本发明属于生物材料表面工程与仿生物制造工程交叉技术领域，尤其涉及微图形制备技术和心血管植入材料表面改性领域，具体涉及一种基于血管基膜结构在心血管植入材料表面仿生构建多功能修饰层的方法。
背景技术：
心血管植入材料表面修饰技术发展至今，已逐渐趋于成熟，并广泛应用于临床。但目前临床上所用材料表面疗效，远未达到预期目标。这主要是由于再好的表面修饰，其仿生功能也无法媲美机体本身心血管内血液接触界面的生物学功能健全。
通过对材料表面的仿生，赋予材料良好的血液相容性、仿生再内皮化能力和抑制巨噬细胞粘附能力是仿生生物化新技术的基础。
血管基膜，内皮细胞外基质，是介于血管内膜和中膜之间，由生理状态的收缩型平滑肌细胞和内皮细胞分泌的细胞外基质构成，含有多种生物大分子和生长因子组，在维持血管内膜和中膜的生理结构和功能中发挥重要功能。最近有研究发现完整的内皮细胞外基质与平滑肌细胞外基质在植入材料表面改善生物相容性方面各司其职，收缩型平滑肌细胞的外基质具有更好的促内皮细胞生长和抗凝血功能，而内皮细胞的外基质更倾向于促进表面释放更多的一氧化氮和前列腺环素等功能性因子。两种细胞外基质与单一的内皮细胞外基质成分比较，在促进植入材料表面内皮化和抗凝血都具有显著优势。尽管如此，完整的仿血管基膜结构的修饰层修饰心血管植入材料表面的相关研究，仍未见报道。问题在于：1)缺少在材料表面兼顾平滑肌细胞表型和模仿流体剪切力作用下内皮细胞的关键技术；2）在异体植入过程中的免疫排斥和炎症反应仍然是未来研究中亟需解决的问题。
材料表面图形化是一种使细胞形态改变的技术，在条纹状微图形表面调控下，细胞可以在没有流体剪切力的条件下达到形态拉长的目的，增强内皮细胞的一氧化氮(no)和前列腺环素(pgi2)等的分泌、细胞外基质构建。另有研究报道，条纹状微图形表面可在短时间内调控血管平滑肌细胞表型收缩。
透明质酸(ha)是细胞外基质的骨架和整合成分，其分子量从几千到上千万不等。由于其开放的空间链状结构和自身忽视免疫排斥作用的功能，ha具有保护蛋白质和生物因子免受免疫排斥作用影响的效果。ha分子结构中含有大量羧基和亚胺基，使其较容易以氢键、酰胺键或碱键的方式固定于羟基、胺基化或金属表面。
综上所述，可制备ha条纹状微图形于心血管植入材料表面，用于调控血管平滑肌细胞和内皮细胞表型和分泌功能，依次采用双细胞培养-脱附模式，制备一种仿血管基膜结构的修饰层。这种仿生的修饰层应具备较好的原位血管内壁界面功能：可有效改善材料表面血液相容性，一定程度上促进血管内膜结构和功能修复，对巨噬细胞等免疫排斥和炎症相关细胞的粘附和铺展具有明显的抑制作用。经查阅文献，目前尚无相关报道。
技术实现要素：
本发明的目的在于模仿血管基膜结构，采用图案化双细胞培养-脱附模式，在心血管植入材料表面构建一种多功能修饰层，通过该方法对心血管植入材料表面进行生物化改性可有效提高材料的血液相容性和细胞相容性。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现：
本发明提供了一种基于血管基膜结构在心血管植入材料表面仿生构建多功能修饰层的方法，它包括以下步骤：
a、在材料表面制备分子量为4×103-1×107da的透明质酸条纹状微图形，透明质酸为ha；透明质酸条纹状微图形中ha的宽度为100nm-100μm，裸露材料条纹宽度为100nm-100μm，待用；
b、材料表面图案化血管平滑肌细胞外基质的制备：将传代2-5代的血管平滑肌细胞以1×103-1×106个/ml的密度种植于步骤a所述透明质酸条纹状微图形表面，在37℃，体积百分比浓度5%co2的标准培养条件下培养1-15天，该步骤得到经ha微图形调控后，形状拉长、排布有序的收缩型平滑肌细胞；吸除用过的细胞培养液，培养细胞的样品用37℃的pbs清洗1-5遍后，加入脱细胞液，在37℃，体积百分比浓度5%co2的标准培养条件下脱细胞处理10-120分钟，取出后吸除脱细胞液，用37℃的pbs再次清洗1-5遍，37℃干燥后即得图案化血管平滑肌细胞外基质；
c、材料表面双层图案化血管平滑肌/内皮细胞外基质的制备：将传代2-5代的血管内皮细胞以1×103-1×106个/ml的密度种植于步骤b所述图案化血管平滑肌细胞外基质表面，在37℃，体积百分比浓度5%co2的标准培养条件下培养1-15天，该步骤得到经ha微图形调控后，形状拉长、排布有序的血管内皮细胞；吸除用过的细胞培养液，培养细胞的样品用37℃的pbs清洗1-5遍后，加入脱细胞液，在37℃，体积百分比浓度5%co2的标准培养条件下脱细胞处理10-120分钟，取出后吸除脱细胞液，用37℃的pbs再次清洗1-5遍，37℃干燥后即得目标物，步骤a、步骤b和步骤c均在无菌条件下完成。
根据上述的基于血管基膜结构在心血管植入材料表面仿生构建多功能修饰层的方法，所述材料表面透明质酸条纹状微图形具有在体外条件下模仿体内血流剪力调控平滑肌细胞与内皮细胞生理表型的作用，在此基础上采用双细胞培养-脱附模式所获得的仿生细胞外基质修饰层具有良好的血液相容性和细胞相容性；a步骤中所述透明质酸分子量为4×103-1×107da，所述材料表面微图形为透明质酸条纹状微图形，透明质酸条纹状微图形中ha的宽度为100nm-100μm，裸露材料条纹宽度为100nm-100μm；b步骤中所述血管平滑肌细胞为传代2-5代的平滑肌细胞，种植密度为1×103-1×106个/ml，在37℃，体积百分比浓度5%co2的标准培养条件下培养1-15天应得到形态拉长排布有序的收缩型平滑肌细胞；所述脱细胞条件为脱细胞前后用37℃的pbs次清洗样品表面1-5遍，加入脱细胞液后在37℃，体积百分比浓度5%co2的标准条件下孵化10-120分钟；c步骤中所述血管内皮细胞为传代2-5代的内皮细胞，种植密度为1×103-1×106个/ml，在37℃，体积百分比浓度5%co2的标准培养条件下培养1-15天应得到形态拉长排布有序的内皮细胞；所述脱细胞条件为脱细胞前后用37℃的pbs次清洗样品表面1-5遍，加入脱细胞液后在37℃，体积百分比浓度5%co2的标准条件下孵化10-120分钟。
根据上述的基于血管基膜结构在心血管植入材料表面仿生构建多功能修饰层的方法，步骤b和步骤c所述脱细胞液配置方法为：用0.1-1%的tritonx–100溶液与1-27%的氨水混合，混合体积配比为tritonx–100：氨水=（80-120）ml：（60-180）μl；配液完毕后需用滤膜过滤除菌，4℃避光保存。
本发明的反应过程与机理主要分为两个部分。第一部分为材料表面图案化平滑肌细胞外基质的制备。首先通过ha对细胞的粘附或阻抗作用使血管平滑肌细胞在材料表面特定的区域的生长；其次利用条纹状微图形的尺寸效应调控血管平滑肌细胞形态拉长，表型收缩，促进仿生条件下平滑肌细胞功能性因子分泌和细胞外基质构建；使用脱细胞试剂，剥离材料表面培养的收缩型平滑肌细胞，即可得到图案化的血管平滑肌细胞外基质。第二部分为材料表面仿血管基膜修饰层的获得。首先通过图案化平滑肌细胞外基质调控血管内皮细胞在特定的区域生长；其次利用条纹状微图形的尺寸效应和收缩型平滑肌细胞外基质，调控血管内皮细胞形态拉长，促进仿生条件下内皮细胞功能性因子分泌和细胞外基质构建；最后使用脱细胞试剂，剥离表面培养的内皮细胞，即可得到目标产物多功能仿血管基膜结构修饰层。由于ha本身就是细胞外基质的骨架成分，可以和细胞外基质发生复杂的相互作用，因此这种仿血管基膜修饰层可以牢固地固定在材料表面。
生物材料表面ha微图形调控内皮细胞的细胞外基质分泌以制备一种具有多功能的修饰表面是申请者发明的一种现有技术，该技术显著地改善了心血管植入材料表面的多种生物功能，但其缺点在于所构造的表面仍未达到预期要求，与血管内壁的完整功能比较仍存在较大差距，需要进一步改进。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
一、受血管基膜结构启发，考虑到细胞表型和流体切应力对血管内壁中细胞外基质结构组成的影响，创造性的在体外材料表面制备出仿血管基膜结构的多功能修饰层，利用透明质酸为图形的尺寸效应对血管平滑肌细胞/内皮细胞表型内皮和细胞外基质合成的调控，为仿生血管基膜结构的构建创造条件。通过该种方法，可以有效提高材料表面多功能修饰层的仿生度，使其结构和功能最大限度地接近人体血管内壁中的基膜生理结构和功能。
二、该仿血管基膜结构多功能修饰层的制备工艺简单易操作，无需昂贵复杂的设备，工艺成本较低，效果显著。
三、ha的存在可使该多功能仿生血管内皮细胞外基质免受免疫排斥和炎症反应等巨噬细胞相关生理病理因素的影响和干扰，为该生物化表面开辟更加广泛的应用前景。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明方法中仿血管基膜结构多功能修饰层制备的各步骤示意图；材料表面(materials);图案化平滑肌细胞外基质表面(ecmsmc)；仿血管基膜结构多功能修饰层(ecmsmc/ec)；
图2为样品表面扫描电镜图片；图案化平滑肌细胞外基质表面(ecmsmc)；图案化内皮细胞外基质表面(ecmec);仿血管基膜结构多功能修饰层(ecmsmc/ec)；结果显示：ecmsmc、ecmec和ecmsmc/ec三组表面均为多孔结构，其中ecmsmc/ec表面的孔隙直径显著小于ecmsmc和ecmec；
图3为将样品制备成箔贴于医药级输液管内壁，输液管两端分别连接新西兰大白兔的颈动脉和颈静脉，使血流流经贴有材料的输液管，以评价材料的血液相容性的半体内血液评价实验操作示意图；
图4为将样品制备成箔贴于医药级输液管内壁，输液管两端分别连接新西兰大白兔的颈动脉和颈静脉，使血流流经贴有材料的输液管，以评价材料的血液相容性的实验后贴有样品的输液管管腔堵塞直观图和材料表面血栓直观图：可见裸材料组管腔有一定的堵塞，表面有大量的血栓形成；ecmec组能一定程度缓解管腔堵塞，表面血栓量明显少于裸材料组；ecmsmc和ecmsmc/ec组与裸材料和ecmec组比较明显更进一步改善管腔堵塞，表面血栓也明显少于前两组；
图5为将样品制备成箔贴于医药级输液管内壁，输液管两端分别连接新西兰大白兔的颈动脉和颈静脉，使血流流经贴有材料的输液管，以评价材料的血液相容性的样品表面血栓定量图：结果与图4观测趋势一致，其中ecmsmc/ec组表面血栓量显著少于其它各组；
图6为将样品制备成箔贴于医药级输液管内壁，输液管两端分别连接新西兰大白兔的颈动脉和颈静脉，使血流流经贴有材料的输液管，以评价材料的血液相容性的管腔占有率统计图：ecmsmc/ec组管腔占有率显著高于其它各组；
图7为将样品制备成箔贴于医药级输液管内壁，输液管两端分别连接新西兰大白兔的颈动脉和颈静脉，使血流流经贴有材料的输液管，以评价材料的血液相容性的血流通畅率统计图：ecmsmc/ec组血流通畅率显著高于其它各材料组，与正常血管数值最接近。总之，ecmsmc/ec修饰层可显著提高材料表面血液相容性；
图8为样品表面血管内皮细胞培养后的荧光染色图；
图9为样品表面血管内皮细胞培养后的细胞数量统计结果图；
图10为样品表面巨噬细胞培养后的荧光染色图；
图11为样品表面巨噬细胞培养后的细胞数量统计结果图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明进行进一步说明。
实施例一
参见图1，本发明的第一种具体实施方式是，基于血管基膜结构，采用图案化双细胞培养-脱附模式，在不锈钢表面仿生构建一种多功能修饰层，其步骤为：
a、在抛光的不锈钢表面制备分子量为5×105da的透明质酸(ha)条纹状微图形，ha的条纹宽度为100nm，裸露材料条纹宽度分别为200nm，待用；
b、不锈钢表面图案化血管平滑肌细胞外基质的制备：将传代3代的血管平滑肌细胞以5×104个/ml的密度种植于步骤a所述微图形表面，在37℃，体积百分比浓度5%co2的标准培养条件下培养3天，该步骤得到经ha微图形调控后，形状拉长、排布有序的收缩型平滑肌细胞；吸除用过的细胞培养液，培养细胞的样品用37℃的pbs清洗5遍后，加入脱细胞液，在37℃，体积百分比浓度5%co2的标准培养条件下脱细胞处理18分钟，取出后吸除脱细胞液，用37℃的pbs再次清洗5遍，37℃干燥后即得图案化血管平滑肌细胞外基质；
c、不锈钢表面双层图案化血管平滑肌/内皮细胞外基质的制备：将传代4代的血管内皮细胞以1×104个/ml的密度种植于步骤b所述图案化血管平滑肌细胞外基质表面，在37℃，体积百分比浓度5%co2的标准培养条件下培养5天，该步骤得到经ha微图形调控后，形状拉长、排布有序的血管内皮细胞；吸除用过的细胞培养液，培养细胞的样品用37℃的pbs清洗5遍后，加入脱细胞液，在37℃，体积百分比浓度5%co2的标准培养条件下脱细胞处理15分钟，取出后吸除脱细胞液，用37℃的pbs再次清洗5遍，37℃干燥后即得目标物，步骤a、步骤b和步骤c均在无菌条件下完成；
d、步骤b和步骤c所述脱细胞液配置方法为：用0.1%的tritonx–100溶液(pbs,ph=7.4)与27%的浓氨水混合，混合体积配比为tritonx–100：浓氨水=80ml：120μl；配液完毕后需用滤膜过滤除菌，4℃避光保存。
实施例二
基于血管基膜结构，采用图案化双细胞培养-脱附模式，在钛表面仿生构建一种多功能修饰层，其步骤为：
a、在抛光的钛表面制备分子量为1×106da的透明质酸(ha)条纹状微图形，ha的条纹宽度为25μm，裸露材料条纹宽度分别为和25μm，待用；
b、钛表面图案化血管平滑肌细胞外基质的制备：将传代2代的血管平滑肌细胞以1×105个/ml的密度种植于步骤a所述微图形表面，在37℃，5%co2浓度的标准培养条件下培养2天，该步骤得到经ha微图形调控后，形状拉长、排布有序的收缩型平滑肌细胞；吸除用过的细胞培养液，培养细胞的样品用37℃的pbs清洗4遍后，加入脱细胞液，在37℃，体积百分比浓度5%co2的标准培养条件下脱细胞处理20分钟，取出后吸除脱细胞液，用37℃的pbs再次清洗4遍，37℃干燥后即得图案化血管平滑肌细胞外基质；
c、钛表面双层图案化血管平滑肌/内皮细胞外基质的制备：将传代3代的血管内皮细胞以2.5×104个/ml的密度种植于步骤b所述图案化血管平滑肌细胞外基质表面，在37℃，体积百分比浓度5%co2的标准培养条件下培养4天，该步骤得到经ha微图形调控后，形状拉长、排布有序的血管内皮细胞；吸除用过的细胞培养液，培养细胞的样品用37℃的pbs清洗4遍后，加入脱细胞液，在37℃，体积百分比浓度5%co2的标准培养条件下脱细胞处理16分钟，取出后吸除脱细胞液，用37℃的pbs再次清洗4遍，37℃干燥后即得目标物，步骤a、步骤b和步骤c均在无菌条件下完成;
d、步骤b所述脱细胞液配置方法为：用0.1%的tritonx–100溶液(pbs,ph=7.4)与19%的浓氨水混合，混合体积配比为tritonx–100：浓氨水=100ml：160μl；配液完毕后需用滤膜过滤除菌，4℃避光保存。
实施例三
基于血管基膜结构，采用图案化双细胞培养-脱附模式，在镁合金表面仿生构建一种多功能修饰层，其步骤为：
a、在镁合金表面制备分子量为4×103da的透明质酸(ha)条纹状微图形，ha的条纹宽度为30μm，裸露材料条纹宽度分别为20μm，待用；
b、镁合金表面图案化血管平滑肌细胞外基质的制备：将传代2代的血管平滑肌细胞以1×106个/ml的密度种植于步骤a所述微图形表面，在37℃，体积百分比浓度5%co2的标准培养条件下培养1天，该步骤得到经ha微图形调控后，形状拉长、排布有序的收缩型平滑肌细胞；吸除用过的细胞培养液，培养细胞的样品用37℃的pbs清洗1遍后，加入脱细胞液，在37℃，体积百分比浓度5%co2的标准培养条件下脱细胞处理10分钟，取出后吸除脱细胞液，用37℃的pbs再次清洗1遍，37℃干燥后即得图案化血管平滑肌细胞外基质；
c、镁合金表面双层图案化血管平滑肌/内皮细胞外基质的制备：将传代3代的血管内皮细胞以1×106个/ml的密度种植于步骤b所述图案化血管平滑肌细胞外基质表面，在37℃，体积百分比浓度5%co2的标准培养条件下培养1天，该步骤得到经ha微图形调控后，形状拉长、排布有序的血管内皮细胞；吸除用过的细胞培养液，培养细胞的样品用37℃的pbs清洗1遍后，加入脱细胞液，在37℃，体积百分比浓度5%co2的标准培养条件下脱细胞处理10分钟，取出后吸除脱细胞液，用37℃的pbs再次清洗1遍，37℃干燥后即得目标物，步骤a、步骤b和步骤c均在无菌条件下完成
d、步骤b所述脱细胞液配置方法为：用0.6%的tritonx–100溶液(pbs,ph=7.4)与25%的浓氨水混合，混合体积配比为tritonx–100：浓氨水=120ml：180μl；配液完毕后需用滤膜过滤除菌，4℃避光保存。
本发明不局限于上述最佳实施方式，任何人在本发明的启示下都可得出其他各种形式的产品，但不论在其形状或结构上作任何变化，凡是具有与本申请相同或相近似的技术方案，均落在本发明的保护范围之内。