一种人血清白蛋白-阿霉素交联物纳米颗粒及其应用的制作方法

本发明属于医药领域和生物技术领域，具体涉及一种纳米抗癌药物，特别涉及一种人血清白蛋白-阿霉素交联物及其治疗肿瘤的用途。

背景技术：

肿瘤现在依然是一种严重威胁人类将康的常见病和多发病，是引起死亡的主要原因之一。化疗是利用细胞毒性药物杀死肿瘤细胞，抑制肿瘤细胞的生长繁殖和促进肿瘤细胞分化的一种治疗方式，它是一种全身性治疗手段。但是，在临床治疗中，化疗治疗在杀伤肿瘤细胞的同事，也将正常细胞和免疫细胞一同杀死。其中，阿霉素是最常用、最重要的药物之一。

临床使用的阿霉素也叫多柔比星，是治疗肿瘤的一种重要化疗药物，但由于其产生的生物毒性限制了其临床上的广泛应用。由于其没有肿瘤靶向性，在化疗过程中会同时杀伤肿瘤组织和正常组织，长期使用阿霉素药物会产生严重的副作用，导致心脏、肝脏、大脑和肾的损伤。

技术实现要素：

基于现有技术中存在的上述问题，本发明以人血清白蛋白交联阿霉素，通过人血清白蛋白增强对肿瘤的靶向性，减少阿霉素的毒副作用。本发明意外发现了人血清白蛋白交联的阿霉素能够选择性的靶向乳腺癌细胞，能够用于乳腺癌治疗，并且经过标记后还可用于乳腺癌活体成像检测。另外，对于治疗效果而已，人血清白蛋白交联的阿霉素，与同等活性剂量的阿霉素(未交联)相比，肿瘤治疗效果更高，安全性也更好。

具体而言，一方面，本发明提供人血清白蛋白-阿霉素交联物在制备肿瘤检测剂中的用途，所述人血清白蛋白-阿霉素交联物是基于小分子交联技术，将阿霉素分子交联在白蛋白上形成的纳米颗粒。

本发明所述人血清白蛋白-阿霉素交联物在制备肿瘤检测剂中的用途，其中所述人血清白蛋白-阿霉素是经过标记的，所述肿瘤检测剂为活体成像剂。

本发明所述的用途，其中所述的肿瘤为乳腺癌，所述的标记为cy5.5标记。

第二方面，本发明提供人血清白蛋白-阿霉素交联物在制备治疗肿瘤药物中的用途，所述人血清白蛋白-阿霉素交联物是基于小分子交联技术，将阿霉素分子交联在白蛋白上形成的纳米颗粒。

本发明所述人血清白蛋白-阿霉素交联物在制备治疗肿瘤药物中的用途，其中所述肿瘤为乳腺癌。

本发明所述人血清白蛋白-阿霉素交联物在制备治疗肿瘤药物中的用途，其中所述治疗肿瘤的药物是选择性杀伤乳腺癌细胞的药物。

本发明所述人血清白蛋白-阿霉素交联物在制备治疗肿瘤药物中的用途，其中所述治疗肿瘤的药物是抑制乳腺癌细胞淋巴结转移的药物。

第三方面，本发明提供一种乳腺癌治疗药物，包括人血清白蛋白-阿霉素交联物纳米颗粒，其是将阿霉素分子通过小分子交联技术交联在人血清白蛋白上形成纳米颗粒，所述纳米颗粒平均粒径约为25nm；hsa与dox的比例为1:3。

第四方面，本发明提供一种人血清白蛋白-阿霉素交联物的制备方法，包括：

(1)白蛋白预活化，将白蛋白与spdp反应制备带有吡啶二巯基的白蛋白；

(2)预活化白蛋白的还原，将预活化的白蛋白还原制备巯基活化的白蛋白；

(3)交联，将aldox缓慢加入步骤(2)制备的巯基活化白蛋白中获得人血清白蛋白-阿霉素交联物。

本发明所述人血清白蛋白-阿霉素交联物的制备方法，其特征在于所述人血清白蛋白-阿霉素交联物为纳米颗粒，平均粒径为25nm；其中，hsa与dox的比例为1:3。

与现有技术相比，本发明的技术方案具有以下优点：

(1)本发明发现了白蛋白的肿瘤靶向性，特别是乳腺癌细胞靶向性，从而通过交联技术将阿霉素特异性运送至肿瘤组织，由于白蛋白交联阿霉素药物在肿瘤部位靶向富集后，会在肿瘤组织局部酸性微环境下缓慢释放阿霉素分子、递送至肿瘤细胞核内，从而特异性地对肿瘤细胞产生杀伤作用而不影响其他正常组织。从而实现肿瘤的成像和/或治疗。

(2)本发明的人血清白蛋白、阿霉素、标记物(如cy5.5)三元复合物除了能够治疗肿瘤以外，还能够实现肿瘤细胞的靶向成像，具体验证了对乳腺癌细胞的靶向成像，所述三元复合物的成像检测结果与luciferase成像结果一致，表明其可靠性和准确性。另外，对于乳腺癌的诊断，本发明三元复合物能够准确诊断乳腺癌细胞是否发生淋巴结转移。

(3)本发明的人血清白蛋白-阿霉素交联物，与同等活性剂量的阿霉素(未交联)相比，肿瘤治疗效果更高，并且由于使用剂量更低、具有缓释效果因而安全性更好。

(4)本发明制备方法获得的人血清白蛋白-阿霉素交联物为纳米颗粒，不仅因交联了hsa而改善了药物代谢特征，而且由于特定的交联剂和交联方法使得交联产物表现出ph响应特性。在正常体液的近中性ph条件下所述人血清白蛋白-阿霉素纳米颗粒保持稳定，而在肿瘤微环境的低ph值酸性条件下所述人血清白蛋白-阿霉素纳米颗粒能缓慢的释放活性dox分子，从而进一步强化了hsa-dox肿瘤特异性。

附图说明

通过阅读下文优选实施方式的详细描述，各种其他的优点和益处对于本领域普通技术人员将变得清楚明了。附图仅用于示出优选实施方式的目的，而并不认为是对本发明的限制。而且在整个附图中，用相同的参考符号表示相同的部件。在附图中：

图1：人血清白蛋白-阿霉素交联纳米颗粒粒径分布

图2：阿霉素吸光度和浓度标准曲线

图3：hsa-dox的肿瘤细胞定位

图4：hsa-dox选择性杀伤乳腺癌细胞

图5：hsa-dox体内肿瘤靶向性，7h、24h、48h的活体成像图，左边为对照组，右边为hsa-dox实验组

图6：hsa-dox靶向肿瘤的淋巴结转移

图7：小鼠动物实验luciferase成像图

图8：移植瘤小鼠肿瘤体积生长曲线

图9：移植瘤小鼠体重变化曲线

具体实施方式

下面将参照附图更详细地描述本公开的示例性实施方式。虽然附图中显示了本公开的示例性实施方式，然而应当理解，可以以各种形式实现本公开而不应被这里阐述的实施方式所限制。相反，提供这些实施方式是为了能够更透彻地理解本公开，并且能够将本公开的范围完整的传达给本领域的技术人员。

根据本发明的实施方式，提出以下实施例

实施例1、利用蛋白小分子交联技术将白蛋白与阿霉素进行交联

hsa-dox的制备方法

称取5mg白蛋白粉末，溶于10ml浓度为1mm的ph7.5的edta溶液，加入8μl的500mmspdp溶液。室温震荡反应2h，使spdp与白蛋白上的氨基进行反应，形成白蛋白与spdp的偶联产物。

反应后用millipore10kd超滤管进行超滤，除去未反应的游离spdp分子，并用edta溶液洗三次。将其溶于10ml浓度为1mmph7.5的edta溶液中，加入6mgdtt，室温震荡反应1h。

反应后用millipore10kd超滤管进行超滤，除去未反应的游离dtt分子，并用edta溶液洗三次，将反应产物溶于7ml浓度为1mmph7.5的edta溶液中。取15μl100mm的aldox(aldox购买自medchemexpress公司，casno.:1361644-26-9)溶液，加入3ml的dmso中并混匀。将3ml溶液缓慢加入7ml蛋白溶液中，并在加入过程中摇匀，室温振荡反应过夜。反应后用millipore10kd超滤管进行超滤，除去未反应的游离aldox分子，用去离子水洗三次后将产物置于-20℃保存。

hsa-dox的表征

对制备的hsa-dox进行表征，将hsa-dox溶液置于比色皿中，放入动态光散射仪器进行测定，结果如图1所示，证明hsa-dox是粒径为25nm左右的纳米颗粒(图1)。

将阿霉素稀释为不同的浓度，并通过酶标仪测定其吸光度，绘制吸光度和浓度的标准曲线(图2)。检测hsa-dox的吸光度为34923，通过回归曲线计算得到所制备的hsa-dox溶液中dox的浓度为67μm；同时，通过a280吸收测得hsa-dox中蛋白浓度为1.9mg/ml，计算得到hsa与dox的比例约为1:3。

将hsa-dox置于ph为7.5及5.5的pbs溶液中，室温放置3h后，通过超滤分离蛋白及游离的dox分子。将超滤后的蛋白溶液置于酶标仪中测量dox荧光强度，计算蛋白浓度及dox浓度得到，在ph7.5的条件下hsa与dox的比例依然为1:3，而在ph5.5的条件下hsa与dox的比例降低至1:0.5，证明hsa-dox在酸性环境下可以降解释放dox分子。

实施例2、白蛋白偶联阿霉素药物选择性杀伤肿瘤细胞

hsa-dox可以进入肿瘤细胞：将hsa-dox加入贴壁培养的mda-mb-231细胞培养基中，并以单独加入aldox为对照，在37℃培养箱中孵育4h，并用hoechst33342对细胞核进行染色5min。在共聚焦显微镜下可以观察到dox的荧光(红色)与hoechst的荧光(蓝色)产生共定位(图3)。与aldox对照组结果相似，hsa-dox证明hsa-dox在肿瘤细胞的酸性环境中释放dox，从而dox可以进入细胞核。

hsa-dox选择性杀伤肿瘤细胞：在肿瘤细胞(mda-mb-231)与正常细胞(hek293)中加入不同浓度的hsa-dox，使其中dox浓度为0.4、0.8、1.6μm。在37℃孵育24h后，用mtt对细胞活性进行测定(图4)。结果表明随着hsa-dox浓度增加，对于mda-mb-231细胞的杀伤能力有明显的提高，而对于hek293细胞没有明显的杀伤作用，因此可以证明hsa-dox具有选择性杀伤肿瘤细胞而不影响正常细胞的作用。

实施例3、动物模型效果验证

1、hsa-dox在体内的肿瘤靶向性：

在balb/c裸鼠的皮下注射3x10⁵转入luciferase荧光素酶的mda-md-231细胞。待肿瘤体积在5-10mm3时，尾静脉注射100μlcy5.5标记的hsa-dox，24h后在活体成像仪中对cy5.5及luciferase荧光进行成像(图5)。可以看到cy5.5与luciferase的荧光有明显的共定位，证明hsa-dox能够富集在肿瘤组织，具有很好的肿瘤靶向性。

2、hsa-dox靶向肿瘤的淋巴结转移：

在balb/c裸鼠的尾静脉注射5x105转入luciferase荧光素酶的mda-md-231细胞。培养两周后肿瘤细胞产生淋巴结转移，尾静脉注射100μlcy5.5标记的hsa-dox，24h后在活体成像仪中对裸鼠的大腿淋巴结进行cy5.5及luciferase荧光进行成像(图6)，并将裸鼠的上肢及下肢淋巴结取出进行荧光成像。其中，cy5.5与luciferase产生明显共定位，解剖出的四个淋巴结中两个发生了mda-mb-231肿瘤细胞转移，即有luciferase荧光的淋巴结中也同时有cy5.5的荧光，而未发生转移的淋巴结中无明显cy5.5荧光。证明hsa-dox不仅能够靶向肿瘤组织，还能靶向肿瘤的淋巴结转移。

3、hsa-dox对于肿瘤治疗的有效性和安全性：

选取4-6周裸鼠，皮下注射5x10⁵的含luciferase荧光素酶的mda-mb-231细胞。在肿瘤模型成瘤稳定，肿瘤体积为5-10mm3后，平均分为三组(对照组、dox组、hsa-dox组)。对照组、dox组合hsa-dox组分别每只尾静脉注射100μlpbs溶液、阿霉素溶液和hsa-dox溶液，使得dox浓度均为2mg/kg。每三天尾静脉给药一次，给药两周后对肿瘤进行luciferase成像(图7)。成像结果说明注射hsa-dox的小鼠肿瘤的荧光强度较低，即对肿瘤的生长有明显的抑制作用。同时，在治疗过程中对小鼠肿瘤的体积进行测量并计算(肿瘤长x宽2/2)，也记录小鼠体重数据，结果如图8、9所示。上述结果说明单独给药aldox对肿瘤的治疗效果不明显，而hsa-dox能够明显使肿瘤体积减小。并且，在给药过程中，小鼠体重并无明显变化，证明其具有很好的安全性。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。