚已内酯(mw＝26000)。待聚已内酯熔融完全后开始机械搅拌(400rpm)并保持80℃加热20分钟。然后停止加热，保持机械搅拌至体系自然冷却。通过抽滤装置滤除液相得到微球，微球以大量清水进行洗涤以充分除去杂质。再通过不锈钢筛网筛出直径在20～70um范围内的微球。常温真空干燥1天后于-20℃下保存备用。

实施例4

这个实施例描述了包裹egf的聚乙交酯-丙交酯微球的制备过程。

称取1g聚乙交酯-丙交酯(mw＝40000)溶于10ml二氯甲烷中，然后加入1.5mlegf水溶液(egf的含量为25％wt)并超声乳化30分钟形成初乳。再将初乳滴加到100ml去离子水中(含有1.5％wt羟丁基几丁糖为乳化剂)，同时伴有机械搅拌(500rpm)形成复乳，保持此转速过夜以使二氯甲烷充分挥发。然后通过抽滤装置滤除液相得到微球，微球以大量清水进行洗涤以充分除去杂质。再通过不锈钢筛网筛出直径在20～70um范围内的微球。常温真空干燥1天后于-20℃下保存备用。

实施例5

这个实施例描述了外相透明质酸钠凝胶的制备过程。

称取6g透明质酸钠(mw＝150万)溶于100ml4％wtnaoh水溶液中，机械搅拌均匀后加入0.25g二乙烯砜。然后将温度升至45℃并保持机械搅拌3小时。停止加热，在机械搅拌的情况下加入300ml无水乙醇。用抽滤装置得到交联粉末，再用200ml无水乙醇洗涤粉末3次以除去杂质。然后用300ml磷酸缓冲液溶解粉末得到均一的凝胶体系，该凝胶体系装于透析袋中(截留分子量10000)于1.5l磷酸缓冲液中进行透析，共透析4天，每天换透析外液。最终得到的凝胶于4℃下保存备用。

实施例6

这个实施例描述了微球透明质酸钠凝胶体系的制备过程。

取2g实施例2中制备的聚已内酯微球与8g实施例5中制备的透明质酸钠凝胶进行混合，然后灌装灭菌即可得到包裹有微球的透明质酸钠凝胶体系。取一部分灭菌后的微球凝胶体系进行冷冻干燥，然后拍摄扫描电镜照片，如附图1所示。可见凝胶呈明显的层状取向结构，微球因凝胶的取向也呈一定程度的定向排列。

实施例7

这个实施例描述了载药微球透明质酸钠凝胶的制备过程。

取0.5g实施例4中制备的egf/聚乙交酯-丙交酯微球与2g实施例5中制备的透明质酸钠凝胶进行混合，然后灌装灭菌即可得到包裹有载药微球的透明质酸钠凝胶体系。

实施例8

这个实施例描述了微球透明质酸钠凝胶体系的皮下植入试验。

将实施例7中得到的微球透明质酸钠凝胶体系注入到新西兰大白兔背部的皮下位置，沿着脊柱两侧各打3个位置，每个位置注入0.5ml凝胶体系。1个月后处死动物，进行病理切片染色，如附图2所示。在植入体内1个月后仍能保持微球的定向排列。