本发明属于兽用疫苗
技术领域：
，涉及一种鸡传染性法氏囊病活疫苗耐热冻干保护剂及其制备方法。
背景技术：
：国内兽用生物制品行业不断发展，兽用疫苗的产量及质量都有了较大提升，与此同时，国内活疫苗所用耐热冻干保护剂研发与应用还比较落后，造成国内活疫苗保存条件严格，多数需在-15℃保存，与国外产品的2-8℃保存，还存在较大差距；常温条件下使用不当或使用时间长易造成抗原损失进而影响免疫效果，因此，开发兽用活疫苗耐热冻干保护剂具有很重要的应用前景。鸡传染性法氏囊病一种急性、接触性疾病，发病率高，常引起免疫缺陷，目前仍是我国养鸡业重要的传染病之一。使用鸡传染性法氏囊病活疫苗是预防该病的最主要手段，如上所述，该活疫苗也存在储藏条件严格等不足。耐热冻干保护剂的种类和配比是影响疫苗的质量和保存效果的重要因素。冻干保护剂可影响生物制品的质量、效价和稳定性，改变生物制品的生产工艺，提高产品预测能力并增大产品批次间的稳定性。因此，研制一种新的耐热冻干保护剂显得尤为迫切重要。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种鸡传染性法氏囊病活疫苗耐热冻干保护剂，延长鸡传染性法氏囊病活疫苗的保存期限，在2-8℃环境条件下在较长时间内避免疫苗活性成分的失效。本发明的另一目的在于提供一种鸡传染性法氏囊病活疫苗耐热冻干保护剂的制备方法。为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：一种鸡传染性法氏囊病活疫苗耐热冻干保护剂，由以下重量百分比的组分组成：脱脂奶粉8％～20％，海藻糖3％～6％，甘露醇0.3％～1％，甘氨酸0.3％～1％，l-半胱氨酸0.5％～2％，异vc钠0.1％～0.5％，柠檬酸0.08％～0.4％，柠檬酸三钠2.56％-2.82％，余量为注射用水。进一步地，由以下重量百分比的组分组成：脱脂奶粉12％，海藻糖4％，甘露醇0.5％，甘氨酸0.5％，l-半胱氨酸1％，异vc钠0.2％，柠檬酸0.15％，柠檬酸三钠2.73％，余量为注射用水。本发明还提供上述鸡传染性法氏囊病活疫苗耐热冻干保护剂的制备方法，包括以下步骤：a：用70％～80％的注射用水充分溶解脱脂奶粉和海藻糖，置于灭菌器，设定105℃灭菌30min，放置24h后，再次置于灭菌器，设定105℃灭菌30min，自然冷却后得混合物a；b：用10％～20％的注射用水充分溶解甘露醇、甘氨酸、l-半胱氨酸、异vc钠、柠檬酸和柠檬酸三钠，先用0.45μm滤膜粗滤，再用0.22μm滤膜过滤除菌得混合物b；c：将混合物a和混合物b混合并搅拌均匀，加入剩余的注射用水，即得耐热冻干保护剂。本发明中脱脂奶粉：对微生物起保护作用，能减少微生物暴露于氧气与介质中的面积，同时在微生物表面形成保护层；也具有促进升华形成耐热骨架，阻断热传导和热辐射的作用。海藻糖：提高微生物存活率，提高玻璃化转变温度，有效防止水对玻璃化态的增塑作用，防止活性物质组分发生变性，与生物制品活性组分的分子形成氢键而代替了原有水的位置起保护作用；且吸湿性较弱。甘露醇：防止组分随水蒸汽一起升华逸散，提供支持结构。甘氨酸：作为填充剂，能升高成品的塌陷温度，阻止因塌陷引起的蛋白质破坏。l-半胱氨酸：具有填充作用，还可以防止异vc钠氧化。异vc钠：防止冻干过程中的氧化作用。柠檬酸缓冲盐：将生物制品ph维持在最稳定范围内，防止蛋白变性而导致微生物失活。相比现有技术，本发明的有益效果在于：本发明的鸡传染性法氏囊病活疫苗耐热冻干保护剂，将脱脂奶粉、海藻糖、甘露醇、甘氨酸、l-半胱氨酸、异vc钠、柠檬酸和柠檬酸三钠进行复配，使鸡传染性法氏囊病活疫苗在2-8℃条件下可保存24个月，在冻干过程及保存过程中会保持外观形状、效力没有显著变化，在较长时间内避免了疫苗活性成分的失效，从而降低了运输、储存的成本。具体实施方式以下实施例用于说明本发明，但不用来限定本发明的保护范围。若未特别指明，实施例中所用技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。下述实施例中的试验方法，如无特别说明，均为常规方法。下述实施例中灭菌器为立式压力蒸汽灭菌器，型号为yxq-75sii，购自上海博讯实业有限公司医疗设备厂。实施例1一种鸡传染性法氏囊病活疫苗耐热冻干保护剂，由以下重量百分比的组分组成：脱脂奶粉8％，海藻糖3％，甘露醇0.3％，甘氨酸0.3％，l-半胱氨酸0.5％，异vc钠0.1％，柠檬酸0.08％，柠檬酸三钠2.56％，余量为注射用水。上述鸡传染性法氏囊病活疫苗耐热冻干保护剂的制备方法，包括以下步骤：a：用70％～80％的注射用水充分溶解脱脂奶粉和海藻糖，置于灭菌器，设定105℃灭菌30min，放置24h后，再次置于灭菌器，设定105℃灭菌30min，自然冷却后得混合物a；b：用10％～20％的注射用水充分溶解甘露醇、甘氨酸、l-半胱氨酸、异vc钠、柠檬酸和柠檬酸三钠，先用0.45μm滤膜粗滤，再用0.22μm滤膜过滤除菌得混合物b；c：将混合物a和混合物b混合并搅拌均匀，加入剩余的注射用水，即得耐热冻干保护剂。实施例2一种鸡传染性法氏囊病活疫苗耐热冻干保护剂，由以下重量百分比的组分组成：脱脂奶粉12％，海藻糖4％，甘露醇0.5％，甘氨酸0.5％，l-半胱氨酸1％，异vc钠0.2％，柠檬酸0.15％，柠檬酸三钠2.73％，余量为注射用水(10l)。上述鸡传染性法氏囊病活疫苗耐热冻干保护剂的制备方法，包括以下步骤：a：用3500ml注射用水充分溶解600g脱脂奶粉和200g海藻糖，置于灭菌器，设定105℃灭菌30min，放置24h后，再次置于灭菌器，设定105℃灭菌30min，自然冷却后得混合物a；b：用1500ml的注射用水充分溶解25g甘露醇、25g甘氨酸、50gl-半胱氨酸、10g异vc钠、7.5g柠檬酸和136.5柠檬酸三钠，先用0.45μm滤膜粗滤，再用0.22μm滤膜过滤除菌得混合物b；c：将混合物a和混合物b混合并搅拌均匀，加入5000ml剩余的注射用水，即得耐热冻干保护剂。实施例3一种鸡传染性法氏囊病活疫苗耐热冻干保护剂，由以下重量百分比的组分组成：脱脂奶粉20％，海藻糖6％，甘露醇1％，甘氨酸1％，l-半胱氨酸2％，异vc钠0.5％，柠檬酸0.4％，柠檬酸三钠2.82％，余量为注射用水。上述鸡传染性法氏囊病活疫苗耐热冻干保护剂的制备方法，包括以下步骤：a：用70％～80％的注射用水充分溶解脱脂奶粉和海藻糖，置于灭菌器，设定105℃灭菌30min，放置24h后，再次置于灭菌器，设定105℃灭菌30min，自然冷却后得混合物a；b：用10％～20％的注射用水充分溶解甘露醇、甘氨酸、l-半胱氨酸、异vc钠、柠檬酸和柠檬酸三钠，先用0.45μm滤膜粗滤，再用0.22μm滤膜过滤除菌得混合物b；c：将混合物a和混合物b混合并搅拌均匀，加入剩余的注射用水，即得耐热冻干保护剂。实施例4保护效力实验取实施例2制备的耐热冻干保护剂，与经检验合格的鸡传染性法氏囊抗原以1：1的体积比进行混匀，定量分装到装满西林瓶的冻干盘中，进行冻干，得到本发明耐热冻干保护剂冻干苗。冻干曲线：①预冻阶段：常温进箱，1h内将板层温度降至-43℃并维持3h；②升华干燥阶段：2h内将板层温度从-43℃升至-10℃并维持26h；③解析干燥阶段：2h内将板层温度从-10℃升至24℃并维持7h；④冻干结束，曲线全长约41h。选取5％蔗糖脱脂奶粉组成的常规冻干保护剂制备的常规保护剂疫苗作为对照。检测依据参照《中国兽药典》cvp3/2015/hym/005。将上述耐热保护剂冻干苗及常规冻干保护剂疫苗置于37℃恒温恒湿箱保存，分别在保存后0d，1d，3d，7d后做eld50检测，结果如表1所示。由表1结果可知，耐热冻干保护剂冻干苗在37℃加速7d后，保护剂效价下降0.9个滴度，但仍符合标准规定；而常规疫苗组对照3d后效价显著下降，已不符合标准要求。表137℃保存效价结果(eld50/羽份)天数本发明对照组0d10-4.7510-4.341d10-4.6810-3.923d10-4.3310-2.807d10-3.85--将上述耐热保护剂冻干苗及常规保护剂疫苗置于2-8℃保存，分别在保存后0月、2月、4月、6月、9月、12月、18月、24月作eld50检测，结果如表2所示。由表2可以看出，本发明耐热保护剂冻干苗在2-8℃环境中，病毒效价缓慢下降，在保存24个月后下降1个滴度，效价符合标准要求；而常规保护剂疫苗的效价在9个月时，已接近标准下线。表22-8℃保存效价结果(eld50/羽份)时间(月)本发明对照组010-4.7510-4.34210-4.7510-4.00410-4.6110-3.69610-4.4810-3.24910-4.3710-3.081210-4.25--1810-3.94--综上，本发明耐热冻干保护剂可在37℃保存疫苗7d，2-8℃保存24个月，效价仍符合标准要求，保存效价优于常规保护剂疫苗。实施例5鸡传染性法氏囊病耐热冻干保护剂活疫苗的检验疫苗检验：按照《中国兽药典》cvp3/2015/hym/005相关项目，对冻干疫苗进行检验。1)外观性状海绵状疏松团块，易与瓶壁脱离，加稀释液后迅速溶解。2)外源病毒检测2.1鸡胚检查法：经尿囊腔(as)和绒毛尿囊膜(cam)途径接种鸡胚各10枚，弃去接种后23小时内死亡的鸡胚，as组10/10存活，cam组10/10存活，胎儿发育正常，cam无病变，鸡胚液ha阴性。2.2细胞检查未出现细胞病变，未出现红细胞吸附现象；禽淋巴白血病病毒检验(elisa试验)阴性，禽网状内皮组织增生症病毒检验阴性3)鉴别检验置37℃孵育168小时，中和组5/5健活，对照组5/5死亡，鸡胚尿囊液对鸡红细胞凝集实验(ha)为阴性。4)安全检验用7～14日龄spf鸡20只，10只各点眼接种疫苗10羽份，另10只作对照，分别饲养，观察14日，全部健活。试验结束后，将免疫鸡和对照鸡全部扑杀剖检，法氏囊色泽、弹性无明显变化。5)效力检验每羽份病毒含量为104.75eld506)真空度测定呈紫色辉光7)剩余水分测定剩余水分分别为1.8％、1.9％、1.8％、1.9％，均不超过4％的标准要求。经上述检验，本发明制备的鸡传染性法氏囊病耐热冻干保护剂活疫苗，其外观形状，安全性及效力等符合《中国兽药典》cvp3/2015/hym/005中规定。以上所述之实施例，只是本发明的较佳实施例而已，仅仅用以解释本发明，并非限制本发明实施范围，对于本
技术领域：
的技术人员来说，当然可根据本说明书中所公开的技术内容，通过置换或改变的方式轻易做出其它的实施方式，故凡在本发明的原理上所作的变化和改进等，均应包括于本发明申请专利范围内。当前第1页12