本发明涉及生物化学技术领域，具体涉及化合物4,5-diphenyl-2-methyl picolinate(简称DMP)在胃癌药物中的应用。
背景技术：
胃癌(gastric carcinoma)是起源于胃黏膜上皮的恶性肿瘤，据2015年全球癌症数据统计结果报告，全球范围内最常见的恶性肿瘤胃癌排名第五位，每年新发病例约130万人；年均死亡81.9万人，致死率在恶性肿瘤中排名第三位。胃癌是当前危害我国人民身体健康的重大疾病：我国是胃癌的高发区域，每年约有40万胃癌新发患者，占世界发病患者数的30.77％，年均死亡率为欧美发达国家的4-8倍，且新发胃癌患者年龄呈年轻化趋势。诱发胃癌的因素有许多，主要包括：感染、胃病史、不良的饮食方式、性别以及家族遗传史等复杂因素。胃癌起病隐匿，早期症状极不明显，有些患者仅有非特异性的消化不良症状，导致患者对自身健康状况做出错误判断而耽误就医时机，发现时常属晚期。
目前在胃癌治疗方案的选择上，主要通过还是通过手术切除结合基于铂、紫杉醇类传统药物化疗的联合治疗方案等进行综合治疗，虽然在一定程度上可以缓解患者的病情，但由于手术切除的不彻底性、传统化疗药物的毒副作用强及癌细胞对传统化疗药物易产生耐药性等客观问题，大多数晚期胃癌患者应用常规方案治疗后生活质量下降，且术后肿瘤易复发，给患者带来更大的痛苦。这使得人们不断在寻求一种既可以有效抑制胃癌病情恶化的同时，又可以减少对患者身体伤害的药物。
吡啶类衍生化合物的研究应用范围广泛涉及到医药、农药、饲料、染料等领域，在医药领域内的应用尤其重要，如结核病药异烟肼，中枢兴奋药尼可刹米等均为基于吡啶类衍生化合物开发的小分子药物。
技术实现要素：
本发明的目的在于克服现有技术中的缺陷，为更好的治愈或为治疗胃癌提供一种更加安全，效果更好的选择。
本发明通过筛选一种化合物DMP，(HPLC纯化，纯度99％)。并进一步验证了其在10μM和30μM浓度下在抗胃癌活性方面具有很好的抑制效果，而对人正常胃上皮细胞GES-1的增殖没有明显抑制作用，进而为治疗胃癌或诱导胃癌细胞的周期阻滞提供了新的疗法或手段。
本发明首先提供一种吡啶类衍生化合物在制备治疗胃癌药物方面的应用，其中所述的吡啶类衍生物为4,5-二苯基-2-吡啶甲酸甲酯(4,5-diphenyl-2-methyl picolinate)，简称DMP，该化合物具体的化学结构式如下：
其中，所述应用具体为可抑制胃癌细胞增殖；具体的，所述应用为通过阻滞胃癌细胞的G2/M期，而抑制胃癌细胞的增殖。
本发明还提供一种治疗癌症的药物，所述药物中的有效成分为吡啶类衍生物4,5-二苯基-2-吡啶甲酸甲酯(4,5-diphenyl-2-methyl picolinate)，简称DMP。
其中所述药物还包括药学上可接受的载体或辅料，所述载体和/或辅料为本领域技术人员所知晓，在此不做赘述。
所述的药物为抑制胃癌细胞增殖或阻滞胃癌细胞周期的药物；具体的，所述的药物通过阻滞胃癌细胞在G2/M期，而抑制胃癌细胞增殖的药物。
本发明通过如下方法对DMP的新用途进行验证：
(1)本发明通过一系列的筛选方法对一系列吡啶类衍生化合物通过体外噻唑蓝比色法(MTT)实验对其进行初步筛选，筛选出在对人正常胃上皮细胞影响较小的情况下具备有效抑制胃癌细胞增殖作用的化合物。本发明实验所用细胞为胃癌细胞MKN-28、MKN-45和人正常胃上皮细胞GES-1，通过筛选得到化合物DMP。本发明经实验研究表明，该化合物对人正常胃上皮细胞GES-1无明显的毒副作用，但可以影响胃癌细胞周期，从而可以抑制胃癌细胞的增殖。因此，本发明涉及的化合物在抗胃癌活性方面具有非常大的作用，并且在日后胃癌的治疗方面具有很大的潜在价值。
(2)化合物DMP对胃癌细胞的特异性增殖抑制进一步采用体外培养法筛选实验得出的，实验所用细胞为胃癌细胞MKN-28、MKN-45和人正常胃上皮细胞GES-1，筛选实验包括MTT检测细胞存活率，细胞周期及细胞凋亡检测，测定该化合物对胃癌细胞和人正常胃上皮细胞之间的细胞毒性差异，以及对胃癌细胞的周期、凋亡的影响。从而验证该化合物有显著的抑制胃癌细胞增殖的生物活性。MTT实验证实化合物DMP对人正常胃上皮细胞GES-1的增殖没有明显的抑制作用，但对胃癌MKN-28和MKN-45细胞的增殖具有明显的抑制作用，并且表现出剂量依赖性，其IC50值分别为26.52μM和21.03μM；细胞凋亡检测结果表明，该化合物并没有明显诱导胃癌细胞发生凋亡；细胞周期检测结果表明，该化合物在一定浓度范围下在G2/M期可阻滞胃癌细胞。
本发明的有益效果：
通过化合物DMP对胃癌细胞MKN-28和MKN-45及人正常胃上皮细胞GES-1增殖情况和毒性研究，发现该化合物有明显抑制胃癌细胞增殖的能力，对人正常胃上皮细胞的增殖没有明显的抑制作用。本发明相比传统化疗药物，DMP能够明显抑制胃癌细胞的增殖(主要有细胞周期阻滞引起的)，然而对正常细胞的增殖没有明显的影响，相对于传统广谱抗癌药物而言，极大降低了对正常细胞组织的毒副作用。因此本发明为胃癌药物治疗提供了新的药物选择，同时为药物的设计研发提供了理论支持，在对胃癌的研究和治疗方面具有极大的潜质，为今后的胃癌药物的研发提供了参考。
附图说明
图1为作用浓度为100μM的不同化合物对胃癌MKN-28细胞的影响结果。
图2为DMP作用于胃癌MKN-28细胞后，三次平行试验后统计所得的生长抑制曲线；其中，横坐标为DMP化合物的浓度，单位为μM，纵坐标为细胞存活率。
图3为DMP作用于胃癌MKN-45细胞后，三次平行试验后统计所得的生长抑制曲线；其中，横坐标为DMP化合物的浓度，单位为μM，纵坐标为细胞存活率。
图4为DMP作用于人正常胃上皮细胞GES-1后，三次平行试验后统计所得的生长抑制曲线；其中，横坐标为DMP化合物的浓度，单位为μM，纵坐标为细胞存活率。
图5为分别应用0μM、15μM、30μM浓度的DMP和40μM的顺式二氯二胺合铂(Cisplatin)处理胃癌MKN-28细胞48h后经PI/Annexin V染色的流式细胞检测图。
图6为分别应用0μM、15μM、30μM浓度的DMP和40μM的顺式二氯二胺合铂(Cisplatin)处理胃癌MKN-28细胞48h后经PI/Annexin V染色的流式细胞检测平行3次实验后的细胞凋亡统计结果。
图7为分别用0μM、15μM、30μM浓度的DMP处理胃癌MKN-28细胞48h后PI染色的流式细胞检测图(上图)。
图8为分别用0μM、15μM、30μM浓度的DMP处理胃癌MKN-28细胞48h后PI染色的流式细胞检测平行3次实验后的细胞各时期的统计结果。
具体实施方式
本发明所涉及的具体化合物为吡啶类衍生化合物DMP，通过下面的实施步骤进一步详细的说明，以下叙述的非限制性实施例不以任何方式限制本发明。下述实施例中，如无特殊说明，所使用的实验方法均为常规方法，所用材料、试剂等均可从化学试剂公司购买。
本发明所涉及的具体化合物DMP的制备方法请参见Chunyin Zhu,*Benwei Bi,Ya Ding,Te Zhang and Qiu-Yun Chen.A mild and facile synthesis of polyfunctionalizedpyridines:merging three-component cyclizationand aerobic oxidation by amine/metal catalysts.Biomolecular Chemistry.2015,13,6278–6285.本发明涉及的化合物均由该论文作者提供。
实施例1.细胞的培养和传代
胃癌MKN-28、MKN-45细胞和人正常胃上皮细胞GES-1(American type culture collection)体外分别培养于含10％胎牛血清及青霉素-链霉素的RMPI-1640(Life Technologies公司，美国)培养基。每天定期观察细胞生长状态，待长满培养皿时及时传代(一般在贴壁细胞表面积占80％及以上时传代)。当细胞培养和传代效果良好时进行下一步实验。
实施例2.MTT检测细胞存活率
第一步：在底面直径为6cm的培养皿中培养胃癌细胞MKN-28，传代良好后，弃原培养液，用1mL PBS清洗，0.5mL胰酶消化，加2mL含10％胎牛血清及青霉素-链霉素的RMPI-1640培养基吹打混匀，取200g溶液离心5min，弃上清，加含10％胎牛血清及青霉素-链霉素的RMPI-1640培养基吹打混匀，取0.5ml到EP管，用枪吸取10μL于细胞计数板上计数或稀释相应倍数后计数。每孔种3000个细胞，一共6组孔，每组3个复孔，将细胞种到96孔板中,每孔吹打混匀。放入CO2恒温培养箱(Thermo scientific，37℃)静止培养24h，使其贴壁。
第二步：加浓度约为100μM不同化合物DMSO溶液，将不同化合物按一定量溶解于无菌干净的DMSO溶液中，保持每孔所加的化合物溶液的体积保持不变，对照加等体积的DMSO溶液。放入CO2恒温培养箱(37℃)静止培养48h。
所述不同化合物分别为：
A：5-(4-溴苯基)-1-(2-氧代-1,2-二苯基乙基)-1H-吡唑-3-羧酸乙酯
B：5-(4-甲氧基苯基)-1-(2-氧代-1,2-二苯基乙基)-1H-吡唑-3-羧酸甲酯
C：5-(4-氟苯基)-1-(2-氧代-1,2-二苯基乙基)-1H-吡唑-3-羧酸乙酯
D：甲基-1-(2-氧代-1,2-二苯基乙基)-5-(对甲苯基)-1H-吡唑-3-羧酸乙酯
E：5-氨基-1-(叔丁基)-3-苯基-1H-吡唑-4-甲腈
F：4-(4-溴苯基)-2-苯基-5,6,7,8-四氢喹啉
G：4-(4-氯苯基)-2-苯基-5,6,7,8-四氢喹啉
H：7-甲基-2,4-二苯基-5,6,7,8-四氢喹啉
I：4-(3-溴苯基)-2-苯基-5,6,7,8-四氢喹啉
J：2,4,6-三苯基吡啶
K：2-甲基-4,6-二苯基吡啶
和DMP。各化合物的化学结构式如下表1中所示。
本实施例所选化合物主要为吡唑，喹啉和吡啶类化合物，在医药领域研究中均较为广泛，并且所选化合物多未进行生物学验证。
表1.各化合物的化学结构式
第三步：将培养48h后的加药细胞取出，吸去培养基，分别加入10μL MTT(5mg/mL)，放入CO2恒温培养箱(37℃)反应1.5～2h，待细胞染成蓝紫色后吸去培养基，加入0.5mL的DMSO并轻轻震荡使结晶溶解。选择550nm波长，在酶标仪上测定各孔光吸收值，记录结果，并计算细胞存活率：细胞存活率＝(实验组OD值/对照组OD值)×100％。
三次平行实验后统计结果显示：如图1所示，在作用浓度为100μM时，不同化合物对胃癌MKN-28细胞的增殖抑制效果不同，其中化合物DMP对胃癌细胞的增殖抑制作用最为明显。
实施例3.MTT检测DMP化合物对不同细胞系细胞存活率的影响
第一步：在底面直径为6cm的培养皿中培养胃癌MKN-28，MKN-45和人正常胃上皮细胞GES-1，传代良好后，弃原培养液，用1mL PBS清洗，0.5mL胰酶消化，加2mL含10％胎牛血清及青霉素-链霉素的RMPI-1640培养基吹打混匀，取200g溶液离心5min，弃上清，加含10％胎牛血清及青霉素-链霉素的RMPI-1640培养基吹打混匀，取0.5mL到EP管，用枪吸取10μL于细胞计数板上计数或稀释相应倍数后计数。每孔种3000个细胞，一共6组孔，每组3个复孔，将细胞种到96孔板中，每孔吹打混匀。并设空白对照孔，加等体积细胞培养液。放入CO2恒温培养箱(Thermo scientific，37℃)静止培养24h，使其贴壁。
第二步：加不同浓度的DMP化合物的DMSO溶液。将化合物按不同比例稀释于无菌干净的DMSO溶液中，保持每孔所加的化合物稀释液的体积保持不变，所加浓度分别为0μM(对照组)、3.75μM、7.5μM、15μM、30μM、60μM，空白对照加等体积的DMSO溶液。放入CO2恒温培养箱(37℃)静止培养48h。
第三步：将培养48h后的加药细胞取出，吸去培养基，分别加入10μL MTT(5mg/mL)，放入CO2恒温培养箱(37℃)反应1.5～2h，待细胞染成蓝紫色后吸去培养基，加入0.5mL的DMSO并轻轻震荡使结晶溶解。选择550nm波长，在酶标仪上测定各孔光吸收值，记录结果，并计算细胞存活率：细胞存活率＝(实验组OD值-空白对照OD值)/(对照组OD值-空白对照OD值)×100％，用细胞存活率对化合物剂量对数作图求出IC50值(细胞数量减少一半时所需化合物浓度)。
三次平行实验后统计所得生长抑制曲线实验结果显示：化合物DMP可以有效抑制胃癌细胞的细胞增殖，但是对人正常胃上皮细胞的增殖没有明显的影响。如图2所示，化合物DMP对胃癌MKN-28细胞生长的抑制呈浓度依赖关系，IC50为26.52μM。如图3所示，该化合物对胃癌MKN-45细胞生长的抑制也同样呈浓度依赖关系，IC50为21.03μM。如图4所示，该化合物对人正常胃上皮细胞GES-1生长无明显影响。
实施例4.流式细胞术检测DMP对胃癌细胞凋亡的影响
第一步：底面直径6cm培养皿的卵巢癌A2780细胞培养和传代良好后，弃原培养液，用2mL PBS清洗，0.5mL胰酶消化，加2mL含10％胎牛血清及青霉素-链霉素的RMPI-1640培养基吹打混匀，200g离心5min，弃上清，加含10％胎牛血清及青霉素-链霉素的RMPI-1640培养基吹打混匀，取0.5mL到EP管，用枪吸取10μL于细胞计数板上计数或稀释相应倍数后计数。取底面直径6cm的细胞培养皿，每碟种1×105个细胞,每组3碟。放入CO2恒温培养箱(37℃)静止培养24h，使其贴壁。
第二步：分别取0μM、15μM、30μM的化合物DMP剂量加入实验组细胞中，另外设40μM浓度的Cisplatin作为阳性对照。放入CO2恒温培养箱(37℃)静止培养48h。
第三步：将MKN-28细胞从6cm碟消化离心，收集所有的上清液。转至4℃冰盒，并在4℃冷冻离心机中300g离心5min，吸去上清，刮匀。将上清离心后的细胞和相应消化下来的细胞全部合并，用0.5mL预冷PBS洗涤，4℃冷冻离心机中300g离心5min，吸去上清，刮匀。每管加500ul 4℃预冷的PBS，混匀，重复上述操作。加入100μL 1×Binding Buffer重悬细胞，加入5μLAnnexin V-FITC和5μL PI Staining Solution(细胞凋亡试剂盒，上海翊圣生物科技有限公司)，轻轻摇匀。避光，室温反应10min，加入400μL 1×Binding Buffer，混匀，1h内送流式细胞仪检测。
实验结果显示：如图5和6所示，化合物DMP对胃癌MKN-28细胞的凋亡没有明显的促进作用，而阳性对照药物Cisplatin明显促进胃癌MKN-28细胞发生明显的早期凋亡和晚期凋亡。
实施例5.流式细胞术检测DMP对胃癌细胞周期的影响
第一步：底面直径6cm培养皿的胃癌MKN-28细胞培养和传代良好后，弃原培养液，用2mL PBS清洗，0.5mL胰酶消化，加2mL含10％胎牛血清及青霉素-链霉素的RMPI-1640培养基吹打混匀，200g离心5min，弃上清，加含10％胎牛血清及青霉素-链霉素的DMEM培养基吹打混匀，取0.5mL到EP管，用枪吸取10μL于细胞计数板上计数或稀释相应倍数后计数。取底面直径6cm的细胞培养皿，每碟种1×105个细胞，每组3碟。放入CO2恒温培养箱(37℃)静止培养24h，使其贴壁。
第二步：分别取0μM、15μM、30μM化合物DMP剂量加入实验组细胞中，对照组加入等体积的DMSO和培养基。放入CO2恒温培养箱(37℃)静止培养48h。
第三步：将培养48h后的细胞取出，吸去培养基，分别取0.5mL的PBS清洗，吸去PBS，加0.5mL胰酶消化，加0.5mL相应培养基终止消化，沿着孔壁吹洗，转至EP管，重复用0.5mL培养基洗一次，减少细胞残余。转至4℃冰盒，并在4℃冷冻离心机中300g离心5min，吸去上清，刮匀。每管加300μL 4℃预冷的PBS，混匀，4℃冷冻离心机中300g离心5min，吸去上清，刮匀。每管滴加0.5mL-20℃预冷的70％的乙醇，混匀，放入4℃冰箱保存至少24h。
第四步：从4℃取出待处理的细胞，4℃冷冻离心机中500g离心5min，弃上清，刮匀。每管加300μL 4℃预冷的PBS,混匀，4℃冷冻离心机中500g离心5min。弃上清，刮匀，每管加500μL PI染色液(485μL PBS+10μL 1mg/mL的PI+5μL 1mg/mL的RNASE)，吹打4-5次混匀，转至周期检测管，避光中37℃水浴锅中孵育1h。流式细胞仪检测细胞周期。
实验结果显示：如图7和8所示，化合物DMP对胃癌MKN-28细胞具有诱导细胞周期阻滞的作用，在30μM的化合物浓度下，G1期的细胞明显减少，G2/M期的细胞明显增多，胃癌细胞的周期明显阻滞在G2/M期。从而可以得出结论，该化合物是通过诱导细胞周期阻滞来抑制胃癌细胞增殖的。