本发明属于兽用生物制品技术领域，具体涉及一种鹅细小病毒和鸭2型腺病毒二联灭活疫苗。
背景技术：
腺病毒是家禽常见的传染性病原体。禽腺病毒分为三个群：ⅰ群是从鸡、火鸡、鹅和鸭的呼吸道感染分离出来的禽腺病毒，有共同的群特异性抗原，可分为a、b、c、d、e5个种和12个血清型；ⅱ群包括火鸡出血性肠炎病毒、雉大理石皮病病毒和鸡大脾病病毒；ⅲ群是从鸡产蛋综合征和鸭分离到的腺病毒。鸭2型腺病毒属于ⅰ群禽腺病毒，是1977年法国匈牙利人从患病番鸭上分离出来的，感染鸭主要表现精神沉郁，下痢，消瘦等症状。主要有传播方式决定的，即水平传播和垂直传播，病毒一旦带入鸭群很难清除。
鹅细小病毒病是由鹅细小病毒引起的一种急性传染病，主要侵害1～3周龄的雏鹅和雏番鸭，以发生渗出性肠炎为主要病理变化，发病急，死亡率高，传播快为特点。发病率和死亡率随着日龄的增加而下降，主要侵害7日龄以内的雏鹅和雏番鸭，死亡率可达100％，10日龄以上者死亡率一般不超过60％，20日龄以上的发病率低。根据发病情况分为3种类型，最急性型，急性型和亚急性型。1974年世界禽类学会为纪念derzs的先期工作而将此病命名为derzsy氏病。
近年来，我国养鸭业发展迅速，尤其是散养户较多，一些养鸭设施简陋，消毒意识淡薄及环境卫生不到位等原因，疾病流行情况复杂造成一些新的变异株及不同血清型毒株出现。在我国的一些省、市、自治区均有流行,南方地区的番鸭尤为突出，给番鸭养殖业造成严重的经济损失。
通过对两种病的流行病学调查，发现这两种病在我国番鸭群中发病率日益上升趋势。基于目前，国内外预防这两种病的商品化灭活疫苗免疫效果都不是很好，个别鸭场仍然出现发病现象，甚至出现死亡，可能与病毒的变异有关，需要筛选变异的病毒株来制备疫苗。另外，单苗的多针多剂量，给鸭群带来一些不必要的应激反应。研制安全有效的二联灭活疫苗迫在眉睫，必须通过创新技术克服这一问题。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种鹅细小病毒和鸭2型腺病毒二联灭活疫苗，能够有效预防鸭2型腺病毒和番鸭源鹅细小病毒病。
本发明提供的鹅细小病毒和鸭2型腺病毒二联疫苗，其中抗原为鸭2型腺病毒和鹅细小病毒，其中鹅细小病毒为gpv-fj株病毒；于2018年4月20日保藏在武汉大学的中国典型培养物保藏中心,保藏编号为cctccno:v201811。
作为实施例的具体记载，所述的鸭2型腺病毒为gd株病毒；于2016年6月5日保藏在武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctccno：v201633。
所述的疫苗为灭活疫苗。
上述的灭活疫苗，其中鸭2型腺病毒和番鸭源鹅细小病毒的灭活采用甲醛灭活，疫苗中鸭2型腺病毒的病毒含量≥106.5tcid50/0.1ml，番鸭源鹅细小病毒的病毒含量≥105.0eld50/0.2ml。
本发明的二联灭活疫苗的制备方法是将gd株病毒液中加入终浓度0.2％的甲醛，37℃搅拌灭活16小时，gpv-fj株病毒液中加入终浓度0.2％的甲醛，37℃搅拌灭活16小时，灭活检验后把两种抗原(gd株与gpv-fj株)按照体积比0.8∶1～1∶1混合，加入tween-80制备水相，溶解后的水相与白油佐剂1∶2混合乳化，得到鸭2型腺病毒和鹅细小病毒病二联灭活疫苗。
本发明制备的鸭2型腺病毒和鹅细小病毒病二联灭活疫苗安全性良好，未出现由疫苗引起的任何局部和全身不良反应。保存期试验中经过性状、安全性试验、效力试验数据的分析，各项指标均稳定有效；利用血清学方法和免疫攻毒法评估疫苗的免疫效果，结果显示，本发明中制备的二联灭活疫苗对鸭群能够提供有效的免疫保护，具有很好的商品化开发前景。
附图说明
图1为鹅细小病毒病毒gpv-fj株的pcr检测结果，其中，m为2000dnamarker、1为pcr扩增结果、2为阴性对照；
图2为鹅细小病毒病毒gpv-fj株的进化树图；
图3为鹅细小病毒病毒gpv-fj株的基因的同源性比较；
具体实施方式
发明人筛选了鸭2型腺病毒gd株和番鸭源鹅细小病毒gpv-fj株，这两株均是变异株，从而促成了本发明。
下面结合实施例对本发明进行详细的描述。
实施例1毒株的分离与鉴定
1.1gd株的分离与鉴定
1.1.1gd株的病毒分离2015年发明人成功从广东某养鸭场的番鸭群中分离出一株鸭2型腺病毒。取病番鸭的肝脏、脾脏、肾脏等的组织研磨，与无菌pbs匀浆，反复冻融3次后6000r/min离心10分钟，取上清液加入青链霉素，4℃过夜，经过滤无菌检验合格后保存备用。将含1％病毒过滤液接种番鸭胚成纤维细胞，无血清的m199培养液进行培养，37℃静置培养60～78小时，可出现明显的细胞病变，收集病毒液。
1.1.2病原学的鉴定将收集的病毒液经纯化进行了氯仿处理、血凝性鉴定、理化特性检验、病毒含量测定、免疫原性、特异性及纯净性等方面的病毒特性的分析检测。结果表明：该病毒不能凝集spf鸡和鸭红细胞，即使改变红细胞的浓度，也不能使之凝集。该病毒没有囊膜，对乙醚和氯仿有抵抗力，耐酸。而经氢氧化钠(ph＝10)和温度(50℃、1小时)处理后，接种细胞，无细胞病变，pcr检测阴性。表明分离毒株的核酸类型为dna，病毒不耐碱，对热敏感，60℃，1小时可被灭活。该毒株病毒含量为107.50tcid50/0.1ml。该病毒与gd株阳性血清中和组中和指数远高于流行株阳性血清，说明该病毒与gd株血清发生特异性中和反应且中和效价有差异。该病毒无细菌、支原体及外源病毒污染。
1.1.3分子生物学鉴定将分离到的病毒进行pcr检测、基因测序、同源性分析。经pcr检测和hexon基因测序，通过ncbiblast比对分析，分离株hexon基因与ⅰ群禽腺病毒属于同一分支，与genbank数据库中gr株(登录号：nc_024486.1)的核苷酸、氨基酸同源性分别为99.02％和99.70％。gd株与gr株的hexon所编码的氨基酸六个位点不同。gd株与genbank数据库中i群禽腺病毒的部分核苷酸同源性为31％～88％。
1.2gpv-fj株的分离与鉴定
1.2.1流行病学调查2017年5月，福建某番鸭场的8日龄番鸭群出现呼吸症状，即发病初期。番鸭场在1日龄时免疫商品化鸭肝炎二价抗体和鹅细小病毒灭活疫苗，8日龄出现脚软，个别鸭有出现死亡，使用抗菌素，没有好转，并且死亡率逐日增加。死亡鸭解剖发现渗出性肠炎、肠道内形成腊肠样栓子为主要的病理变化。全身脱水心肌充血，肝脏和脾脏肿大等。经实验室诊断为鹅细小病毒的变异株。
1.2.2病毒分离取患病白番鸭的脑、内脏、肠道等病变的组织50～100g，用研钵研磨组织，其间不断加入液氮，直至研磨成粉末状(无明显的可见颗粒)，按1∶5(w/v)比例与无菌pbs匀浆，反复冻融3次后6000r/min离心10分钟，取上清液加入青霉素和链霉素各10000iu/ml，4℃过夜，经0.22μm微孔滤器过滤，无菌检验合格后保存备用。
1.2.3病毒的鉴定将收集的病毒液经纯化进行了氯仿处理、血凝性鉴定、理化特性检验、病毒含量测定、免疫原性、特异性及纯净性等方面的病毒特性的分析检测。病毒继代发现培养特性比较稳定，死亡番鸭胚可见胚体头部、颈部及绒毛尿囊膜有明显水肿，全身有出血，变化特征明显。收集48h～144小时尿囊液离心、过滤作为抗原。该病毒无血凝活性，不能凝集spf鸡和鸭红细胞，即使改变红细胞的浓度，也不能使之凝集。对乙醚、氯仿、胰酶有抵抗力，耐酸(ph＝3.0)。65℃加热30分钟、56℃3小时对其毒力无明显变化，而其对紫外线照射敏感。该病毒的病毒含量为106.2eld50/0.2ml，本发明筛选的毒株作为抗原制备的阳性血清对本发明筛选的病毒的中和能力明显好于流行毒株制备的阳性血清；而对于该毒株的中和效果相比于流行株的中和效果有明显的差异。该病毒无细菌、支原体及外源病毒污染。该毒株制成灭活疫苗免疫雏番鸭和成年母番鸭，免疫1日龄雏番鸭，2周抗体可达到100％以上的阳性率，免疫期可达5个月；已达到或超过番鸭出栏日龄；免疫成年母番鸭2月龄所产子代均能够产生完全的攻毒保护，说明该毒株是一种理想的抗原。
1.2.4鹅细小病毒病毒gpv-fj株的pcr检测结果通过ncbi已经公布的鹅细小病毒基因序列，(结构基因vp)全长为2199bp，编码732个氨基酸，设计一对引物涵盖vp基因全长，上游引物p1：5’-caataaagatgactcaaagcagata-3’，下游引物p2：5’-cacagaatttacagattttgagtt-3’。取番鸭胚病毒尿囊液，利用组织细胞基因组dna快速提取试剂盒提取病毒dna，进行pcr检测，1％琼脂糖凝胶电泳约在2216bp处出现了dna条带(图1)。
1.2.5鹅细小病毒病毒gpv-fj株的测序结果对该病毒vp基因扩增的片段进行测序、拼接后，通过ncbi已经公布基因序列进行比对分析，gpv-fj株的vp基因与已公开的gpv的vp基因的序列同源性介于90.1％～99.4％之间。通过基因进化树分析可以看出，gpv-fj株与安徽株wx1、yan-2、wx2、zj关系较近。与国内疫苗株syg61v、syg26-35和gdagpv较远，属于新的流行株。基因进化树与同源性分析见图2、3。
1.2.6病毒特异性与中和效果检验该毒株和番鸭源流行毒株经继代和纯化制成灭活疫苗，分别免疫兔子，免疫剂量1.0ml/只，每隔2周免疫一次，共免疫3次，三免后2周进行采血,分离血清，经56℃灭活1小时进行特异性试验。
将gpv-fj株病毒液250倍稀释，分别与该毒株和流行株的阳性血清等体积混合，室温中和1小时后，接种12日龄的番鸭胚，0.2ml/枚，接种后观察168小时。结果发现该病毒的鹅细小病毒血清中和组番鸭胚全部健活，其他流行株的阳性血清中和组组仅60％～70％全部健活，未加血清中和的病毒组番鸭胚全部死亡，说明该病毒与鹅细小病毒血清发生特异性中和反应。本发明筛选的毒株作为抗原制备的阳性血清对本发明筛选的病毒的中和能力明显好于流行毒株制备的阳性血清；而对于该毒株的中和效果相比于流行株的中和效果有明显的差异。
上述的结果表明本发明获得两个毒株均为新的变异株，从而导致已有的疫苗的免疫效果降低。
实施例2疫苗制造及半成品检验
2.1毒种制备
2.1.1gd株的毒种制备挑选已长满单层的番鸭胚成纤维细胞，弃掉原培养液，加入终浓度1％毒种(gd株原始毒种第3代)无血清的m199维持液，37℃静置培养60～78小时，可出现明显的细胞病变，当细胞病变达80％以上时收获。按此方法连传10代，分别标记为c3～c10代。测定每代次病毒含量。将同代次检验无菌且病毒含量≥106.0tcid50/0.1ml病毒液混合，定量分装，冻干保存。
2.1.2gpv-fj株的毒种制备将尿囊液(gpv-fj株原始毒种第3代)用灭菌pbs作500倍稀释，经尿囊腔接种12日龄的番鸭胚10枚，每胚0.2ml，置36～38℃继续孵育，选择接种后48～144小时内死亡的鸭胚。收集尿囊液离心，取其上清进行传下一代。按此方法连传10代，分别标记为c3～c10代。测定每代次病毒含量。将同代次检验无菌且病毒含量≥105.0eld50/0.2ml病毒液，定量分装，冻干保存。
2.2抗原的制备
2.2.1gd株抗原的制备
2.2.1.1材料选择鸭胚成纤维细胞、gd株病毒液的制备。
2.2.1.2细胞制备取11～13日龄的番鸭胚，用0.25％胰酶进行消化，加入适量含10％血清的m199培养液进行培养。
2.2.1.3接毒挑选已长满单层的番鸭胚成纤维细胞，弃掉原培养液，加入终浓度为1％毒种的维持液，置37℃培养箱继续培养。
2.2.1.4收获接毒后，每日观察2次，记录细胞病变情况。当细胞病变达80％以上时收获，冻融2次，收获的细胞毒灭活前在-20℃保存。
2.2.2gpv-fj株抗原的制备
将毒种用无菌生理盐水稀释500倍，尿囊腔接种12日龄易感番鸭胚，每胚0.2ml，37℃孵育，收集48～144小时内鸭胚的尿囊液，经离心，取其上清混合于灭菌的容器中，于2～8℃保存。
2.3病毒含量测定
2.3.1gd株病毒含量测定将毒种用细胞维持液进行10倍系列稀释，取10﹣6、10﹣7、10﹣83个稀释度，分别接种于已长满单层的鸭胚成纤维细胞(96孔细胞板)，每个稀释度接种6孔，每孔0.1ml。同时设病毒阳性对照孔和细胞阴性对照孔，37℃培养、5％co2培养箱培养和观察168小时，出现cpe者判为感染，计算tcid50。
2.3.2gpv-fj株病毒含量测定将gpv-fj株病毒液分别用灭菌pbs作10倍系列稀释，取10﹣5、10﹣6、10﹣73个稀释度，分别经尿囊腔接种12日龄的番鸭胚，每胚0.2ml，同时设接种pbs对照5枚，每胚0.2ml。置37℃继续孵育，观察168小时。以鸭胚48小时后死亡并出现尿囊膜增厚，以胚体全身出血性病变、胚体发育缓慢等特征判为感染，计算gpv-fj株的eld50。
2.4灭活将两种抗原(gd株与gpv-fj株)按照体积比0.8∶1～1∶1混合，分别导入灭活罐内，计量加入10％甲醛溶液，开启搅拌机搅拌，使其充分混合，甲醛的最终浓度为0.2％。加甲醛溶液后导入另一灭活罐中，以避免罐口附近粘附的病毒未能接触灭活剂。37℃灭活16小时(以罐内温度达到37℃开始计时，开启搅拌机连续搅拌)后取出，放2～8℃保存，应不超过1个月。
2.5半成品检验
2.5.1无菌检验取灭活的病毒液，按现行《中国兽药典》附录进行检验，应无菌生长。
2.5.2灭活检验
2.5.2.1gd株灭活检验将灭活后的gd株病毒液作10倍稀释，接种已长满单层的鸭胚成纤维细胞(24孔细胞板)4孔，每孔0.1ml，补充维持液至2.0ml；同时设未接种灭活的病毒液作阴性对照，接种未灭活的病毒液作阳性对照，37℃、5％co2培养箱培养，观察168小时。将培养物收获反复冻融后盲传一代，继续培养120小时。观察是否出现cpe。
2.5.2.2gpv-fj株灭活检验将灭活后的gpv-fj株病毒液经尿囊腔接种12日龄的番鸭胚10枚，每胚0.2ml，置37℃继续孵育，连续观察168小时。
2.6油乳剂灭活疫苗的制备
2.6.1油相制备：
取矿物油94份，硬脂酸铝2份(g)，边加边搅拌，直到完全透明为止，再加入司班-80(span-80)6份(ml)，充分混匀后，121℃高压蒸气灭菌备用。
2.6.2水相制备：
将灭活检验合格的病毒液混合，取其96份(ml)加入4份(ml)灭菌吐温-80(tween-80)，充分振摇，直到tween-80彻底溶解。
2.6.3乳化
取油相2份导入乳化罐中，开动电机低速搅拌，同时徐徐加入水相1份后，1000r/min，乳化30分钟，即成油乳剂灭活疫苗。
2.6.4分装定量分装，加盖密封，并粘贴标签，置2～8℃保存。
实施例3疫苗成品检验
3.1性状
外观乳白色乳剂。
剂型油包水型。取一清洁吸管，吸取少量疫苗滴入冷水中，除第1滴外，均应不扩散。
稳定性吸取疫苗10ml加入离心管中，以3000r/min离心15分钟，管底析出的水相应不多于0.5ml。
黏度按现行《中国兽药典》附录进行，应符合规定。
3.2装量检查按现行《中国兽药典》附录进行检查，应符合规定。
3.3无菌检验按现行《中国兽药典》附录进行检验，应无菌生长。
3.4安全检验为了保证疫苗的安全性，用1日龄健康易感雏番鸭10只，颈部皮下注射5只，胸部肌肉注射5只，每只均为1.0ml。免后14日，生长发育均正常，精神状态良好，剖检注射部位疫苗吸收良好，全部存活。
3.5效力检验
3.5.1血清学方法选用1日龄雏番鸭30只，颈部皮下免疫10只，胸部肌肉免疫10只，共20只，每只0.2ml，另10只不免疫作对照。免疫后21～28日，每只鸭分别采血，分离血清，用琼脂免疫扩散试验检测免疫组和对照组的番鸭血清，gd株免疫组应至少8只阳性，对照组应全部阴性。gpv-fj株免疫组应至少10只阳性，对照组应全部阴性。
血清结果：gd株通过颈部皮下和胸部肌肉免疫在21日以上琼脂扩散试验抗体均≥8/10阳性，对照组鸭全部为阴性；gpv-fj株通过颈部皮下和胸部肌肉免疫在14日以上琼扩抗体均≥8/10阳性，对照组鸭全部为阴性；试验均符合效检标准。免疫期可达5个月以上；已达到或超过番鸭出栏日龄。详见表1。
表1：1日龄雏番鸭免疫二联疫苗后不同时间抗体水平
3.5.2番鸭源流行株疫苗免疫与本发明毒株攻毒保护效果选用1日龄雏番鸭60只，各选取一株中和效价和病毒含量较高的鸭2型腺病毒流行株和鹅细小病毒流行株，制备二联灭活疫苗，制备方法同本发明。每种苗颈部皮下免疫10只，共40只，每只0.2ml，另20只不免疫作对照。免疫后14日，进行攻毒试验。所有免疫组和对照组雏番鸭肌肉注射gd株病毒液(约含106.0tcid50/0.1ml)和gpv-fj株病毒液(约含105.0eld50/0.2ml)，每只0.2ml。攻毒后，连续观察14日，每日观察鸭的临床表现，记录发病和死亡情况。
疫苗免疫与gd株、gpv-fj株攻毒保护结果：本发明疫苗免疫后14日保护数均100％保护，而流行株的免疫后14日保护数均低于80％；对照组用本发明制苗的毒株攻毒14日内全部发病，即发病率100％，死亡率达90％以上。说明本发明制备的疫苗免疫效果最好。具体数据详见下表2。
表2：1日龄雏番鸭流行株疫苗免疫与发明毒株攻毒保护结果
3.5.3子代母源抗体与攻毒保护的关系取成年健康母番鸭30只，每只颈部皮下免疫0.5ml，30只不免疫作为对照。
免后2月龄所产的蛋，经孵化出雏番鸭，取免疫组20只雏番鸭，取对照组20只雏番鸭，于饲养进行攻毒试验。免疫组和对照组雏番鸭分别肌肉注射gd株病毒液(约含106.0tcid50/0.1ml)、gpv-fj株病毒液(约含105.0eld50/0.1ml)和流行株病毒液，每只0.2ml。攻毒后，每日观察鸭的临床表现，记录发病和死亡情况，连续观察14日。效检标准：gd株免疫鸭应至少8只正常，对照组应至少8只发病。gpv-fj株免疫鸭应至少8只正常，对照组应至少8只发病。
子代母源抗体与攻毒保护的结果：二联苗免疫成年母番鸭2月龄所产子代在7日龄时测定的琼扩抗体均100％阳性。对照组全部为阴性。子代7日龄雏番鸭攻制备疫苗用的毒株和流行毒株，其中流行株选择具有代表性的4株。连续观察14日，免疫组保护数均达到90％；对照组用制苗毒株攻毒14日内全部发病，死亡率达90％以上。对照组用流行毒株攻毒14日内保护数均低于20％。交叉保护率高。说明本发明制备的疫苗能有效的预防目前各地流行的鸭2型腺病毒和鹅细小病毒的感染，且具有良好的免疫效果。具体数据详见下表3、4。
表3：子代7日龄雏番鸭的母源抗体及攻毒保护试验
表4：子代7日龄雏番鸭的母源抗体与流行株的交叉保护试验
综上所述，本发明筛选的gd株、gpv-fj株两个毒株制备疫苗是一种免疫效果比较理想的二联灭活疫苗，能够有效的预防ⅰ群鸭2型腺病毒病和鹅细小病毒的发生。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，其他的任何未背离本发明精神和原则之内，所做的改变、修饰、替代、组合等，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。