一种可实现细胞包裹的丝素蛋白/明胶互穿网络水凝胶及其制备方法与流程

本发明属于组织工程材料领域，具体涉及一种可实现细胞包裹的丝素蛋白/明胶互穿网络水凝胶及其制备方法。

背景技术：

软骨组织是一种不含血管、淋巴和神经的特殊结缔组织，一旦受损，极易诱发关节炎等疾病，从而使其功能出现障碍。软骨受损后很难实现自我修补主要是因为无法提供血管，造成在缺损后不能自发聚集纤维凝块。又由于软骨细胞自身的分化能力较强，损伤之后就很难在缺失部位进行移动和生长。并且这种分裂的能力会随年岁逐渐减弱，细胞基质更替能力也下降，因此治疗软骨缺损成为一个医学界共同面临的难题。

当前，治疗软骨损伤的主要方法是自体移植和异体移植，自体移植存在供体不足，且极易导致供区感染或畸变等缺陷，而异体移植时细胞免疫排斥反应是制约软骨损伤疾病治疗的最大阻碍。从软骨愈合机制上探讨软骨修复材料的制备并与组织工程技术手段相结合，这为实现受损软骨组织的再生并改善软骨的功能提供了全新的思路。

理想的软骨修复材料需要拥有优良的生物相容性、相匹配的生物降解能力、表面活性，更重要的是能够模拟软骨细胞外基质并具有一定强度的力学性能。水凝胶类材料是一种具有高度吸水性和保水性，质感柔软的具有三维网络体系的聚合物，这些特性充分满足了特异型细胞分化迁移等生命活动所需要的微环境，最重要的是水凝胶能够模拟软骨的细胞外基质，因而水凝胶成为了软骨组织修复常应用的材料。

当前水凝胶的制备方法多种多样，物理因素、化学因素和生物因素等都能成功诱导水凝胶的形成。然而，物理因素存在水凝胶机械性能差的缺点，化学因素存在有毒交联试剂的引入，生物因素更是存在诸多不可控条件。

因此，选取具有良好生物相容性和机械性能的原料，并优化制备流程，是实现水凝胶绿色制备的关键。

技术实现要素：

针对现有水凝胶制备技术的缺陷，本发明提供了一种可实现细胞包裹的丝素蛋白/明胶互穿网络水凝胶的制备方法，所述方法利用甲基丙烯酸酐对明胶进行改性，从而使明胶具有紫外光光敏感性，利用超声-光交联技术分别对复合溶液成胶，得到了具有优良生物相容性，较强力学性能，溶胀性能好，稳定的互穿网络水凝胶，这种绿色环保的成胶方法有效地避免了有毒试剂的加入，不会对细胞造成毒害，并且能够实现细胞的粘附增殖与原位三维包裹，有利于软骨组织在体外的三维构建。

为实现上述发明目的，具体提供了如下技术方案：

1、一种可实现细胞包裹的丝素蛋白/明胶互穿网络水凝胶的制备方法，包括如下步骤：

1)将丝素蛋白溶液、改性明胶溶液混合形成预聚物溶液，向预聚物溶液中加入光引发剂；

2)超声处理步骤1)所得溶液，超声后溶液具有流动性且透明；

3)经步骤2)处理所得溶液与细胞混合均匀得细胞预聚溶液，进一步将细胞预聚溶液置于培养皿中；

4)将步骤3)所得培养皿放在紫外光下进行光交联成胶，然后放置在37℃恒温箱中，至模具溶液变成乳白色后即制得可实现细胞包裹的丝蛋白/明胶互穿网络水凝胶。

优选的，步骤1)所述丝蛋白采用了依次脱胶、溶解、透析、浓缩的分离提纯工艺。

优选的，步骤1)所述明胶用甲基丙烯酸酐改性。

优选的，步骤1)所述丝蛋白溶液、改性明胶溶液的质量分数均为8％，所述丝蛋白溶液与改性明胶溶液的添加质量比例为7～9：1～3，所述光引发剂与丝蛋白溶液和改性明胶总溶液的质量体积比(g/ml)为0.1％。

优选的，步骤3)中加入的细胞个数与经步骤2)处理所得溶液体积比为100万个/ml。

优选的，步骤4)所述紫外光光源波长：320-480nm，紫外点光源功率：7.0mw/cm²。

2、根据所述方法制备的可实现细胞包裹的丝素蛋白/明胶互穿网络水凝胶。

本发明的有益效果在于：本发明通过选取具有良好生物相容性和机械性能的原料，并优化制备流程，实现了绿色环保的成胶方法，此方法有效地避免了有毒试剂的加入，不会对细胞造成毒害，并且能够实现细胞的粘附增殖与原位三维包裹，有利于软骨组织在体外的三维构建。并且制备的水凝胶最大溶胀率为11.3754±0.29；最大弹性模量可达600kpa±5kpa；具有较强的酶促抗降解性。

具体实施方式

下面将结合具体实施例对本发明进行更加详细的阐述。

以下实施例使用的丝素蛋白由家蚕蚕丝分离提纯制得，分离提纯工艺如下：

丝素蛋白的分离提纯：

1)脱胶：采用碱煮法对家蚕蚕丝进行脱胶处理：

取1g无水碳酸钠加入2l的蒸馏水中溶解，加热至溶液沸腾后放入20g蚕丝。在溶液沸腾下用玻璃棒不断搅拌，半小时后取出蚕丝，用去离子水清洗10次以上。更换2l去离子水，提升na2co3溶液浓度至1％(w/v)，将洗好的蚕丝放入其中继续沸腾搅拌煮30分钟，取出蚕丝再次用去离子水反复清洗，最后风干得脱胶蚕丝备用。

2)溶解：采用浓度约为9.3m的溴化锂溶液，对脱胶蚕丝进行溶解，且脱胶蚕丝的质量与溶液的体积比为4:25：

称取4g脱胶蚕丝和21g溴化锂粉末，将21g溴化锂溶于25ml去离子水中，待溴化锂完全溶解并释放大量热的同时，将4g脱胶蚕丝加入到该溶液中，待蚕丝整体溶解后，将其放在60℃烘箱内约二十分钟，维持一定温度以确保蚕丝完全溶解。当溶液完全处于澄清透明状后即可认定蚕丝完全溶解。

3)透析：利用截留分子量为3500d的透析袋，并在4℃的条件下透析：

将溶解后的丝素蛋白倒入截留分子量为3500d的透析袋中，并将其放入去离子水中，每天更换5次去离子水，透析3天即可。

4)浓缩：利用高浓度的聚乙二醇(peg)溶液进行浓缩：

将透析结束的丝素蛋白溶液进行离心处理，离心时间和转速分别为5min、4000rmp,除去不溶杂质后再次将溶液倒入3500d的透析袋中，并放入高浓度的peg溶液内以除去部分水分。本发明中涉及到的丝素蛋白浓度为8％，通过浓缩和稀释可调节至相应浓度。

以下实施例所使用的改性明胶为使用甲基丙烯酸酐进行改性的明教，具体步骤为：称取5ga型明胶溶解于50mlpbs中，用磁力搅拌器加热匀速搅拌，溶解完全后，缓慢滴入5ml的甲基丙烯酸酐溶液。滴加完成之后保持一定转速在50℃下反应3小时，最后加入100mlpbs溶液稀释，将稀释好的溶液放入到截留分子量为8000-12000d的透析袋中，用去离子水在60℃下透析7天，每天更换5次去离子水，透析完成后将所得的明胶溶液冷冻干燥处理，最终得到具有紫外光敏感性的改性明胶。

实施例1

1、一种可实现细胞包裹的丝素蛋白/明胶互穿网络水凝胶的制备方法，包括如下步骤：

1)将质量分数为8％的丝素蛋白溶液、质量分数为8％的改性明胶溶液按照质量比10:0混合形成预聚物溶液，向预聚物溶液中加入光引发剂2-羟基-4′-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮，光引发剂与预聚物溶液的质量体积比(g/ml)为0.1％；

2)超声处理步骤1)所得溶液超声时间为35s，超声后溶液具有流动性且透明；

3)按照加入的细胞个数与经步骤2)处理所得溶液体积比为100万个/ml的比例，经步骤2)处理所得溶液与细胞反复吹打以混合均匀得细胞预聚溶液，取130ul细胞/预聚溶液滴入激光共聚焦专用培养皿中，然后置于紫外光(紫外光光源波长：320-480nm，紫外点光源功率：7.0mw/cm²⁾下交联固化10s,成胶之后加入足够的培养基，培养一段时间后用fda/pi复染溶液对细胞/水凝胶进行染色，并在倒置荧光显微镜下进行观察。

实施例2

1、一种可实现细胞包裹的丝素蛋白/明胶互穿网络水凝胶的制备方法，包括如下步骤：

1)将质量分数为8％的丝素蛋白溶液、质量分数为8％的改性明胶溶液按照质量比9：:1混合形成预聚物溶液，向预聚物溶液中加入光引发剂2-羟基-4′-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮，光引发剂与预聚物溶液的质量体积比(g/ml)为0.1％；

2)超声处理步骤1)所得溶液超声时间为40s，超声后溶液具有流动性且透明；

3)按照加入的细胞个数与经步骤2)处理所得溶液体积比为100万个/ml的比例，经步骤2)处理所得溶液与细胞反复吹打以混合均匀得细胞预聚溶液，取130ul细胞/预聚溶液滴入激光共聚焦专用培养皿中，然后置于紫外光(紫外光光源波长：320-480nm，紫外点光源功率：7.0mw/cm²⁾下交联固化10s,成胶之后加入足够的培养基，培养一段时间后用fda/pi复染溶液对细胞/水凝胶进行染色，并在倒置荧光显微镜下进行观察。

实施例3

1、一种可实现细胞包裹的丝素蛋白/明胶互穿网络水凝胶的制备方法，包括如下步骤：

1)将质量分数为8％的丝素蛋白溶液、质量分数为8％的改性明胶溶液按照质量比8:2混合形成预聚物溶液，向预聚物溶液中加入光引发剂2-羟基-4′-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮，光引发剂与预聚物溶液的质量体积比(g/ml)为0.1％；

2)超声处理步骤1)所得溶液超声时间为49s，超声后溶液具有流动性且透明；

3)按照加入的细胞个数与经步骤2)处理所得溶液体积比为100万个/ml的比例，经步骤2)处理所得溶液与细胞反复吹打以混合均匀得细胞预聚溶液，取130ul细胞/预聚溶液滴入激光共聚焦专用培养皿中，然后置于紫外光(紫外光光源波长：320-480nm，紫外点光源功率：7.0mw/cm²⁾下交联固化10s,成胶之后加入足够的培养基，培养一段时间后用fda/pi复染溶液对细胞/水凝胶进行染色，并在倒置荧光显微镜下进行观察。

实施例4

1、一种可实现细胞包裹的丝素蛋白/明胶互穿网络水凝胶的制备方法，包括如下步骤：

1)将质量分数为8％的丝素蛋白溶液、质量分数为8％的改性明胶溶液按照质量比7:3混合形成预聚物溶液，向预聚物溶液中加入光引发剂2-羟基-4′-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮，光引发剂与预聚物溶液的质量体积比(g/ml)为0.1％；

2)超声处理步骤1)所得溶液超声时间为49s，超声后溶液具有流动性且透明；

3)按照加入的细胞个数与经步骤2)处理所得溶液体积比为100万个/ml的比例，经步骤2)处理所得溶液与细胞反复吹打以混合均匀得细胞预聚溶液，取130ul细胞/预聚溶液滴入激光共聚焦专用培养皿中，然后置于紫外光(紫外光光源波长：320-480nm，紫外点光源功率：7.0mw/cm²⁾下交联固化10s,成胶之后加入足够的培养基，培养一段时间后用fda/pi复染溶液对细胞/水凝胶进行染色，并在倒置荧光显微镜下进行观察。

分别对实施例1～4所得水凝胶进行荧光照射，得到如图1所示的荧光照片，由照片可反映出包裹在水凝胶内部的细胞经一天时间培养后，表现出较高的活性，从而证实了利用超声-紫外光交联技术，制备sf-gelma互穿网络水凝胶是一种绿色环保的方法，不会对细胞造成毒害，有利于细胞的生长，有望用于软骨的三维体外构建。

进一步对实施例3所得水凝胶通过150倍的电镜扫描，得到如图2所示的扫描图，由图2可看出该互穿网络水凝胶的疏松多孔网状结构明显，这样的结构让小分子进出水凝胶更为容易，为其优异的溶胀、渗透性能提供了一定的结构基础。

对实施例2～3所得水凝胶进行力学性能检测，复合水凝胶的最大溶胀率为11.3754±0.29；最大弹性模量可达600kpa±5kpa；并且具有较强的酶促抗降解性。

最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。