一种脱细胞软骨基质材料的制备方法与流程

本发明属于生物材料制备技术领域，具体涉及一种脱细胞软骨基质材料的制备方法。

背景技术：

“软骨”是特化的致密的结缔组织。由大量的细胞间质和有包囊的软骨细胞构成。软骨囊内有至多个细胞福胞间质坚勿面有弹性。动物的外耳、易，气管壁、脊根骨之间、助骨的末端等处都有软骨。“软骨”是人或脊椎动物体内的一种结缔组织。在胚胎时期，人的大部分骨骼是由软骨组成的。成年人的身体上只有鼻尖、外耳、肋骨的尖端、椎骨的连接面等处有软骨。“软骨”可分为透明软骨、弹性软骨和纤维软骨，为一种略带弹性的坚韧组织，在机体内起支持和保护作用。由软骨细胞、纤维和基质构成。基质含有70％的水分，有机成分主要是多种蛋白，如软骨粘蛋白、胶原和软骨硬蛋白等。在胎儿和年幼期，软骨组织分布较广，后来逐渐被骨组织代替。成年人软骨存在于骨的关节面、肋软骨、气管、耳廓、椎间盘等处。

因创伤、炎症、退变、肿瘤切除等原因导致的关节软骨损伤是临床上常见的疾病。关节软骨再生及修复能力极为有限,一旦损伤后,难以自身修复,病情继续发展,必然导致骨性关节炎。目前的治疗方法,如微骨折术、自体或异体骨膜、软骨膜、骨软骨块移植等,都存在着种种缺陷，从而限制了临床应用。

目前用于软骨损伤修复的软骨基质材料主要有两类，即人工合成材料和天然的细胞外基质。

人工合成的聚合物植入体内后可能引起受者的免疫排斥反应；原有组织和植入的材料整合困难，复合物的机械强度降低。而且，plga等一些聚合物的酸性降解产物可能引起炎性反应。

脱细胞基质即天然的细胞外基质一般指异体组织经细胞灭活处理后，制备成无活体细胞存在的ecm成分和结构。因其无抗原性，以及有良好的生物相容性，成为天然的细胞外基质材料的选择之一。细胞外基质的成分常常在物种间保持，并能被异种受体耐受。从不同组织获得的细胞外基质，包括皮肤、心脏瓣膜、血管、神经、骨骼肌、肌腱、韧带、小肠粘膜下层，已经在组织工程和可再生性材料应用中做了广泛研究。脱细胞的目标是有效的移除所有细胞和胞核物质，同时尽量减小对材料生物活性、机械完整性的不利影响，还可以解决受体排斥反应问题。

已有专利cn1324567a记载的方法制成的细胞外基质，其碱液的浓度高，浸泡的时间长，处理温度高，造成纤维消化，出现塌陷和空隙层，这将造成产品应用时细胞不能长入，对终产品的使用造成影响。其碱液浓度低、浸泡时间短，处理温度低，造成细胞脱不干净，引起基体的免疫反应，造成产品使用失败。

技术实现要素：

基于本领域存在的上述不足以及脱细胞软骨基质的诸多优点，本发明旨在提供一种既能使细胞脱除干净，又能保证软骨组织的完整性，从而达到保证产品安全、高质量的目的。

本发明的技术方案如下：

一种脱细胞软骨基质材料的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)将人或动物的软骨组织置于固定剂中进行固定处理；

(2)用适宜的溶液将对固定处理后的软骨组织进行洗涤，洗涤次数可以是多次；

(3)将洗涤后的软骨组织置于碱性溶液中进行脱细胞处理；

(4)将脱细胞处理后的软骨组织进行浸提清洗处理；

所述固定剂为戊二醛、甲醛或过氧乙酸；

所述适宜的溶液可以是蒸馏水；

所述碱性溶液选自质量百分比浓度范围在4％-15％之间的naoh或koh溶液；

所述浸提清洗处理中使用的清洗液为生理盐水。

所述固定处理的时间为2小时以上，或者直到该组织被固定。

所述软骨组织进行洗涤的次数可以为多次。

所述脱细胞处理的时间为15-30小时，温度为15-35℃。

所述浸提清洗处理的时间为5-7小时。

所述制备方法还包括：进行所述浸提清洗处理后，可变化洗涤溶液，继续清洗直至软骨组织呈半透明状态。

所述制备方法还包括：将浸提清洗处理后的软骨组织置于氨基酸溶液中。

所述氨基酸溶液包括天门冬氨酸、谷氨酸或甘氨酸；优选地，所述氨基酸溶液的质量百分比浓度为0.5％-2％。

所述脱细胞软骨基质材料保存于氨基酸溶液中，并调整溶液ph值为7.4左右。

所述的制备方法制备得到的脱细胞软骨基质材料。

在本发明的一些具体实施例中，所述制备方法具体按如下步骤进行：取人或动物组织所得的软骨，去脂肪，放入固定剂中固定，固定剂可以是戊二醛、甲醛或过氧乙酸。该组织在固定液中至少保留2小时，或者直到该组织被固定。组织固定后用适宜的溶液对其进行洗涤，该溶液可以是蒸馏水，洗涤次数可以是多次。

然后将该组织放在碱性溶液中进行脱细胞，碱性溶液可以是naoh或koh溶液。放置时间为15-30小时，温度为15-35℃，碱液浓度为4％-15％。

本文中涉及的百分比浓度均为质量百分比浓度。

现有技术记载的方法制成的细胞外基质，其碱液的浓度高，浸泡的时间长，处理温度高，造成纤维消化，出现塌陷和空隙层，这将造成产品应用时细胞不能长入，对最终产品的使用造成影响。其碱液浓度低、浸泡时间短，处理温度低，造成细胞脱不干净，引起基体的免疫反应，造成产品使用失败。

组织脱细胞后，使用生理盐水进行浸提清洗，浸泡时间为5-7小时，保证组织的生物安全性。实践中发现，若没有浸泡清洗，组织的细胞毒性不合格。

组织浸泡清洗后，可变化洗涤溶液，直到清洗为半透明状态，然后将组织放置于氨基酸中消除残留的游离固定剂并降低ph。氨基酸可以是天门冬氨酸、谷氨酸或甘氨酸，浓度为0.5％-2％，最后调整ph约为7.4。

本发明保留了完好的细胞外基质以及活性物质，对于细胞的生长、分化、代谢、调节起到不可代替的作用。通过该技术处理过的组织，由于能够被宿主识别出对宿主表达组织免疫抗原性的细胞物质被去除，完整保留了脱细胞基质的形态，组织结构、超微结构，定位和耐受性等都与原有组织的基质一样。

为了避免碱液浓度过高导致的过度消化脱细胞基质而使基质材料产生塌陷，而碱液浓度过低又会导致脱细胞效果不理想的情况发生，本发明经反复验证摸索出一套全新的软骨基质脱细胞处理方法，采用质量百分比浓度范围在4％-15％之间的naoh或koh溶液可使最终制备得到的脱细胞软骨基质材料的空隙率保持在70％-90％之间，空隙大小在12μm-67μm之间，细胞残留量为0，具备上述性能的脱细胞软骨基质材料可以很好地用于软骨组织的移植和/或修复，使软骨细胞得以快速长入、不产生免疫原性、使用安全的同时，又不会因基质纤维过度消化而产生塌陷或空隙层，保证了脱细胞软骨基质的材料完整性和产品质量。

附图说明

图1为本发明一个实施例所提供的制备方法制备得到的脱细胞软骨基质材料的h-e染色结果图，×400，由图可知：皮肤基质通过上述方法处理后，胶原纤维排列整齐、致密，染色均匀，无水肿、崩解。无细胞结构发现。

图2为本发明一个实施例所提供的制备方法制备得到的脱细胞软骨基质材料的电镜照片图(标尺：10μm)，可以看出，皮肤基质通过上述方法处理后，表面光滑，局部有少量孔隙出现，无任何细胞附着。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步的详细说明，但并不限制本发明的范围。如无特殊说明，下述实施例中采用的操作均为常规方法，所采用的材料均可以商购获得。

生物材料的来源

本发明中采用的人或动物的软骨组织来自：人体软骨取材于无高血脂心血管病家族史、血清学检查人类免疫缺陷病毒(pcr法排除)、乙肝病毒、丙肝病毒、梅毒的人的各部位组织，来源均由捐献人或捐献亲属同意将组织捐献给医院或通过医院提供给相关机构进行医学临床使用的组织。动物软骨取材于定点饲养、定点采购、定点屠杀，以及根据国家相关规定进行动物防疫、检疫的动物软骨。

本发明提供一种脱细胞软骨基质材料的制备方法。在本发明所有的实施例中，都具备如下共同特征：所述制备方法包括如下步骤：

(1)将人或动物的软骨组织置于固定剂中进行固定处理；

(2)用适宜的溶液将对固定处理后的软骨组织进行洗涤，洗涤次数可以是多次；

(3)将洗涤后的软骨组织置于碱性溶液中进行脱细胞处理；

(4)将脱细胞处理后的软骨组织进行浸提清洗处理；

所述固定剂为戊二醛、甲醛或过氧乙酸；

所述适宜的溶液可以是蒸馏水；

所述碱性溶液选自浓度范围在4％-15％之间的naoh或koh溶液；采用这一碱液浓度可使处理得到的脱细胞软骨基质材料的细胞脱干净，不引起机体的免疫反应，同时使处理得到的脱细胞软骨基质材料具备足够空隙。经本发明制备方法处理制备得到的脱细胞软骨基质材料的空隙率为70％-90％，空隙大小可达到12μm-67μm，使产品应用时细胞得以长入，又不至于造成框架纤维过度消化从而出现空隙层过大使得材料塌陷。

本文中“空隙”的定义：细胞清除后相应空间空出，在原有细胞腾出的空间即空隙。由于原始的生物材料，例如本文中的软骨材料，经过了脱细胞等一系列处理，脱细胞后的基质框架结构会发生一定程度的改变，因此本文中的“空隙”与原始软骨中的细胞间的结构空隙不能等同。

所述浸提清洗处理中使用的清洗液为生理盐水。

在进一步的实施例中，所述固定处理的时间为2小时以上。这一步的作用在于：保护框架结构在脱细胞处理过程中不被破坏。

在一些实施例中，所述脱细胞处理的时间为15-30小时，温度为15-35℃。选用这些反应参数和反应条件的好处是：细胞脱除干净，框架保持完整。

在另一些实施例中，所述浸提清洗处理的时间为5-7小时。

在进一步的实施例中，所述制备方法还包括：进行所述浸提清洗处理后，可变化洗涤溶液，继续清洗直至软骨组织呈半透明状态。更换洗涤溶液进行继续清洗的作用是为了洗掉残留的固定剂和碱性溶液以及清洗液。具体地，所述洗涤溶液选自纯化水或蒸馏水。

在更进一步的实施例中，所述制备方法还包括：将浸提清洗处理后的软骨组织置于氨基酸溶液中。

在具体的实施例中，所述氨基酸溶液包括天门冬氨酸、谷氨酸或甘氨酸。

在优选的实施例中，其中所述氨基酸溶液的浓度为0.5％-2％。

在更具体的实施例中，所述脱细胞软骨基质材料保存于氨基酸溶液中，并调整溶液ph值为7.4左右；采用ph7.4左右的氨基酸溶液做为脱细胞软骨基质材料的保存溶液好处在于：为弱碱性溶液，能够保持蛋白活性，模拟蛋白的生存环境。

在具体的实施例中，所述人或动物的软骨组织优选为人或大动物的软骨组织。所述大动物指犬、猪、牛、猴等动物。

本发明的制备方法制备得到的脱细胞软骨基质材料可应用于软骨修复。

实验例1、本发明的具体操作

取人或动物组织所得的软骨，去脂肪，放入固定剂中固定，固定剂可以是戊二醛、甲醛或过氧乙酸。该组织在固定液中至少保留2小时，或者直到该组织被固定。组织固定后用适宜的溶液对其进行洗涤，该溶液可以是蒸馏水，洗涤次数可以是多次。

然后将该组织放在碱性溶液中进行脱细胞，碱性溶液可以是naoh或koh溶液。放置时间为15-30小时，温度为15-35℃，碱液浓度为4％-15％。

组织脱细胞后，使用生理盐水进行浸提清洗，浸泡时间为5-7小时，保证组织的生物安全性。实践中发现，若没有浸泡清洗，组织的细胞毒性不合格。

组织浸泡清洗后，可变化洗涤溶液，直到清洗为半透明状态，然后将组织放置于氨基酸中医消除残留的游离固定剂并降低ph。氨基酸可以是天门冬氨酸、谷氨酸或甘氨酸，浓度为0.5％-2％，最后调整ph约为7.4。

实验例2、本发明的方法制备得到的软骨基质材料的性能效果验证

采用本发明的制备方法获得的软骨基质材料，经本领域常规检测方法，例如发明专利申请201711056849.0记载的检测方法，检测下述各项性能指标，获得如下结果：

采用本发明的制备方法获得的软骨基质材料，其细胞毒性实验结果：细胞相容性良好；

免疫原性成分检测：无免疫原，细胞残留数量为0；

脱细胞效果数据：dna残留量<＝100ng/g；如图1所示，细胞残留量：0；

如图2所示，通过电镜观察、计数，统计得到本发明制备方法获得的脱细胞软骨基质材料的空隙数据为：空隙率为70％-90％，空隙大小可达到12μm-67μm。