重组减毒李斯特菌在制备间皮素高表达癌症治疗性疫苗中的应用的制作方法

文档序号：15775672发布日期：2018-10-30 15:13阅读：303来源：国知局

本发明属于生物技术领域，涉及基于重组减毒李斯特菌在制备间皮素高表达癌症治疗性

疫苗中的应用。

背景技术：

研究发现间皮素是一种细胞表面糖蛋白，其表达通常局限于间皮(腹膜，心包，和胸膜)，同时发现在间皮瘤、胰腺癌、肺癌、卵巢癌中，间皮素蛋白显著高表达。(mesothelinanewtargetforimmunotherapy，raffithassan，tapanbera，andirapastandoi:10.1158/1078-0432.ccr-03-0801clincancerresjune15,200410；3937)这种特征使得间皮素成为运用重组李斯特菌治疗肿瘤的工具抗原。

间皮瘤是一种主要出现在胸腔或腹腔内壁上的肿瘤，与工作环境中接触石棉纤维有关。在美国每年被诊断的患者是2500～3000个。目前手术和放疗效果都不理想，化疗效果较好。

胰腺癌是出现在胰脏且非常致命的癌症，患者5年内的存活率小于5％，根据世界卫生组织2014年数据，2012年胰腺癌在全球造成33万人死亡，是癌症患者的7种最常见的致死因素。且胰腺癌初期没有明显症状，发现症状后通常是疾病的晚期，绝大多数病人在发现时已经是局部侵袭性疾病或已发生转移，这时候在通过手术治疗只能是缓解症状而无法治愈患者。目前通过每周静脉给药的吉西他滨(美国fda在1997年批准上市)只能改善患者生活质量，稍微延长患者生存时间。使用folfirinox化疗方案(5-氟尿嘧啶，亚叶酸钙，伊立替康，和奥沙利铂)则副反应明显，只能用于非常有限的患者。

卵巢癌是指出现在女性卵巢的癌症，2012年全球有23万患者并且造成15万人死亡。是7种常见癌症，并且是造成女性癌症患者死亡的常见原因。目前手术和化疗结合是治疗卵巢癌的常见方法。

肺癌是一种发生在肺组织内，细胞失去控制生长的非常致命的疾病。肺癌如不及时接受治疗，很容易转移到附近组织和机体其他器官。肺癌是癌症患者最主要的死亡原因，2012年造成全球156万人口死亡，患者5年内的存活率小于17％。目前手术，放疗和化疗协同治疗是对抗肺癌的常见方法。

治疗性疫苗与传统的治疗手段，如外科手术，放化疗相比具有伤害小，毒性低的特点。目前治疗性疫苗的存在形式主要有三种：蛋白质多肽疫苗、病毒(细菌)疫苗以及核酸疫苗。其成功的关键是引起足够的免疫应答，但是目前的核酸类及蛋白质多肽类疫苗免疫原性较低，缺陷明显。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明的目的在于提供重组减毒李斯特菌在制备间皮素高表达癌症治疗性疫苗中的应用。

为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

重组减毒李斯特菌在制备间皮素高表达癌症治疗性疫苗中的应用，所述重组减毒李斯特菌为重组减毒单增李斯特菌或重组减毒绵羊李斯特菌，两者分别以减毒单增李斯特菌(listeriamonocytogenes，在下文中简称lm)或减毒绵羊李斯特菌(listeriaivanovii，在下文中简称li)作为载体，携带间皮素基因而得。

优选的，所述减毒单增李斯特菌为单增李斯特菌完整敲除acta和plcb这两个毒力基因而得。

优选的，所述减毒绵羊李斯特菌为绵羊李斯特菌完整敲除acta和plcb这两个毒力基因而得。

优选的，所述疫苗的初免-加强给药应使用不同的重组减毒李斯特菌。

进一步优选的，用于初免的疫苗有效成分为重组减毒单增李斯特菌，用于加强的疫苗有效成分为重组减毒绵羊李斯特菌或重组减毒单增李斯特菌。

优选的，所述疫苗的给药方式为首次注射和至少两次加强注射，重组减毒单增李斯特菌与重组减毒绵羊李斯特菌依次交替注射。加强注射的次数根据患者需要确定。

优选的，所述重组减毒单增李斯特菌的制备方法如下：

(1)合成间皮素基因片段；

(2)构建打靶质粒；

(3)制备感受态细胞lmδactaplcb-lacz；

(4)利用步骤(2)制备的打靶质粒对步骤(3)制备的感受态细胞进行电转化；

(5)lmδactaplcb-lacz与打靶质粒同源重组杂交培养、筛选验证。

更进一步优选的，步骤(1)的具体方法是：从ncbi上查询间皮素氨基酸序列，然后根据李斯特菌偏好密码子表进行密码子优化得到优化后的序列，再在其上游加入hindⅲ酶切位点(aagctt)，下游加入xhoⅰ酶切位点(ctcgag)，将上述设计好的序列最后通过合成直接获得。其中，密码子优化方法是将氨基酸序列提交到网站(如http://www.jcat.de/)，然后选择单增李斯特菌偏好密码子优化选项即可实现；dna序列的合成方法是：使用abi3900-thermofisherscientific等型号的基因合成仪直接合成dna序列，如seqidno.1所示。

更进一步优选的，步骤(2)的具体方法是：用限制性内切酶hindⅲ和xhoⅰ双酶切步骤(1)获得的间皮素基因片段，同时用相同的限制性内切酶酶切质粒pcw203(专利cn103074361b)，经连接、转化等技术将间皮素基因片段插入pcw203hindⅲ和xhoⅰ酶切位点，得到中间质粒pcw203-meso，如seqidno.2所示，通过pcr验证、提质粒验证、酶切验证证实中间质粒的成功构建。切下中间质粒pcw203-meso的bamhi酶切位点与xhoi酶切位点之间的片段插入重组质粒pcw180的bamhi酶切位点与xhoi酶切位点之间，得到打靶质粒pcw180-meso；其中，所述重组质粒pcw180的基因序列为序列表中seqidno.3所示。

更进一步优选的，重组质粒pcw180的制备方法如下：

(2-a)将上游携带speⅰ、下游携带notⅰ的lmmpl基因(genbankid：dq054595.1)插入质粒pcw154(专利cn103074361b)的speⅰ和notⅰ酶切位点之间，得到第一中间重组质粒pcw160，所述第一中间重组质粒pcw160的基因序列为序列表中seqidno.4所示；

(2-b)将上游携带xbaⅰ、下游携带notⅰ的lmorfbaldh基因(genbankid：m82881.1)插入上述步骤(2-a)得到的第一中间重组质粒pcw160的xbaⅰ和notⅰ酶切位点之间，得到第二中间重组质粒pcw170，所述第二中间重组质粒pcw170的基因序列为序列表中seqidno.5所示；

(2-c)用notⅰ酶切质粒pcw154，得到两头为notⅰ酶切位点的一段基因，插入上述步骤(2-b)得到的第二中间重组质粒pcw170的notⅰ酶切位点，得到重组质粒pcw180。

进一步优选的，步骤(3)的具体方法是：将lmδactaplcb-lacz利用含0.5mol/l蔗糖的bhi液体培养基进行培养，定期测定a600，当a600＝0.4时，加入盘尼西林g，使其终浓度为12.5μg/ml继续培养；当a600＝0.7时，离心，洗涤，分装，保存即可。

更进一步优选的，lmδactaplcb-lacz的制备方法如下：

(3-a)将上、下游分别带noti酶切位点的lacz基因片段(专利cn103074361b)插入第二中间重组质粒pcw170的noti酶切位点之间，得到一个打靶质粒pcw190，所述质粒pcw190的基因序列为序列表中seqidno.6所示；

(3-b)将步骤(3-a)所得打靶质粒pcw190电转化lm，然后将转化得到的菌经单、双同源重组杂交培养，即得。

更进一步优选的，步骤(3)的具体方法是：接种lmδactaplcb-lacz于15ml含0.5mol/l蔗糖的bhi液体培养基，37℃220rpm培养12～16小时；将上述菌液转移至250ml含0.5mol/l蔗糖的bhi液体培养基，定期测定a600，当a600＝0.4时，加入盘尼西林g，使其终浓度为12.5μg/ml继续培养；当a600＝0.7时，倒入50ml离心管，4℃10000rpm离心5分钟，弃上清；以0.5mol/l冰冷蔗糖溶液反复洗涤沉淀，每次加入20ml0.5mol/l蔗糖溶液，4℃10000rpm离心10分钟，弃上清，洗涤3次；每管加0.5mol/l蔗糖的300μl重悬，按50μl/支分装预冷无菌ep管，-80℃保存。

进一步优选的，步骤(4)的具体方法是：取打靶质粒电转至lmδactaplcb-lacz感受态细胞中，电转完成后加入bhi肉汤培养2小时；转化液涂布于红霉素bhi琼脂平板，通过蓝白斑筛选出单个蓝色菌落，纯培养后进行质粒提取和pcr验证。

更进一步优选的，步骤(4)的具体方法是：将制备的感受态细胞从-80℃冰箱中取出置于冰盒中，待其完全融化后，取5μl打靶质粒按1/10的比例用-20℃预冷枪头缓慢加至感受态细胞lmδactaplcb-lacz，同时作ddh2o阴性对照；温和混匀后，冰浴5分钟，再全部转入电转杯，冰浴5分钟，于电转仪中进行电转；电转完成后，冰浴5分钟，用37℃预热的枪头加入37℃预热的bhi肉汤750μl，混匀后全部转至ep管，摇床30℃，150rpm培养2小时；用无菌l形玻棒将菌液全量涂布于含红霉素1～5μg/ml、x-gal20～60μg/ml的bhi琼脂平板(以下简称bhi-ery-x-gal，bexi平板)，30℃培养48～72小时后，阳性菌为蓝色菌落，于bexi平板上进行纯培养，30℃培养24小时，进行提质粒及pcr验证。

更进一步优选的，电转条件为：电压＝1500v，持续时间＝5ms，电转杯内径＝1mm。

更进一步优选的，提质粒的具体方法是：按照质粒提取试剂盒说明提取质粒(李斯特菌为革兰阳性菌，solutionⅰ使用前需加入溶菌酶，溶菌酶终浓度为20mg/l，加入含溶菌酶的solutionⅰ后重悬细菌，37℃水浴45min)，最后以30μlelutionbuffer洗脱后电泳；凝胶成像，观察有无条带以判断重组质粒导入是否成功，质粒大小为10455bp。

更进一步优选的，pcr验证的具体方法是：以煮沸法提取的细菌dna基因组为模板，扩增目的条带间皮素，以seqidno.7和seqidno.8所示序列为引物进行pcr扩增；反应循环条件为：94℃3分钟→(94℃1分钟，47℃30秒，72℃1分钟)×30个循环→72℃10分钟→4℃；电泳观察pcr结果，预期结果：间皮素片段约1781bp。

上游引物meso-f：5’-ccacaagctttgtcccgtacacttg-3’，如seqidno.7所示；

下游引物meso-r：5’-tatactcgagagcaagtgtagaagc-3’，如seqidno.8所示；

更进一步优选的，电泳条件为：1％琼脂糖凝胶；90v，上样量：5μlpcr产物。

进一步优选的，步骤(5)的具体方法是：将携带打靶质粒的单增李斯特菌，在42℃和30℃连续传代，利用同源重组杂交原理和基因打靶技术，将打靶质粒携带的目的片段整合至李斯特菌中，利用蓝白斑及红霉素敏感性筛选出可疑菌株；然后进行pcr筛选和基因测序验证。

更进一步优选的，传代培养的具体方法是：将已电转入打靶质粒的lmδactaplcb-lacz划线接种bexi平板，42℃传代培养，挑取单个蓝色菌落接种bhi肉汤，30℃传代培养，待传到肉汤第3代开始，每代取培养物加入bhi稀释，分别涂布稀释菌液100μl于bexi和bxi(含x-gal20～60μg/ml的bhi琼脂平板)平板，30℃培养24小时。

更进一步优选的，传代培养的具体方法是：将已电转入打靶质粒的lmδactaplcb-lacz划线接种bexi平板，42℃传代培养2～3代(每代培养时间为48小时)，挑取单个蓝色菌落接种5mlbhi肉汤，30℃，200rpm传代培养6代(每代培养时间为24小时)；待传到肉汤第3代开始，每代取40μl培养物加入360μlbhi肉汤(1:10稀释)，多次连续1:10稀释直到稀释10⁶倍，分别涂布10⁶倍稀释的菌液100μl于bexi和bxi平板，30℃培养24小时；阳性菌落lmδactaplcb-meso在bxi平板上长成白色菌落，在bexi平板上不生长。

更进一步优选的，pcr筛选的具体方法是：对蓝白斑及红霉素筛选结果正确的上述可疑重组菌进行以下三组基因片段的扩增：抗红霉素基因、靶抗原基因间皮素以及acta基因，鉴定相应疫苗菌株。

更进一步优选的，pcr筛选的具体方法是：用细菌基因组提取试剂盒提取lmδactaplcb-meso的基因组dna作为模板，进行以下三组基因片段的扩增：抗红霉素基因、靶抗原基因间皮素以及acta基因，根据扩增结果对重组菌lmδactaplcb-meso进行鉴定。

更进一步优选的，抗红霉素基因ery以seqidno.9和seqidno.10所示序列为引物进行pcr扩增；反应循环条件为：94℃3分钟→(94℃1分钟，60℃30s，72℃2分钟)×30个循环→72℃10分钟→4℃；电泳观察pcr结果，预期结果：ery基因片段约1471bp。

上游引物ery-f：5’-gataagtcgacgattcacaaaaaatag-3’，如seqidno.9所示；

下游引物ery-r：5’-aaaactagtcccggggcgaattg-3’，如seqidno.10所示。

更进一步优选的，lmacta基因以seqidno.11和seqidno.12所示序列为引物进行pcr扩增；反应循环条件为：94℃3分钟→(94℃1分钟，50℃30s，72℃1分钟)×30个循环→72℃10分钟→4℃；电泳观察pcr结果，预期结果：lmacta基因片段约950bp。

上游引物lm-acta-f：5’-gctataaatgaagaggcttcagg-3’，如seqidno.11所示；

下游引物lm-acta-r：5’-ctcttaaatcagctaggcgatc-3’，如seqidno.12所示。

更进一步优选的，基因测序验证的具体方法是：经pcr鉴定正确的相应疫苗菌株，以基因组dna作为模板，pcr扩增靶抗原基因间皮素，对扩增产物测序验证，对测序正确的菌株进行菌种保存。

优选的，重组减毒绵羊李斯特菌的制备方法如下：

(1)合成间皮素基因片段；

(2)构建打靶质粒；

(3)制备感受态细胞liδactaplcb-lacz；

(4)利用步骤(2)制备的打靶质粒对步骤(3)制备的感受态细胞进行电转化；

(5)liδactaplcb-lacz与打靶质粒同源重组杂交培养、筛选验证。

更进一步优选的，步骤(1)的具体方法是：从ncbi上查询间皮素氨基酸序列，然后根据李斯特菌偏好密码子表进行密码子优化得到优化后的序列，再在其上游加入hindⅲ酶切位点(aagctt)，下游加入xhoⅰ酶切位点(ctcgag)，将上述设计好的序列最后通过合成直接获得。其中，密码子优化方法是将氨基酸序列提交到网站(如http://www.jcat.de/)，然后选择绵羊李斯特菌偏好密码子优化选项即可实现；dna序列的合成方法是：使用abi3900-thermofisherscientific等型号的基因合成仪直接合成dna序列，如seqidno.1所示。

更进一步优选的，步骤(2)的具体方法是：

用限制性内切酶hindⅲ和xhoⅰ双酶切步骤(1)获得的间皮素基因片段，同时用相同的限制性内切酶酶切质粒pcw203(专利cn103074361b)，经连接、转化等技术将间皮素基因片段插入pcw203hindⅲ和xhoⅰ酶切位点，得到中间质粒pcw203-meso，如seqidno.2所示，通过pcr验证、提质粒验证、酶切验证证实中间质粒的成功构建。切下中间质粒pcw203-meso的bamhi酶切位点与xhoi酶切位点之间的片段插入重组质粒pcw154(专利cn103074361b)的bamhi酶切位点与xhoi酶切位点之间，得到打靶质粒pcw154-meso，如seqidno.13所示。

更进一步优选的，步骤(3)的具体方法是：将liδactaplcb-lacz(专利cn103074361b)利用含0.5mol/l蔗糖的bhi液体培养基进行培养，定期测定a600，当a600＝0.4时，加入盘尼西林g，使其终浓度为12.5μg/ml继续培养；当a600＝0.7时，离心，洗涤，分装，保存即可。

更进一步优选的，步骤(3)的具体方法是：接种liδactaplcb-lacz(专利cn103074361b)于15ml含0.5mol/l蔗糖的bhi液体培养基，37℃220rpm培养12～16小时；将上述菌液转移至250ml含0.5mol/l蔗糖的bhi液体培养基，定期测定a600，当a600＝0.4时，加入盘尼西林g，使其终浓度为12.5μg/ml继续培养；当a600＝0.7时，倒入50ml离心管，4℃10000rpm离心5分钟，弃上清；以0.5mol/l冰冷蔗糖溶液反复洗涤沉淀，每次加入20ml0.5mol/l蔗糖溶液，4℃10000rpm离心10分钟，弃上清，洗涤3次；每管加0.5mol/l蔗糖的300μl重悬，按50μl/支分装预冷无菌ep管，-80℃保存。

进一步优选的，步骤(4)的具体方法是：取打靶质粒电转至liδactaplcb-lacz感受态细胞中，电转完成后加入bhi肉汤培养2小时；转化液涂布于红霉素bhi琼脂平板，通过蓝白斑筛选出单个蓝色菌落，纯培养后进行质粒提取和pcr验证。

更进一步优选的，步骤(4)的具体方法是：将制备的感受态细胞从-80℃冰箱中取出置于冰盒中，待其完全融化后，取5μl打靶质粒按1/10的比例用-20℃预冷枪头缓慢加至感受态细胞liδactaplcb-lacz，同时作ddh2o阴性对照；温和混匀后，冰浴5分钟，再全部转入电转杯，冰浴5分钟，于电转仪中进行电转；电转完成后，冰浴5分钟，用37℃预热的枪头加入37℃预热的bhi肉汤750μl，混匀后全部转至ep管，摇床30℃，150rpm培养2小时；用无菌l形玻棒将菌液全量涂布于含红霉素1～5μg/ml、x-gal20～60μg/ml的bhi琼脂平板(以下简称bhi-ery-x-gal，bexi平板)，30℃培养48～72小时后，阳性菌为蓝色菌落，于bexi平板上进行纯培养，30℃培养24小时，进行提质粒及pcr验证。

更进一步优选的，电转条件为：电压＝1500v，持续时间＝5ms，电转杯内径＝1mm。

上游引物meso-f：5’-ccacaagctttgtcccgtacacttg-3’，如seqidno.7所示；

下游引物meso-r：5’-tatactcgagagcaagtgtagaagc-3’，如seqidno.8所示；

更进一步优选的，电泳条件为：1％琼脂糖凝胶；90v，上样量：5μlpcr产物。

进一步优选的，步骤(5)的具体方法是：将携带打靶质粒的绵羊李斯特菌，在42℃和30℃连续传代，利用同源重组杂交原理和基因打靶技术，将打靶质粒携带的目的片段整合至李斯特菌中，利用蓝白斑及红霉素敏感性筛选出可疑菌株；然后进行pcr筛选和基因测序验证。

更进一步优选的，传代培养的具体方法是：将已电转入打靶质粒的liδactaplcb-lacz划线接种bexi平板，42℃传代培养，挑取单个蓝色菌落接种bhi肉汤，30℃传代培养，待传到肉汤第3代开始，每代取培养物加入bhi稀释，分别涂布稀释菌液100μl于bexi和bxi(含x-gal20～60μg/ml的bhi琼脂平板)平板，30℃培养24小时。

更进一步优选的，传代培养的具体方法是：将已电转入打靶质粒的liδactaplcb-lacz划线接种bexi平板，42℃传代培养2～3代(每代培养时间为48小时)，挑取单个蓝色菌落接种5mlbhi肉汤，30℃，200rpm传代培养6代(每代培养时间为24小时)；待传到肉汤第3代开始，每代取40μl培养物加入360μlbhi肉汤(1:10稀释)，多次连续1:10稀释直到稀释10⁶倍，分别涂布10⁶倍稀释的菌液100μl于bexi和bxi平板，30℃培养24小时；阳性菌落liδactaplcb-meso在bxi平板上长成白色菌落，在bexi平板上不生长。

更进一步优选的，pcr筛选的具体方法是：用细菌基因组提取试剂盒提取liδactaplcb-meso的基因组dna作为模板，进行以下三组基因片段的扩增：抗红霉素基因、靶抗原基因间皮素以及acta基因，根据扩增结果对重组菌liδactaplcb-meso进行鉴定。

上游引物ery-f：5’-gataagtcgacgattcacaaaaaatag-3’，如seqidno.9所示；

下游引物ery-r：5’-aaaactagtcccggggcgaattg-3’，如seqidno.10所示。

更进一步优选的，liacta基因以seqidno.14和seqidno.15所示序列为引物进行pcr扩增；反应循环条件为：94℃3分钟→(94℃1分钟，50℃30s，72℃1分钟)×30个循环→72℃10分钟→4℃；电泳观察pcr结果，预期结果：liacta基因片段约600bp。

上游引物li-acta-f：5’-gaagctaaaagtgcaaatgtccc-3’，如seqidno.14所示；

下游引物li-acta-r：5’-atttctttaatactgcgtttgggg-3’，如seqidno.15所示.

本发明的有益效果在于：

本发明以减毒单增李斯特菌(listeriamonocytogenes，在下文中简称lm)或减毒绵羊李斯特菌(listeriaivanovii，在下文中简称li)作为载体，利用李斯特菌独特的能在宿主吞噬细胞胞内生长，是天然的t细胞免疫活化佐剂的特性，有效提高在肿瘤微环境中的特异性免疫应答，打破机体的免疫耐受，从而清除机体持续性病毒感染，达到清除病灶，遏制肿瘤发展的良好治疗效果。其优势在于弥补了核酸类及蛋白质多肽类疫苗免疫原性较低的缺点，减毒的李斯特菌保留了原始菌株能在胞内生长，完成抗原递呈的特性的同时又具有更高的安全性。具体如下：

1)联合使用减毒单增李斯特菌和减毒绵羊李斯特菌进行多次免疫治疗(如同一个体用减毒单增菌免疫治疗两次、减毒绵羊菌免疫治疗两次等不同组合)，对间皮素高表达癌症的治疗效果明显优于使用一种菌对同一个体多次免疫治疗(如同一个体用减毒单增菌免疫治疗四次)的效果，能更显著延长生存期。

2)针对性：诱导特异性针对间皮素高表达癌症细胞的细胞因子，靶向治疗癌组织，不损伤正常细胞。

3)高效：疫苗菌株免疫活性高，诱导高效的细胞因子表达。李斯特菌株本身具有高效活化机体细胞免疫功能的作用，因此携带抗原的重组菌株能激活多种抗肿瘤免疫机制，激活特异的肿瘤杀伤性t细胞，打破免疫抑制重新激活有效的肿瘤杀伤机制。

4)安全：减毒菌株不会在体内长期存在，不会引起感染，在我们的临床前试验中表现了很好的耐受性，并经其他类似临床试验证实了其安全性，且能跟其他肿瘤治疗手段很好的兼容，如鸡尾酒式免疫抑制剂、外科手术、放疗和化疗。

5)稳定：本发明制备的疫苗菌株携带的抗原基因是整合到菌株基因组中的，抗原基因在菌株内稳定存在，不会丢失。

6)低成本：疫苗的生产成本低、快速、经济，使用标准的细菌发酵技术就可完成疫苗的大规模生产，无需细胞培养。

附图说明

图1为lm打靶重组质粒结构图谱，含有两段lm同源基因(lmmpl和lmorfbaldh)、氨苄青霉素抗性基因(amp)、红霉素抗性基因(ery)、基因序列盒(genecassette)：包含启动子phly、haepitope基因、vsv-gepitope基因、gp33epitope基因、gp61epitope基因、间皮素基因。

图2为li打靶重组质粒结构图谱，含有两段li同源基因(limpl和liorfbaldh)、氨苄青霉素抗性基因(amp)、红霉素抗性基因(ery)、基因序列盒(genecassette)：包含启动子phly、haepitope基因、vsv-gepitope基因、gp33epitope基因、gp61epitope基因、间皮素基因。

图3为打靶质粒电转化李斯特菌后的pcr鉴定电泳结果图。为打靶质粒电转化lmδactaplcb-lacz和liδactaplcb-lacz后的pcr鉴定电泳结果图，1为lmδactaplcb-lacz电转后扩增的目的片段间皮素，2为liδactaplcb-lacz电转后扩增的目的片段间皮素，m为dnaladder。

图4为重组菌lmδactaplcb-meso(a)和liδactaplcb-meso(b)的基因组中插入的外源基因及前后基因结构示意图。由此图可知外源基因的插入位点，重组后的细菌基因组敲掉了acta和plcb基因。插入的外源基因在自带的启动子phly的作用下表达融合蛋白，融合蛋白具有分泌信号肽、gp33和gp61抗原表位肽标签、ha和vsv-gwesternblot检测标签。

图5为通过流式细胞术检测，菌株免疫小鼠后所诱导的细胞免疫应答。主要检测ifn-γ细胞因子的分泌水平，菌株能够诱导特异性细胞免疫应答。

a为接种了lmδactaplcb-meso小鼠脾细胞在gp33肽段刺激下，ifn-γ细胞因子的分泌水平；b为接种了liδactaplcb-meso小鼠脾细胞在gp33肽段刺激下，ifn-γ细胞因子的分泌水平。

图6为在加强治疗时对模型小鼠使用同源或异源疫苗菌株，对肿瘤肺转移模型治疗效果的评价。效果可见相对于同源治疗组，异源治疗组能够显著提高治疗小组小鼠生存率。

具体实施方式

下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。

实施例1.疫苗菌liδactaplcb-meso的制备

(1)间皮素基因片段合成

从ncbi上查询间皮素蛋白基因，然后根据李斯特菌密码子进行相应优化，并在上游加入hindⅲ酶切位点，下游加入xhoⅰ酶切位点，最后通过合成直接获得dna序列(以公司提供克隆质粒puc57-meso的形式获得)，(序列如序列表序列1所示)。

(2)构建打靶质粒

①中间质粒pcw203-meso的构建

按照质粒说明书提取质粒puc57-meso和pcw203，以30μlelutionbuffer洗脱。

puc57-meso和pcw203用hindⅲ和xhoⅰ双酶切，酶切体系20μl：puc57-meso或pcw203＜1ng，hindⅲ1μl，xhoⅰ1μl，10×nebbuffer2μl，ddh2o将体系补足20μl。37℃水浴1h酶切质粒，载体片段需加0.5μlciap，37℃水浴30min去磷酸化。将酶切混合物与6×loadingbuffer混合，电泳(1％琼脂糖，94v)并胶回收相应长度的片段(puc57-meso回收酶切后的小片段即间皮素基因片段，长度为1781bp；pcw203回收酶切后的大片段即载体片段，长度约>10kb)，以30μlelutionbuffer洗脱。

分别取间皮素基因片段与载体片段按照连接体系：载体50ng，插入片段摩尔数：载体片段摩尔数＝5:1，t4ligase1μl，10×ligasebuffer5μl，ddh2o将体系补足10μl，22℃连接1h。将连接产物按体积1:10与大肠杆菌dh5α的感受态细胞轻柔混匀，冰浴30min，42℃热击45s，冰浴3min，加入预热的sob肉汤500μl，混匀后于37℃，180rpm培养1h，涂布于la平板(lb-amp平板：含100μg/mlamp的lb平板)，37℃培养16-20h。

pcr筛选：以煮沸法提取的细菌dna基因组为模板，扩增目的条带间皮素，上游引物meso-f：5’-ccacaagctttgtcccgtacacttg-3’，下游引物meso-r：5’-tatactcgagagcaagtgtagaagc-3’，反应循环条件为：94℃3min→(94℃1min，47℃30s，72℃1min)×30个循环→72℃10min→4℃；电泳观察pcr结果(电泳条件：1％琼脂糖凝胶；90v，上样量：5μlpcr产物)，预期结果：间皮素片段约1781bp。

酶切验证：pcr筛选验证的阳性菌提取质粒，按照上述酶切体系以hindⅲ和xhoⅰ进行酶切，将酶切混合物与6×loadingbuffer混合进行电泳(1％琼脂糖，94v)。

测序验证：提取pcr及酶切验证符合预期的质粒送测序公司测序。将测序验证后完全正确的携带阳性质粒的大肠杆菌保存于-80℃。

②打靶质粒的构建

提取质粒pcw154，以30μlelutionbuffer洗脱。将质粒pcw154及中间质粒pcw203-meso分别用限制性内切酶bamhⅰ和xhoⅰ按照实施例(2)①的体系混匀(将hindⅲ酶替换为bamhⅰ酶)，进行酶切和去磷酸化，电泳后胶回收pcw203-meso酶切后的小片段即插入片段(1840bp)及pcw154载体骨架(酶切后长片段，长度约8606bp)。按照(2)①的体系混匀进行连接并转化入大肠杆菌dh5α，涂布于la平板，对长出的单个菌落进行pcr筛选、bamhⅰ和xhoⅰ双酶切验证以及测序验证，具体操作同(2)①(将hindⅲ酶替换为bamhⅰ酶)。将测序验证后携带阳性质粒的大肠杆菌保存于-80℃。打靶质粒的结构图谱见图2。

(3)电转化用liδactaplcb-lacz感受态细胞的制备

接种liδactaplcb-lacz于15ml含0.5mol/l蔗糖的bhi液体培养基，37℃220rpm培养12～16h。将上述菌液转移至250ml含0.5mol/l蔗糖的bhi液体培养基，定期测定a600，当a600＝0.4时，加入盘尼西林g，使其终浓度为12.5μg/ml继续培养。当a600＝0.7时，倒入50ml离心管，4℃10000rpm离心5min，弃上清。以0.5mol/l冰冷蔗糖溶液反复洗涤沉淀，每次加入20ml0.5mol/l蔗糖溶液，4℃10000rpm离心10min，弃上清，洗涤3次。每管加0.5mol/l蔗糖的300μl重悬，按50μl/支分装预冷无菌ep管，-80℃保存。

(4)打靶质粒电转化liδactaplcb-lacz

将制备的感受态细胞从-80℃冰箱中取出置于冰盒中，待其完全融化后，取5μl打靶质粒按1/10的比例用-20℃预冷枪头缓慢加至感受态细胞liδactaplcb-lacz，同时作ddh2o阴性对照。温和混匀后，冰浴5min，再全部转入电转杯，冰浴5min，于电转仪中进行电转(电转条件：电压＝1500v，持续时间＝5ms，电转杯内径＝1mm)。电转完成后，冰浴5min，用37℃预热的枪头加入37℃预热的bhi肉汤750μl，混匀后全部转至ep管，摇床30℃，150rpm培养2h。用无菌l形玻棒将菌液全量涂布于含红霉素1～5μg/ml、x-gal20～60μg/ml的bhi琼脂平板(以下简称bhi-ery-x-gal，bexi平板)，30℃培养48～72h后，阳性菌为蓝色菌落，于bexi平板上进行纯培养，30℃培养24h，进行提质粒及pcr验证。

pcr验证：以煮沸法提取的细菌dna基因组为模板，扩增目的条带间皮素，上游引物meso-f：5’-ccacaagctttgtcccgtacacttg-3’，下游引物meso-r：5’-tatactcgagagcaagtgtagaagc-3’，反应循环条件为：94℃3min→(94℃1min，47℃30s，72℃1min)×30个循环→72℃10min→4℃；电泳观察pcr结果(电泳条件：1％琼脂糖凝胶；90v，上样量：5μlpcr产物)，预期结果：间皮素片段约1781bp，如图3所示。

按照质粒提取试剂盒说明提取质粒(李斯特菌为革兰阳性菌，solutionⅰ使用前需加入溶菌酶，溶菌酶终浓度为20mg/l，加入含溶菌酶的solutionⅰ后重悬细菌，37℃水浴45min)，最后以30μlelutionbuffer洗脱后电泳。凝胶成像，观察有无条带以判断重组质粒导入是否成功，质粒大小为10478bp。

(5)liδactaplcb-lacz与打靶质粒同源重组及筛选

①liδactaplcb-lacz与打靶质粒同源重组杂交培养

将已电转入打靶质粒的liδactaplcb-lacz划线接种bexi板，42℃传代培养2-3代(每代培养时间为48小时)，挑取单个蓝色菌落接种5mlbhi肉汤，30℃，200rpm传代培养6代(每代培养时间为24小时)。待传到肉汤第3代开始，每代取40μl培养物加入360μlbhi作1:10稀释，连续稀释10⁶倍，分别涂布10⁶倍稀释的菌液100μl于bexi和bxi(含x-gal20～60μg/ml的bhi琼脂平板)平板，30℃培养24h。阳性菌落liδactaplcb-meso在bxi平板上长成白色菌落，在bexi平板上不生长。

②pcr鉴定liδactaplcb-meso

细菌基因组提取试剂盒提取liδactaplcb-meso的基因组dna作为模板，进行以下三组基因片段的扩增：抗红霉素基因、靶抗原基因盒以及acta基因，根据扩增结果对重组菌liδactaplcb-meso进行鉴定。liδactaplcb-meso基因组dna为模板扩增间皮素，其引物及反应条件见(2)①，扩增目的条带抗红霉素基因ery，约1471bp，引物ery-f/r(f:5’-gataagtcgacgattcacaaaaaatag-3’，r:5’-aaaactagtcccggggcgaattg-3’)，反应循环条件为：94℃3min→(94℃1min，60℃30s，72℃2min)×30个循环→72℃10min→4℃；liacta基因，约600bp，引物li-acta-f/r(f:5’-gaagctaaaagtgcaaatgtccc-3’,r:5’-atttctttaatactgcgtttgggg-3’)，反应循环条件为：94℃3min→(94℃1min，55℃30s，72℃1min)×30个循环→72℃10min→4℃；。经pcr鉴定，liδactaplcb-meso携带有间皮素融合基因，不携带抗红霉素基因，且acta基因被剔除。鉴定结果与预期吻合，liδactaplcb-meso制备成功。

③基因测序验证

pcr鉴定后以疫苗组基因组dna作为模板，pcr扩增靶抗原基因间皮素，对扩增产物测序验证，对测序正确的菌株进行菌种保存。最终获得的重组菌基因组插入的外源基因及插入位点前后的基因结构示意图如图4所示。

(6)liδactaplcb-meso疫苗候选株ld50的测定

将-20℃保存的liδactaplcb-meso菌株置37℃水浴融化后，分别取10μl接种于5mlbhi肉汤中，37℃200rpm培养过夜。第二日，取复苏一次的菌液40μl于20mlbhi肉汤中，37℃200rpm培养过夜二次复苏。

取17.5ml二次复苏的各菌液接种350mlbhi肉汤，于37℃200rpm摇床培养，培养至a600值为0.3～0.7之间时，根据李斯特菌生长曲线，确定此时a600值所对应的菌量，并根据预计的细菌接种剂量进行浓缩或是稀释处理：取一定量菌液离心，13000rpm2min，用生理盐水重悬后，再次离心，再用生理盐水将菌液重悬至染菌剂量，并置于冰上备用。

6～8周龄balb/c雌鼠适应性喂养3d后，随机分为3组，每组6只，liδactaplcb-meso免疫组尾静脉分别接种10¹⁰cfu/ml、2x10⁹cfu/ml、2x10⁸cfu/ml的菌液100μl；连续观察10天，统计小鼠死亡、存活情况，绘制各剂量组生存曲线，如图6所示；利用改良寇式法计算ld50，并以0.1×ld50作为最适后续免疫剂量。

(7)liδactaplcb-meso免疫小鼠诱导的细胞免疫应答

①c57bl/6雌鼠疫苗接种

6～8周龄的c57bl/6雌鼠适应性喂养3d后，选取3只免疫liδactaplcb-meso疫苗，注射0.1×ld50的liδactaplcb-meso(注射剂量为2×10⁷cfu/只)。

②流式细胞术检测分泌特异性ifn-γ细胞因子的cd4+和cd8+t淋巴细胞数量

脾细胞悬液制备：颈椎脱臼处死小鼠，将小鼠用针固定四肢于解剖板，75％酒精喷至其毛湿润，无菌操作取脾脏，放于装有1mlrpmimedium1640(含1％双抗)的5ml离心管中，置冰浴备用。加5mlrpmimedium1640(含1％双抗)于一灭菌平板，其中放一张无菌200目尼龙膜，用无菌眼科镊取脾脏放于尼龙膜上，并用尼龙膜将脾脏包裹，用无菌研棒轻研脾脏至其泛白(脾细胞脱落后剩下的被膜及未剔除干净的结缔组织)，用枪头将所有脾细胞悬液收集至灭菌15mlep离心管。

红细胞裂解：将装有脾细胞悬液的离心管放入低温离心机中，1300rpm/min，4℃离心5min，弃去上清，震荡离心管，使沉淀在离心管底部的细胞分散，向离心管中加入4ml经过滤除菌的红细胞裂解液，上下颠倒离心管，使细胞与红细胞裂解液充分接触，静置5min后，立即加入4mlrpmi1640medium(含1％双抗)终止裂红反应，1300rpm/min4℃离心5min，弃去上清，震荡离心管，向离心管中加入5mlrpmi1640medium(含1％双抗)，上下颠倒离心管以洗去残余的红细胞裂解液，1300rpm/min，4℃离心5min，弃去上清，震荡离心管，重复洗涤一次。震荡离心管后，向离心管中加入2mlrpmi1640medium(含10％胎牛血清)重悬，将离心管置于冰上，备用。

刺激物配制：1.gp33-41储备液：1mg的肽段中加入1mldmso，配制成1mg/ml的储备液，10μl/支分装ep管，储存于-20℃冰箱中，避免反复冻融；4.流式pma储备液：0.1mg的pma中加入1mldmso，配制成0.1mg/ml的储配液，10μl/支分装ep管，储存于-20℃冰箱中，避免反复冻融；5.流式ionomycine储备液：1mg的ionomycine中加入1mldmso，配制成1mg/ml的储备液，10μl/支分装ep管，储存于-20℃冰箱中，避免反复冻融；6.流式阳性刺激混合液：吸取100μlrpmi1640medium(含10％胎牛血清)、0.2μlgolgistop、0.2μlionomycine储备液和0.2μlpma储备液于ep管，用枪头吹打混合均匀；7.流式实验刺激混合液：吸取100μlrpmi1640medium(含10％胎牛血清)、0.2μlgp33-41储备液和0.2μlgolgistop于ep管中，用枪头吹打混合均匀。

刺激：每个样品同时做阴性对照(不刺激)和实验处理(gp33肽段)2个孔；各组随机选取2个样品用阳性刺激物(pma+ionomycine)刺激作为阳性质控。于96孔板中，每孔加入50μl脾细胞悬液和50μl相应刺激物，5％co2培养箱37℃刺激5h。

表面抗体染色：刺激完毕后，将96孔板取出，4℃1300rpm/min离心5min，弃上清，将96孔板置于漩涡震荡仪上震荡，使得沉淀于板底的细胞分散，于避光处将表面抗体anti-mousecd8ape、anti-mousetcrbetapercp-cyanine5.5、anti-human/mousecd44fitc、anti-mouseifngammaapc用pbs(含体积浓度2％胎牛血清)在灭菌ep管中分别按照体积稀释为1:200。每孔加入50μl表面抗体混合液重悬，4℃避光孵育30min后，于避光向每孔细胞中加入150μlpbs(含体积浓度2％胎牛血清)终止孵育，1300rpm/min4℃离心5min，甩弃上清，震荡96孔板，加200μlpbs(含2％胎牛血清)重悬，洗去残余抗体，1300rpm/min4℃离心5min，甩弃上清，震荡96孔板。

破膜：每孔加入100μlcytofix/cytoperm重悬，4℃避光静置20min后避光加入100μlbufferperm/wash终止，1300rpm/min4℃离心5min，甩弃上清，震荡96孔板，每孔加200μlbufferperm/wash重悬洗涤，1300rpm/min4℃离心5min，甩弃上清，震荡96孔板。

胞内抗体染色：于避光处用1×perm/washbuffer在灭菌ep管中将抗体anti-mouseifngammaapc按1:200体积比稀释。每孔分别加入混合抗体50μl重悬，4℃避光孵育45min后，于避光向每孔细胞中加入150μl1×perm/washbuffer终止孵育，1300rpm/min4℃离心5min，甩弃上清震荡96孔板，加200μl1×perm/washbuffer重悬，洗去残余抗体，1300rpm/min4℃离心5min，甩弃上清，每孔细胞加入200μl2％多聚甲醛溶液重悬收集，4℃避光保存准备上机。

上机检测结果：用researchbeads进行performanceqc以校正光路和流路，去离子水为样品冲洗流式仪约10min，至thresholdrate在20evts/sec以下。调试上机参数，选取所使用的荧光，确定样品收取数(10⁶events)，用空白孔(不做任何处理的细胞)调节测试电压，使fsca-fsch散点图、fsca-ssca散点图中细胞群与横坐标轴呈约45°夹角，每一种染料在峰状图中的出峰值(阴性峰峰值)均小于10²；测定样品并进一步调节电压，使分析某种荧光染料孵育的细胞时，该荧光染料的双峰峰值(阴性峰峰值、阳性峰峰值)以10²为界，其余荧光染料峰值小于10²。

如图5所示；为小鼠脾细胞ifn-γ细胞因子的分泌水平，可见相比未加gp33肽段组，liδactaplcb-meso能够诱导特异性gp33细胞免疫应答。

实施例2：疫苗菌lmδactaplcb-meso的制备

(1)间皮素基因片段合成

同实施例1(1)。

(2)构建打靶质粒

①中间质粒pcw203-meso的构建同实施例1(2)①

②打靶质粒的构建

提取质粒pcw180，以30μlelutionbuffer洗脱。将质粒pcw180及中间质粒pcw203-meso分别用限制性内切酶bamhⅰ和xhoⅰ按照(2)①的体系混匀(将hindⅲ酶替换为bamhⅰ酶)，进行酶切和去磷酸化，电泳后胶回收pcw203-meso酶切后的小片段即插入片段(1840bp)及pcw180载体骨架(酶切后长片段，长度约8621bp)。按照(2)①的体系混匀进行连接并转化入大肠杆菌dh5α，涂布于la平板，对长出的单个菌落进行pcr筛选、bamhⅰ和xhoⅰ双酶切验证以及测序验证，具体操作同实施例(2)①(将hindⅲ酶替换为bamhⅰ酶)。将测序验证后携带阳性质粒的大肠杆菌保存于-80℃。打靶质粒的结构图谱见图1。

(3)电转化用lmδactaplcb-lacz感受态细胞的制备

此步同实施例1(3)，其中liδactaplcb-lacz换为lmδactaplcb-lacz。

(4)打靶质粒电转化lmδactaplcb-lacz

此步同实施例1(4)，其中，打靶质粒换为pcw180-meso，质粒大小为10455bp，liδactaplcb-lacz换为lmδactaplcb-lacz。电转后细菌pcr验证结果见参照图3。

(5)lmδactaplcb-lacz同源重组及筛选

①lmδactaplcb-lacz同源重组杂交培养

此步同实施例1(5)①，其中liδactaplcb-lacz换为lmδactaplcb-lacz。。

②pcr鉴定lmδactaplcb-meso

此步同实施例1(5)②。

细菌基因组提取试剂盒提取lmδactaplcb-meso的基因组dna作为模板，进行以下三组基因片段的扩增：抗红霉素基因、靶抗原基因盒以及acta基因，根据扩增结果对重组菌lmδactaplcb-meso进行鉴定。lmδactaplcb-meso基因组dna为模板扩增间皮素，其引物及反应条件见实施例(2)①，扩增目的条带抗红霉素基因ery，约1471bp，引物ery-f/r(f:5’-gataagtcgacgattcacaaaaaatag-3’，r:5’-aaaactagtcccggggcgaattg-3’)，反应循环条件为：94℃3min→(94℃1min，60℃30s，72℃2min)×30个循环→72℃10min→4℃；扩增lmacta基因，约950bp，引物lm-acta-f/r(f:5’-gctataaatgaagaggcttcagg-3’，r:5’-ctcttaaatcagctaggcgatc-3’)，反应循环条件为：94℃3min→(94℃1min，50℃30s，72℃1min)×30个循环→72℃10min→4℃。经pcr鉴定，lmδactaplcb-meso携带有间皮素融合基因，不携带抗红霉素基因，且acta基因被剔除。鉴定结果与预期吻合，lmδactaplcb-meso制备成功。

③基因测序验证

此步同实施例1(5)③。

(6)lmδactaplcb-meso疫苗候选株ld50的测定

此步同实施例1(6)。其中lmδactaplcb-meso免疫组尾静脉分别接种1.0×10⁸cfu/只、2×10⁷cfu/只和2×10⁶cfu/只。

(7)lmδactaplcb-meso免疫小鼠诱导的细胞免疫应答

此步同实施例1(7)。其中接种了lmδactaplcb-meso(2×10⁶cfu/只)，小鼠脾细胞在gp33肽段刺激下，ifn-γ细胞因子的分泌水平为图5所示。

实施例3：疫苗菌株对间皮素高表达癌治疗效果评价

(1)ct26-meso肿瘤细胞培养及肿瘤模型的建立

用含10％胎牛血清、1％青霉素、链霉素的rpmi1640medium在37℃5％co2培养箱内培养ct26-meso细胞，待其密度达到80％左右，用hank’s液润洗细胞2～3次后，胰酶消化并用pbs重悬计数，将细胞配制成浓度为5×10⁶/ml的细胞悬液，6～8周龄的balb/c雌鼠尾静脉注射100μl细胞悬液，建立小鼠肺转移肿瘤模型，观察生存率。

(2)对建模小鼠进行同源，异源初免-加强免疫治疗比较。

实验设立阴性对照组：注射生理盐水(ns)；治疗组：治疗组1：首次注射lmδactaplcb-meso，第一次加强注射liδactaplcb-meso，第二次加强注射lmδactaplcb-meso，第三次加强注射liδactaplcb-meso；治疗组2：首次注射lmδactaplcb-meso，第一次加强注射lmδactaplcb-meso，第二次加强注射lmδactaplcb-meso，第三次加强注射lmδactaplcb-meso。

造模小鼠随机分为3组，每组6只。ct26-meso将细胞配制成浓度为5×10⁵/ml的细胞悬液，尾静脉注射100μl细胞悬液，分别于细胞注射后第3天进行第一次免疫治疗，按实施例1(7)①配制菌液，各菌株尾静脉接种100μl，ns对照组尾静脉接种等体积ns。第10天进行第二次加强免疫治疗，方法和剂量同第一次免疫治疗。第17天进行第二次加强免疫治疗，方法和剂量同第一次免疫治疗。第24天进行第三次加强免疫治疗，方法和剂量同第一次免疫治疗。每天观察生存状况。可见异源治疗组1(在103天有66％的生存率)比同源治疗组2(在103天有33％的生存率)及阴性对照组小鼠生存率显著更高。实验制备疫苗株对间皮素高表达肿瘤起到有效的控制和治疗作用。

最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。

序列表

<110>南京颂悦生物科技有限公司

<120>重组减毒李斯特菌在制备间皮素高表达癌症治疗性疫苗中的应用

<160>15

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>1781

<212>dna

<213>人工(artificial)

<400>1

aagctttgtcccgtacacttgctggtgaaactggtcaagaagctgctccactagatggtg60

ttttagccaatccacctaatatttcgagtttaagcccacgtcaattactaggttttcctt120

gtgcagaagtatctggcctttctacagaacgtgttcgtgaattagcagttgcattagcac180

aaaaaaacgttaaactatctacagaacaacttcgttgtttagctcatcgtctatctgaac240

cgccagaagatcttgatgcacttcctcttgatttattactatttcttaacccagatgcat300

tcagcggtccgcaagcctgtacacatttcttctctcgtattactaaagcaaatgttgacc360

tacttccgcgtggcgctccagaacgtcaacgtttgctaccagcagcgctagcatgttggg420

gtgtacgtggtagtcttttatccgaagcagatgtacgtgctcttggtggtttagcctgtg480

atcttccaggtcgtttcgttgctgaatcggcagaagttctattaccacgtttggtttcat540

gtccaggtccacttgaccaagaccaacaagaggcagcacgtgcagctttgcaaggtggtg600

gcccaccatacggcccgccatctacctggagtgtatccactatggatgcgcttcgtggtc660

tattaccagtacttggccaaccgattatccgtagcatcccacaaggtatcgttgcagctt720

ggcgtcaacgctctagcagagatccatcttggcgtcaacctgaacgtacaatccttcgtc780

cacgttttcgtcgtgaagttgaaaaaacagcatgtccttctggtaaaaaagctcgtgaaa840

ttgatgaatccttaattttttacaaaaaatgggaattggaagcatgcgttgatgctgctt900

tacttgcaactcaaatggacagagtcaatgcaatcccatttacttacgaacaacttgacg960

ttcttaaacataaacttgatgaattatacccacaaggttatccagaatctgttattcaac1020

acctaggctacctattccttaaaatgtctccggaagacattcgcaaatggaatgtaacta1080

gcctggaaactttaaaagcattattagaagtgaataaaggccatgaaatgtcaccacaag1140

tagcaacattaattgatcgttttgtcaaaggtcgtggacaacttgacaaggatactttag1200

atactttgacagcattctatccaggttacttatgttcactttctccagaagaattatcct1260

ctgtaccaccatcctcgatctgggctgtacgccctcaagatcttgatacatgcgatccgc1320

gtcaacttgatgttctatatcctaaagctcgtttagcatttcaaaatatgaacggctctg1380

aatattttgtaaaaatccaatccttccttggtggtgctcctacagaagaccttaaagctc1440

tatctcaacaaaacgtaagtatggatttagcgactttcatgaaattaagaacggatgcag1500

tactacctttaacggtagcagaggttcaaaaattactaggcccacacgttgaaggtctta1560

aagctgaggaacgtcaccgcccagtacgtgattggattttacgtcaacgccaagatgatc1620

ttgataccttggggttaggtttacaaggtggtatcccaaatggttatcttgtacttgatt1680

taagtgtacaagaagctcttagcggtacaccttgcttattgggtcctggcccagttttga1740

cagttttagcattgttattagcttctacacttgctctcgag1781

<210>2

<211>14828

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

tgcggccgccagtgtgatggatatctgcagaattaattcggctttctagagtgactttta60

tgttgaggcattaacatttgttaacgacgataaagggacagcaggactagaataaagcta120

taaagcaagcatataatattgcgtttcatctttagaagcgaatttcgccaatattataat180

tatcaaaagagaggggtggcaaacggtatttggcattattaggttaaaaaatgtagaagg240

agagtgaaacccatgaaaaaaataatgctagtttttattacacttatattagttagtcta300

ccaattgcgcaacaaactgaagcaaaggatgcatcggatccatatccatatgatgttcca360

gattatgcatcattgaattcaatgagaagtgaaagaccacaagctttgtcccgtacactt420

gctggtgaaactggtcaagaagctgctccactagatggtgttttagccaatccacctaat480

atttcgagtttaagcccacgtcaattactaggttttccttgtgcagaagtatctggcctt540

tctacagaacgtgttcgtgaattagcagttgcattagcacaaaaaaacgttaaactatct600

acagaacaacttcgttgtttagctcatcgtctatctgaaccgccagaagatcttgatgca660

cttcctcttgatttattactatttcttaacccagatgcattcagcggtccgcaagcctgt720

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