本发明涉及医用配制品，具体涉及来自药用植物的未确定结构的药物制剂。
背景技术：
急性缺血性中风是临床上常见且高发的脑血管疾病，具有发病急，进展快，致残率和病死率高的特点，是医学界公认的人类健康杀手的第一位，现已成我国城乡居民健康的重大威胁之一。随着治疗手段的不断进步，脑中风病死率较前有所下降，但致残率却逐步上升。中医认为三焦和脑脉、脑神等具有相关性，而三焦壅塞在中风的病理演变中起着重要作用，临床上通过宣通三焦法治疗急性缺血性中风疗效显著。
目前，国内外治疗急性脑中风首选有效的治疗方案是使用阿替普酶进行静脉溶栓，治疗效果已经被美国国立神经病与卒中研究院(ninds)实验证实，但此治疗方案在实际临床应用中受到诸多限制，因为选择此种方式治疗急性脑中风具有严格的适应症、禁忌症及时间窗，因此，实际静脉溶栓治疗的患者比例很低，在我国低至1.23％。而降低病死率和致残率的关键环节在于疾病早期的干预治疗，因此，通过中医辨证论治，合理采用中药干预治疗急性缺血性中风来降低致死率和致残率、提高患者生存质量，寻找一种毒副作用小、便于长期服用，专门治疗急性缺血性中风的中药组合物迫在眉睫。
技术实现要素：
本发明所要解决的技术问题是提供一种治疗急性缺血性中风的中药组合物，该中药组合物不仅适用于治疗急性缺血性中风，而且效果显著。
本发明所要解决上述问题的技术方案如下：
一种治疗急性缺血性中风的中药组合物，该药物由有效成份和医学上可接受的赋形剂组成，其中所述的有效成份由以下重量百分比的原料药制成：大黄10.4～11.5％，防风10.4～11.5％，栀子26.0～28.7％，人工牛黄1.6～1.7％，天竺黄10.4～11.5％，厚朴10.4～11.5％，赤芍10.4～11.5％，虎杖15.6～17.2％。
上述中药组合物，其中所述原料药的最佳配比为，大黄10.9％，防风10.9％，栀子27.5％，人工牛黄1.6％，天竺黄10.9％，厚朴10.9％，赤芍10.9％，虎杖16.4％。
上述方案中所述的有效成份由下述方法制得：
(1)取人工牛黄粉碎成细粉，过筛，备用；
(2)取除人工牛黄外的其余原料药，加水热回流提取4小时，过滤，将收滤液并减压浓缩至60℃下相对密度为1.0-1.2浸膏，然后真空干燥，粉碎成细粉；
(3)合并步骤(1)和步骤(2)所制得的细粉，即得所述的有效成份。
本发明所述的中药组合物为常见的口服剂，该口服剂为由上述有效成份和医学可接受的赋形剂按常规方法制成的片剂、颗粒剂或胶囊剂。
基于急性缺血性中风的主要病机，发明人依据传统中医理论以“宣通三焦通腑化痰开窍”为总体思路进行组方。方中防风、大黄、栀子为君药，分别起宣肺、通腑、利小便的作用，宣通三焦；臣药人工牛黄、天竺黄清热且具有化痰开窍之功；佐使药以虎杖、赤芍、厚朴通腑、活血、通腑。全方共奏宣通三焦、通腑化痰开窍之功。方中君药、臣药、佐药、使药各司其职，治疗急性缺血性中风的效果显著。
本发明所述的中药组合物治疗急性缺血性中风的效果，通过下述临床实验和动物实验的统计结果予以证实。
附图说明
图1为激光散斑血流成像系统评价maco模型的结果图。
图2为本发明中药组合物对mcao大鼠神经行为学评分影响统计结果的曲线图。
图3为本发明中药组合物对mcao大鼠脑梗死面积影响的结果图。
图4为本发明中药组合物对mcao大鼠脑组织形态影响的结果图(he染色，×200)。
图5为本发明中药组合物对mcao大鼠脑组织形态影响的结果图(nissl染色，×200)。
图6为本发明中药组合物对maco大鼠血清lpo、mda和no水平和sod活性影响结果的条形图。
图7为本发明中药组合物对maco大鼠血清il-1β、tnf-α含量的影响结果的条形图。
图8为本发明中药组合物对maco大鼠脑组织相关蛋白表达影响结果的条形图。
图9为本发明中药组合物对maco大鼠脑组织凋亡细胞数量影响的结果图(tunel染色，×200)。
图10本发明中药组合物对maco大鼠脑组织相关蛋白表达(bax、cyt-c、lc3b)的影响的结果图标(免疫荧光，×200)。
上述图2中标注符号的含义分别是：*表示模型组(model)、本发明药物低剂量组(tst-l)、本发明药物中剂量组(tst-m)、本发明药物高剂量组(tst-h)和安宫牛黄丸组(anw)与假手术组(sham)比较差异具有统计学意义(p<0.05)，#表示本发明药物低剂量组(tst-l)、本发明药物中剂量组(tst-m)、本发明药物高剂量组(tst-h)和安宫牛黄丸组(anw)与模型组(model)比较差异具有统计学意义(p<0.05)。
图3、图6-9中标注符号的含义分别是：*表示模型组(model)与假手术组(sham)比较差异具有统计学意义(p<0.05)，#表示本发明药物低剂量组(tst-l)、本发明药物中剂量组(tst-m)、本发明药物高剂量组(tst-h)和安宫牛黄丸组(anw)与模型组(model)比较差异具有统计学意义(p<0.05)。
(一)临床实验
1对象与方法
1.1一般资料
60例患者来源于2016年8月～2018年3月东莞市中医院icu脑病内外科住院患者，经头颅ct/mri证实为脑梗死或脑出血。按就诊顺序随机分为治疗组、对照组。治疗组共30例，其中男19例，女11例；对照组共30例，其中男20例，女10例。两组患者年龄、性别、病因、病程及合并症等一般资料方面比较均无统计学差异(p>0.05)。
1.2诊断标准
西医诊断标准参照《中国急性缺血性脑卒中诊治指南(2014)》的诊断标准。中医诊断标准参照1996年国家中医药管理局脑病急症协作组制订的《中风病诊断与疗效评定标准(试行)》中脏腑闭证标准。
1.3纳入标准
同时满足下列条件：符合脑中风中、西医诊断标准者；证型诊断符合中风中脏腑闭证者；发病时间在7天内；年龄在35岁～80岁之间；意识障碍评分(glasgow评分)<13分；患者家属自愿签署知情同意书者。
1.4排除标准
满足以下条件之一：不符合纳入标准者；诊断为短暂性脑缺血发作者；合并有血液、消化、泌尿系等内科系统或精神障碍等严重原发病者。
1.5病例脱落标准
满足以下条件之一：治疗观察期内死亡病例；中途离院(放弃治疗、出院或转外院继续治疗)者；因各种原因致临床观察终止者。
1.6分组方法：
按随机原则，查阅随机数字表分为治疗组和对照组两组进行观察，每组30例。对比两组患者性别、年龄，进行统计学分析，两组之间差异无统计学意义。
1.7治疗方法
由于急性缺血性中风具有很高的致死率和致残率，因此，在进行临床药效验证的过程中，还必须将患者的生命健康安全放在第一位。本病一般情况下发病后初始2周内为急性期，2周以后进入恢复期，因此，在发病后2周的急性期内必须同时对两组患者进行常规治疗。对照组和治疗组的具体治疗方式如下：
基础治疗：参照《中国急性缺血性脑卒中诊治指南(2014)》分别对治疗组和对照组采取基础治疗。主要治疗措施有：基本护理，维持生命体征(体温、血压、心跳、脉搏等)，预防和治疗消化道出血、感染等并发证，控制血压、血脂、血糖，监测出入量、维持水电解质平衡，对症处理脑水肿和颅高压、抗血小板凝聚、降纤、抗凝等。
治疗组：在基础治疗基础上鼻饲(病人神清后，可改为口服)下述实施例1所述的颗粒剂，15g每次，溶于100ml温开水中，每天2次。如大便次数每天超过4次，剂量减半，保持腑气通畅(每日大便1～3次为度)。7天为一疗程，共1个疗程。
对照组：在基础治疗基础上鼻饲(病人神清后，可改为口服)安宫牛黄丸(广州白云山中一药业有限公司，国药准字z44020047)，3g每次，溶于温开水100ml中，每天1次。7天为一疗程，共1个疗程。
1.8观察项目
入院时生命体征(体温、血压等)、格拉斯哥昏迷量表评分；神志清醒时间，治疗前、治疗后3天、7天gcs量表评分情况；观察治疗前后血常规、生化指标、床边心电图、不良反应的发生情况。
1.9疗效判定标准
采用glasgow昏迷评定量表对患者治疗前、治疗后3天，治疗后7天分别评分并比较。临床痊愈：意识障碍评分达13分以上；显效：意识障碍评分改善超过5分；有效：意识障碍评分改善超过2分；无效：意识障碍评分无变化、甚至加重。
2.0统计学处理
所有统计数据均采用spss13.0统计软件进行分析，计量资料以均数±标准差表示，采用t检验；计数资料采用卡方检验。以p＜0.05表示差异具有统计学意义。
2结果
2.1两组患者意识清醒时间比较
治疗组和对照组两组患者平均意识清醒时间比较,差异有统计学意义(p＜0.05)，见表1。
表1两组患者意识平均清醒时间比较(
注：①表示治疗组与对照组清醒时间对比有显著性差异(p<0.05)。
2.2两组患者治疗前后gcs评分比较
治疗前两组比较差异具无统计学意义(p>0.05)。治疗后3天，两组gcs评分均有不同程度的改善，分别与同组治疗前比较，差异有显著性意义(p<0.05)；治疗后3天两组间比较差异无统计学意义(p>0.05)。治疗后7天，治疗组与对照组比较差异显著，有统计学意义(p<0.05)，见表2。
表2两组治疗前后gcs评分比较(
注：①表示治疗后3天两组与治疗前比较，p<0.05；②治疗后3天治疗组与对照组治疗比较，p>0.05；③表示治疗后7天治疗组与对照组比较，p<0.05。
2.3两组患者临床疗效比较
治疗组与对照组总有效率比较，差异有统计学意义(p<0.05)，见表3。
表3两组治疗后临床疗效比较(n，％)
注：①表示治疗组与对照组总有效率对比有显著性差异(p<0.05)。
2.4安全性分析
本研究观察期间两组均无死亡病例，未出现不良事件。入组第1天及第7天两组安全性指标均未见明显影响，提示两组药物对肝、肾、心脏等脏器无损害，较安全。
2.5结论
安宫牛黄丸是中国传统医学中治疗临床危急重症最负盛名、应用较广的中成药，是治疗中风闭证的传统方药，具有解热、镇静，减轻脑水肿，促进受损的神经系统的修复、改善脑循环，增加脑血流量等作用。本研究发现本发明中药组合物或安宫牛黄丸配合基础治疗均可改善中风急性期中脏腑闭症患者的意识状态。治疗组与对照组比较，在缩短患者的清醒时间，改善患者的治疗后7天gcs评分方面更具优势。
(二)动物实验
1实验材料与仪器
1.1实验药物
治疗组药物为本发明实施例1所述的颗粒剂；
对照组药物为安宫牛黄丸(北京同仁堂科技发展股份有限公司。批号：16017026)。
1.2实验试剂
大鼠线栓250-280g：规格：250-280g/0.37mm*0.28mm/5cm(深圳瑞沃德公司)；戊巴比妥钠(德国默克公司，批号：110320)；2％盐酸利多卡因规格：5ml(湖北天药药业有限公司，批号：31604283)；通用型组织固定液(中性)(武汉塞维尔生物科技有限公司，批号：174801)；2,3,5-氯化三苯基四氮唑(美国amresco公司，批号：20170701)；bca蛋白检测试剂盒(碧云天生物公司，批号：022616160511)；丙二酸(mda)试剂盒(南京建成生物公司，批号：20180103)；sod试剂盒(南京建成生物公司，批号：20180103)；脂质过氧化物(lpo)试剂盒(南京建成生物公司，批号：20180103)；一氧化氮(no)含量检测试剂盒(北京索莱宝科技有限公司，批号：20180224)；大鼠il-1βelisa试剂盒(abbkine公司，产品编号：ket9001-2，批号：atqsf2601)；大鼠tnf-αelisa试剂盒(abbkine公司，产品编号：ket9007-2，批号：atqse2101)；tunel试剂盒(roche公司，货号：11684817910)；anti-bcl-2antibody(abcam公司，货号：ab32124)；anti-lc3bantibody(abcam公司，货号：ab192890)；anti-baxantibody(abcam公司，货号：ab32503)；anti-activecaspase-3antibody(abcam公司，货号：ab32042)；anti-cytochromecantibody(abcam公司，货号：ab33504)；anti-nrf2antibody(abcam公司，货号：ab31163)；anti-hemeoxygenase1antibody(abcam公司，货号：ab13248)；anti-gapdhrabbitpolyclonalantibody(康为世纪公司，货号：cw0101m，批号为30118)；anti-β-actinmousemonoclonalantibody(康为世纪公司，货号：cw0096m，批号为10209)；irdye800cwgoatanti-rabbit(二抗)(li-cor公司，货号：926-32211，批号为c70301-05)；irdye800cwgoatanti-mouse(二抗)(li-cor公司，货号：926-32210，批号为c70301-02)；封闭用山羊血清(康为世纪公司，货号：cw0130s，批号为30245)；抗荧光衰减封片剂(北京索莱宝科技有限公司，货号：s2110)。
1.3实验仪器
(1)脱水机：型号：stp120；厂家：赛默飞世尔科技公司；
(2)组织包埋机：型号：histostar；厂家：赛默飞世尔科技公司；
(3)石蜡切片机：型号：hm340e；厂家：赛默飞世尔科技公司；
(4)倒置荧光显微镜：型号：bds300；厂家：重庆奥特光学仪器有限公司；
(5)样品快速研磨仪：型号：jxfstprp-32；厂家：上海净信实业发展有限公司；
(6)酶标仪：型号：multiskang01510；厂家：赛默飞世尔科技公司；
(7)双色红外线激光成像系统：型号：odysseysa；厂家：基因泰克有限公司；
(8)水平摇床：型号：wd-9045b，厂家：北京六一仪器厂；
(9)gxg电子天平：型号：jj3000；厂家：常熟市双杰测试仪器厂；
(10)分析天平：型号：el204；厂家：上海梅特勒-托利多仪器有限公司；
(11)离心机：型号：d3024r；厂家：美国赛洛捷克公司；
(12)转移电泳仪电源：型号：dyy-7c；厂家：北京六一生物科技有限公司；
(13)双垂直电泳仪：型号：dycz-25d；厂家：北京六一生物科技有限公司；
(14)玻璃板支架：型号：wd-2106a；厂家：北京六一生物科技有限公司。
1.4耗材
注射器、剃毛刀、手术刀、碘伏、棉签、医用纱布、固定板、棉线、缝合针、手术剪、镊子、枸橼酸钠抗凝管、真空采血管等。
2实验方法
2.1实验动物
2.1.1品种、来源和体重
spf级雄性大鼠，鼠龄8-10周，体重约250-270g，购自广州中医药大学实验动物中心，动物使用许可证号：scxk(粤)2013-0085，动物生产许可证号：scxk(粤)2013-0020。实验前适应性喂养1周。实验大鼠的喂养、灌胃等实践操作均按照国际准则执行。
2.1.2动物接收、检疫和检疫期间标记
(1)接收：动物购进后，接收人员检查验收，验收合格后将动物运至药科楼a401动物房，每笼4-5只，给予正常饲料及饮用水。
(2)检疫内容和结果：皮毛有光泽，无脱毛现象；眼、鼻、耳正常，无分泌物；身体各部位无外伤及炎症；行为与步态、自主活动正常；大小便正常；摄食、饮水正常。在检疫观察期间，观察了动物的外观体征、行为活动、粪便性状及摄食等指征，未发现不合格动物。
(3)检疫观察地点和时间：动物接收后于广州中医药大学药科楼a401检疫3天。
2.1.3动物饲养及饲养条件
(1)饲养环境：动物用不锈钢笼饲养，饲养于实验动物房中，动物房环境温度范围为22～25℃，相对湿度为50～60％，12h明暗交替，工作照度200～300lux，动物照度15～20lux。食盒上贴上标签，标签内容包括：实验名称、性别、专题负责人、接收日期等相关内容。
(2)饲养条件：对大鼠的饲喂遵循“定时定量”的原则，取颗粒饲料适量，分到每笼大鼠食盒中，每天分两次饲喂。大鼠饲料由广州中医药大学实验动物中心提供。饮用水为纯水，每天更换。
2.2给药剂量和方法
手术后6小时予以灌胃药物1次，随后连续灌胃7天，每天1次。模型组和假手术组给予纯水，安宫牛黄丸组给予安宫牛黄丸0.3g/kg，治疗组低、中、高剂量组分别给予本发明实施例1所述颗粒剂的0.6g/kg，0.3g/kg，0.15g/kg。灌胃体积均为10ml/kg。
表4各组动物给药剂量表
2.3实验分组
采用健康雄性sd大鼠，正常饮食饮水，适应性饲养1周后，进行脑缺血再灌注手术，手术成功后即随机分6组：假手术组(sham)，模型组(model)，本发明低剂量组(tst-l)，本发明中剂量组(tst-m)，本发明高剂量组(tst-h)，安宫牛黄丸组(anw)。假手术组除不插入线栓外，其余操作与手术组相同。每组15只，如果实验过程中出现死亡，则另补齐大鼠。
2.4模型的制备
雄性sd大鼠手术前一晚禁食不禁水，腹腔注射1％戊巴比妥钠麻醉，将大鼠呈仰卧位用鼠板固定，颈部用剃毛器除去毛，75％酒精棉球消毒，于颈部正中切一1-2cm开口，钝性分离胸锁乳突肌、胸骨和舌骨肌之间的肌间隙，于左侧颈内三角处暴露颈总动脉，分离颈总动脉和迷走神经，再沿颈总动脉向上钝性分离出颈内外动脉，将游离颈外动脉后用手术丝线结扎颈外动脉近心端，用显微动脉夹分别夹闭颈内动脉和颈总动脉，并在其下备一条手术丝线，用显微眼科剪于颈总动脉的分叉处剪一切口，将线栓沿切口插入颈总动脉，将备用丝线于切口处打一活结，松开颈内动脉处的动脉夹，将线栓从颈总动脉缓缓往上插入颈内动脉内，最终进入颈内动脉颅内段，抵达大脑中动脉的起始部，插入深度距离颈内外动脉分叉处约18±1mm，阻断一侧大脑中动脉的所有血供来源，接着扎紧颈总动脉切口处活结，松开颈总动脉夹，进行逐层缝合，线栓另一头暴露在皮肤外。1.5小时后，将线栓缓缓拔出，至有阻力时表明线栓头端已到颈总动脉切口处，脑血流再灌注完成，将暴露于皮肤外的线栓剪除。进行术后青霉素消炎，同时给予0.25％盐酸利多卡因镇痛处理。假手术组除不插入线栓外，其余操作与手术组相同。
2.5观察指标
2.5.1激光散斑数据采集
手术结束后，随机抽取假手术组和模型组动物各一只,用异氟烷混合压缩空气(氧气和氮气)对大鼠实验全程进行气体麻醉。实验开始时，先用5％异氟烷诱导麻醉，然后用2％异氟烷继续维持麻醉，在此麻醉状态下进行手术过程，并采集激光散斑成像原始数据。将大鼠至稳定固定于立体定位仪上，用剃毛器剔去大鼠头部绒毛，从头部正中沿矢状缝剪开头皮及筋膜，用手术刀将颅骨表面的骨膜等结缔组织清理干净后，用带有约1.6mm直径钻头的高速牙科钻打磨大鼠冠状缝与人字缝之间颅骨区域至皮层血管清晰可见。在打磨颅骨的过程中，适时使用生理盐水降温，防止因打磨太快而对大鼠脑组织造成热损伤。打磨完成后将成像装置的圆形不锈钢底座安装在磨薄的大鼠颅骨区域。
在实验中我们只是磨薄颅骨，并没有去除颅骨，保持了硬脑膜和皮层组织的完整性，不会因为颅骨的缺失造成颅内压的改变，引起脑水肿等，以保证对实验大鼠进行较稳定的长期观测，且减少由于心脏搏动和呼吸可能引起的误差。
2.5.2一般指标
每日仔细观察和记录各组大鼠的精神状态、皮毛变化、活动状况、饮水及进食量；并于术后第1、3、7天测量每只大鼠的体重情况。
2.5.3神经行为学评分
在造模后第1、3、7天分别对大鼠进行神经行为学评分。将术后第一天打分总分小于3分的插线手术组大鼠剔除实验，另补齐大鼠。神经行为评分标准：①提鼠尾观察前肢屈曲情况，如双前肢对称伸向地面计为0分，如手术的对侧前肢出现腕屈计为1分，肘屈曲计为2分，肩内旋计为3分，既有腕射屈曲又有肩内旋者计为4分；②将动物置于平地面上，分别推双肩向对侧移动，检查阻力，如双侧阻力对等且有力计为0分，如向手术的对侧推动时阻力下降者，根据下降的程度不同分为轻、中、重三度，分别计为1，2，3分。③将动物双前肢置于金属网上，观察双前肢的肌张力。双前肢肌张力对等且有力者计为0分，同样根据手术对侧肢张力下降程度不同计为1，2，3分。④动物有不停向一侧转圈者，计为1分。分数越高，动物的行为障碍越严重。
2.5.4ttc染色
将动物麻醉处死，快速断头，剥除颅骨，在冰浴环境中取大脑，去掉小脑、嗅球和低位脑干等，放入-20℃冰箱中冷冻20min，取出后用手术刀片从额极开始每间隔2mm做冠状切片，连续做4个。切片立即置于2％ttc中染色，并在37℃的避光条件下孵育20min，染色后放入4％多聚甲酸中固定1h，用数码相机拍照后输入计算机，用image-proplus6.0图像分析系统测量照片上缺血脑组织面积(缺血部分不着色，不缺血部分染成红色)，计算梗死部分面积。
2.5.5病理学染色(he染色和尼氏染色)
冰浴断头取双侧大脑视交叉前后2mm的冠状切片组织块固定在4％多聚甲酸，石蜡包埋后切片，经he染色后，通过光镜下观察评价各组大鼠脑组织的病理学改变。尼氏染色：切片用1％甲苯胺蓝溶液进行染色，然后用95％的酒精分色，接着用酒精梯度脱水，二甲苯透明，封片后可在光镜观察尼氏小体形态，数量和分布变化。
2.5.6生化指标检测
本发明中药组合物对大鼠脑缺血再灌注的氧化应激情况影响：采用比色法，测定血清中氧化应激的相关指标：脂质过氧化物(lpo)含量、超氧化物歧化酶(sod)活性、丙二醛(mda)含量、一氧化氮(no)含量。按照lpo、sod、mda、no试剂盒上的说明书步骤进行相应操作，测量并记算其在各组大鼠血清中的含量。
2.5.7elisa法检测炎症因子il-1β、tnf-α
应用elisa试剂盒测定血清中il-1β和tnf-α的含量，按说明书提示操作和测定。
2.5.6免疫印迹法检测蛋白表达
检测凋亡相关蛋白bax、bcl-2、cyt-c的表达，检测自噬相关蛋白lc-3的表达，检测氧化应激相关蛋白nrf2、ho-1的表达。
(1)提取大鼠脑组织中的蛋白及测定其浓度
蛋白提取：首先称取约100mg大鼠脑组织放入2ml的ep管中，尽量剪碎脑组织块。然后加入ripa裂解液(强)1ml并放置于冰上，然后用匀浆机将脑组织破碎3次，每次10秒，并置于冰上让其充分裂解，30min后，12000rpm，4℃离心10min；将离心后的上清液分装于0.5ml的离心管中，保存在-80℃的冰箱。
测定脑组织蛋白浓度：依据bca试剂盒说明书，具体各步骤如下所述：
①配制0.5mg/ml的标准蛋白稀释液：精密吸取20μl的25mg/ml蛋白标准溶液，然后加入稀释液980μl，即得。
②将适当体积的样品精密吸取至96孔板中，随后加稀释液至20μl。另外分别精密吸取20、16、12、8、4、2、1、0μl的0.5mg/ml标准蛋白稀释液于96孔板中，加稀释液至20μl。
③bca工作液的配制根据样品数量而定，bca-a、bca-b液按照50:1的比例来配制。
④将200μl的bca工作液加入板孔中，充分混匀，然后37℃条件下放置30min。于波长562nm处测定蛋白浓度。
(2)sds-page凝胶电泳的制备
①灌胶：将玻璃板清洗烘干后保持两层平整对齐，然后在电泳灌胶装置上固定，已备灌胶。选择合适凝胶浓度以便测量目的蛋白的分子量大小，按照指南手册进行操作，配制12％或15％分离胶，灌注大约6ml分离胶后以超纯水封口，当折射线出现在分离胶和水之间时代表已凝固完全。约5min后，倒去上层水并用滤纸将其吸净。将5％浓缩胶加入到分离胶中，立即用梳子平行插入。适当在胶凝固的过程中两边补胶，避免胶凝固导致体积变小。待浓缩胶凝固后，把梳子沿竖直方向拔出，防止对凝胶加样孔造成破坏。
②样品处理及上样：将5×还原上样缓冲液以及去离子水加入到30μg的总蛋白样品溶液中，使其总体积达到20μl，再进行振荡混匀。放置于95℃下，使蛋白变性10min后，离心。依次用移液器吸取20μl的变性蛋白样品缓慢加入到上样孔中，注意避免气泡的产生。
③电泳：上样完成后，准备电泳，设置电泳电压为80mv，跑20min，待样品中的溴酚蓝压成一直线后，进入分离胶时，再调整电压为120mv，待溴酚蓝直线移至距离玻璃板底部1cm左右时停止电泳。
④转膜：打开转印模块的夹子，将黑色一面置底，随后安装“三明治夹层”，将海绵垫→滤纸→胶→pvdf膜(需提前在甲醇中活化5min)→滤纸→海绵垫依次放置，注意放置全程中应避免气泡出现。接着在300ma的电压条件下转1h左右，具体时间依据分子量大小决定，转膜全程均在冰浴环境中进行。
⑤封闭：完成转膜后迅速在tbs中洗涤膜，取出pvdf膜并将其右上角剪去以便区别方向。剪膜主要依据marker的分子量，同时根据需测定的蛋白分子量进行。将剪后的膜浸入到含5％脱脂奶粉的tbst溶液中，在室温下封闭2h。(在未结束封阻之前膜不能和tween-20有任何接触，否则会造成背景过高)
⑥一抗孵育及二抗孵育：用tbst轻缓漂洗封闭完成的pvdf膜，然后稀释一抗(抗体稀释液根据说明书中的比例配制)，在4℃环境下，放置在水平摇床中孵育过夜(16h)，待一抗完成后进行回收，然后用tbst洗膜4次，每次5min。洗膜完后加入红外染料标记的二抗稀释液(避光)，并在室温条件下置于水平摇床上孵育1h(避光)，待二抗孵育完成后，再以tbst洗膜4次，每次5min。
⑦显色：用pbs冲洗除去tween-20，使用odysseyclx近红外双色荧光成像系统进行扫描。
2.5.7tunel法检测细胞凋亡
(1)石蜡切片脱蜡至水：依次将切片放入二甲苯ⅰ15min-二甲苯ⅱ15min-无水乙醇ⅰ5min-无水乙醇ⅱ5min-85％酒精5min-75％酒精5min-蒸馏水洗。(冬天适当延长脱蜡时间)
(2)修复：切片稍甩干后用组化笔在组织周围画圈(防止液体流走)，在圈内滴加蛋白酶k工作液(蛋白酶k储存液用pbs1:9稀释)覆盖组织，37度温箱孵育30min。将玻片置于pbs(ph7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。
(3)破膜：切片稍甩干后在圈内滴加破膜工作液覆盖组织，常温下孵育20min，将玻片置于pbs(ph7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。
(4)加试剂1和2：按片子数量和组织大小取tunel试剂盒内适量试剂1(tdt)和试剂2(dutp)按2:29混合(试剂1，2为现配现用)，加到圈内覆盖组织，切片平放于湿盒内，37℃恒温孵育2小时，湿盒内加少量水保持湿度。
(5)阻断内源性过氧化物酶：将玻片置于pbs(ph7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片放入用甲醇配制的3％过氧化氢溶液(过氧化氢：甲醇＝1:9)室温避光孵育15min，将玻片置于pbs(ph7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。
(6)加试剂3：切片稍甩干后，每张切片加适量试剂3(converter-pod)覆盖组织，切片平放于湿盒内，37℃温箱孵育30min。将玻片置于pbs(ph7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。
(7)dab显色：切片稍甩干后在圈内滴加新鲜配制的dab显色液，显微镜下控制显色时间，阳性为细胞核呈棕黄色，自来水冲洗切片终止显色。
(8)复染细胞核：harris苏木素复染3min左右，自来水洗，1％的盐酸酒精分化数秒，自来水冲洗，氨水返蓝，流水冲洗。
(9)脱水封片：将切片依次放入75％酒精6min-85％酒精6min--无水乙醇ⅰ6min-无水乙醇ⅱ6min-二甲苯ⅰ5min中脱水透明，将切片从二甲苯拿出来稍晾干，中性树胶封片。
tunel结果判读：苏木素染细胞核为蓝色，dab显出来的阳性凋亡细胞核为棕黄色。每组内每张切片在缺血半暗带区域内随机挑选至少6个200倍视野进行拍照。拍照时尽量让组织充满整个视野，保证每张照片的背景光一致。tunel法检测细胞凋亡，凋亡细胞核固缩呈棕褐色，圆形、新月形或不规则形。应用image-proplus6.0软件选取相同的棕黄色细胞核作为判断所有照片阳性细胞的统一标准，选取相同的蓝色细胞核为总细胞，对每张照片进行分析得出每张照片阳性细胞数以及总细胞数。
2.5.8免疫荧光法
(1)脱蜡：切片放于切片架上经过一系列二甲苯、无水乙醇、水清洗，以清除石蜡，并使组织复水后便于与抗体结合；
(2)抗原修复：将切片在10mm柠檬酸盐缓冲盐缓冲溶液(ph＝6.0)中煮沸，在亚沸状态下放置10min，冷水流冲洗30min。
(3)洗涤：pbs浸洗玻片3次，每次3min，吸水纸吸干pbs；
(4)画圈：在组织周围画上圆圈，防止液体流失；
(5)透膜：0.5％triton-x-100(pbs配制)室温通透20min(细胞膜上表达的抗原省略此步骤)；
(6)洗涤：pbs浸洗玻片3次，每次3min，吸水纸吸干pbs；
(7)封闭：滴加正常山羊血清，室温封闭1h；
(8)一抗孵育：吸水纸吸干封闭液，不洗，滴加一抗(5％山羊血清稀释)并放入湿盒，4℃孵育过夜(16h)；
(9)洗涤：pbst(0.1％吐温-20)浸洗切片3次，每次5min，吸水纸吸干pbst；
(11)二抗孵育：单染：滴加荧光二抗(5％山羊血清稀释)，在湿盒中37℃孵育1h。
(12)洗涤：pbst浸洗3次，每次5min，吸水纸吸干pbst；
(13)复染核：滴加dapi(10ug/ml)避光孵育5min，对标本进行染核；
(14)洗涤：pbst浸洗4次，每次5min，吸水纸吸干pbst；
(15)在切片上滴加1滴抗荧光淬灭剂，将盖玻片贴在载玻片上，激光共聚焦下观察采集图像。扫描参数：激发光波长488nm，检测的发射光波长518nm(绿色)，物镜40倍，采用点扫描方式，zoom为1.0
2.6数据处理
所有实验数据结果均采用spss24.0统计软件进行数据分析，所有数据以均数±标准差
3实验结果
3.1激光散斑血流成像系统评价maco模型
图1表明，model组成功阻断大鼠大脑右侧局部血流，局部血流值明显降低。
3.2动物状态及体重
手术前各组动物状态正常，体重基本无差异。手术后一周内sham组大鼠精神状态好，毛发色泽正常，饮食正常，反应灵敏，体重正常增加。model组大鼠精神状态萎靡，毛发色泽黯淡，反应灵敏性降低，体重下降。tst各治疗组和anw组大鼠与model组比较，动物状态转好，且体重均有不同程度增加。
表5本发明中药组合物对maco大鼠体重的影响
3.3本发明中药组合物对mcao大鼠神经行为学评分的影响
术后1天，与sham组相比，model组、tst各组和anw组神经行为学评分显著增加(p<0.05)。术后一周时，与model组相比，tst-m、tst-h组及anw组神经行为学评分显著降低(p<0.05)。tst-m、tst-h组与anw组相比，神经行为学评分不具有统计学差异。结果见图2。
3.4本发明中药组合物对mcao大鼠脑梗死面积的影响
sham组大鼠脑组织均未见缺血梗塞灶。与sham组大鼠相比，model组大鼠缺血梗塞灶明显，脑缺血面积显著增大(p<0.05)。与model组大鼠相比，tst-h组和anw组大鼠缺血面积显著减小(p<0.05)。tst-h组和anw组大鼠缺血面积比较不具有统计学差异。结果见图3。
3.5本发明中药组合物对mcao大鼠脑组织形态的影响
he染色结果显示，sham组大鼠大脑皮层、海马区和缺血半暗带区域神经元细胞无明显异常，无明显缺血损害表现，细胞形态正常，胞质饱满，细胞排列整齐，细胞核清晰可见。model组大鼠可见左侧脑皮层缺血性坏死，可见大面积软化灶，神经组织坏死液化，神经元核溶解消失，并伴有大量小胶质细胞浸润；海马区ca1区局部锥体细胞核深染浓缩，少数锥体细胞坏死；ca3区局部锥体细胞减少消失呈空洞状，周围可见大量胶质细胞增生浸润；dg区多见神经元或锥体细胞固缩深染，呈三角形或不规则形，核仁不明显；两侧脑胼胝体神经纤维排列疏松紊乱。tst-h组和anw组的脑组织病理改变较model组有明显减轻，皮层中可见神经元胞体缩小，常为三角形，核深染浓缩，核仁与染色质分不清；海马区无明显异常。神经细胞坏死情况有不同程度的改善，存活细胞增多，细胞排列较为整齐，胞质较饱满。结果见图4。
nissl染色结果显示，sham组大鼠切片可见密集排列的蓝染神经元细胞，数量众多，有4～5层，尼式体丰富，且细胞轮廓清晰。而model组大鼠切片则见神经细胞层变薄，密度下降，大部分神经胞体肿胀、变形、坏死，甚至有神经元崩解等情况，尼氏体大量减少。tst-h组和anw组的脑组织病理改变较model组明显减轻，存活细胞数量增多，细胞层排列较为整齐，仅少量锥体细胞减少。结果见图5。
3.6本发明中药组合物对maco大鼠血清lpo、mda以及no水平和sod活性的影响
测量各组大鼠血清lpo、mda以及no水平和sod活性，实验结果显示，与sham组相比，model组大鼠血清lpo、mda水平显著增高(p<0.05)，no水平和sod含量显著降低(p<0.05)。与model组相比，本发明中药组合物高剂量组大鼠血清lpo显著降低(p<0.05)，本发明中药组合物低剂量组和安宫牛黄丸组mda水平显著降低(p<0.05)，本发明中药组合物中、高剂量组和安宫牛黄丸组no水平显著升高(p<0.05)，本发明中药组合物各剂量组和安宫牛黄丸组sod活力显著升高(p<0.05)。结果见图6。
3.7大鼠血清中炎症因子il-1β、tnf-α的含量影响
图7显示，model组血清中il-1β、tnf-α水平显著高于sham组，差异具有统计学意义(p<0.05)，而各给药组大鼠与model组比较，血清中il-1β、tnf-α水平明显降低，差异均具有统计学意义(p<0.05)，本发明中药组合物各剂量组与安宫牛黄丸组比较差异不具有统计学意义。
3.8对大鼠脑组织中bax、bcl-2、cyt-c、nrf2、ho-1、lc-3b蛋白表达的影响
免疫印迹法检测大鼠脑组织中bax、bcl-2、cyt-c、nrf2、ho-1、lc-3b蛋白表达情况，结果见图8。
调控凋亡蛋白bax、bcl-2、cyt-c中，model组脑组织中cyt-c、bax的表达与sham组相比明显增多(p<0.05)，而model组的bcl-2的表达比sham组明显减少(p<0.05)，anw组和tst-h组的cyt-c、bax表达与model组相比，均有显著下调(p<0.05)，而bcl-2的表达则显著增多(p<0.05)。
在氧化应激相关蛋白nrf2、ho-1中，model组与sham组比表达明显增高1倍以上(p<0.05)，而anw组和tst-h组与model组相比表达含量明显降低一倍(p<0.05)。
自噬相关蛋白lc-3bmodel组与比sham组相比明显降低(p<0.05)，而anw组和tst-h组自噬相关蛋白lc-3b的表达含量明显增加(p<0.05)。
3.9tunel染色
利用tunel染色检测神经元凋亡情况。如图9显示，model组tunel阳性神经元的细胞数目明显多于sham组(p＜0.05)，与model组相比，各给药组tunel阳性神经元的细胞数目均明显减少(p＜0.05),尤其是tst-h组和anw组,本发明中药组合物与安宫牛黄丸组比较，差异不具有统计学意义，该结果说明，tst能够减少脑缺血再灌注损伤后凋亡神经元的数量。
3.10免疫荧光
bax蛋白主要位于细胞质和线粒体膜上表达，在本实验中被标记为绿色荧光。如图10a显示，sham组切片仅见极少量免疫荧光表达，偶见阳性细胞。model组可见免疫荧光强度明显增加，阳性细胞数明显增加。各给药组与模型组比较，免疫荧光强度减少，阳性细胞数部分减少，尤其是tst-h组和anw组明显减少。
cyt-c蛋白主要位于线粒体基质中表达，在本实验中被标记为绿色荧光。如图10b显示，sham组切片仅见极少量免疫荧光表达，偶见阳性细胞。model组可见免疫荧光强度明显增加，阳性细胞数明显增加。各给药组与模型组比较，免疫荧光强度减少，阳性细胞数部分减少，尤其是tst-h明显减少。
lc-3b蛋白主要位于细胞质、内膜系统中表达，在本实验中被标记为绿色荧光。如图10c显示，sham组切片见少量免疫荧光表达，偶见阳性细胞。model组未见荧光表达，阳性细胞数极少。各给药组与模型组比较，免疫荧光强度增加，阳性细胞数增多，尤其是tst-h组和anw组明显增多。
4结论
本实验成功建立脑缺血再灌注损伤的大鼠模型，探究本发明中药组合物治疗急性缺血性中风的作用效果。实验结果表明，本发明中药组合物能有效减轻氧化应激对神经细胞的损伤，抑制细胞凋亡，提高自噬活性，从而促进对脑缺血损伤的恢复，提供对神经元细胞的保护。
具体实施方式
实施例1(颗粒剂)
处方：取大黄100g，防风100g，栀子250g，人工牛黄15g，天竺黄100g，厚朴100g，赤芍100g，虎杖150g，合计915g。
制备方法：先将人工牛黄粉碎成细粉，过筛，备用。然后将其余七味药加水热回流提取4小时，过滤，收集滤液，将滤液减压浓缩至60℃下相对密度为1.0-1.2浸膏，然后置于烘箱内于75℃真空干燥成干膏，粉碎成细粉。最后将所得人工牛黄细粉和干膏细粉混合，再加入适量糊精和淀粉至450g，再加水制成颗粒，然后干燥、整粒，分装成15g/包。
实施例2(颗粒剂)
处方：取大黄103g，防风100g，栀子240g，人工牛黄15g，天竺黄96g，厚朴100g，赤芍103g，虎杖158g，合计915g。
制备方法：先将人工牛黄粉碎成细粉，过筛，备用。然后将其余七味药加水热回流提取4小时，过滤，收集滤液，将滤液减压浓缩至60℃下相对密度为1.0-1.2浸膏，然后置于烘箱内于75℃真空干燥成干膏，粉碎成细粉。最后将所得人工牛黄细粉和干膏细粉混合，再加入适量糊精和淀粉至450g，再加水制成颗粒，然后干燥、整粒，分装成15g/包。
实施例3(颗粒剂)
处方：取大黄102g，防风102g，栀子262g，人工牛黄16g，天竺黄100g，厚朴95g，赤芍95g，虎杖143g,合计915g。
制备方法：先将人工牛黄粉碎成细粉，过筛，备用。然后将其余七味药加水热回流提取4小时，过滤，收集滤液，将滤液减压浓缩至60℃下相对密度为1.0-1.2浸膏，然后置于烘箱内于75℃真空干燥成干膏，粉碎成细粉。最后将所得人工牛黄细粉和干膏细粉混合，再加入适量糊精和淀粉至450g，再加水制成颗粒，然后干燥、整粒，分装成15g/包。
实施例4(胶囊剂)
将按照实施例1的方法制备成的药物颗粒，装入明胶胶囊，制成胶囊剂。
实施例5(片剂)
将按照实施例1的方法制备成的药物颗粒，采用常规方法压片，制成片剂。