本发明属于生物医药领域，涉及已知化合物的新用途，具体涉及几种已知化合物用于制备锌指蛋白281抑制剂的用途，分别为alismoxide、ent-spathulenol、4α,10α-aromadendranediol、aromadendrane-4β,10α-diol。
背景技术：
锌指蛋白(zincfingerprotein，zfp)是一类具有手指状结构域的转录因子，最初被发现于非洲爪蟾的卵母细胞中。现已知zfp分布广泛，人类基因组中有约1％的序列编码有锌指结构的蛋白质。锌指蛋白281(znf281)也可称之为zbp-99，其基因位于1号染色体，参与调控胚胎干细胞的分化与组织的发育。znf281还被鉴定与致癌基因c-myc相关(large-scaleidentificationofc-myc-associatedproteinsusingacombinedtap/mudpitapproach.cellcycle.2007)。在结肠癌、胰腺癌和肝癌中，znf281也发挥着重要的作用(snailandmir-34afeed-forwardregulationofznf281/zbp99promotesepithelial-mesenchymaltransition.emboj.2013；znf281/zbp-99:anewplayerinepithelial-mesenchymaltransition,stemness,andcancer.jmolmed.2014；znf281promotesgrowthandinvasionofpancreaticcancercellsbyactivatingwnt/β-cateninsignaling.digdissci.2017；锌指蛋白281对肝癌细胞增殖的影响，中国病理生理杂志，2018；znf281对结直肠癌细胞侵袭与迁移的影响，中国医学前沿杂志，2017)。
可见，锌指蛋白281对多种肿瘤细胞的增殖和转移具有促进作用。抑制锌指蛋白281可以抑制其对肿瘤细胞增殖和侵袭的促进作用。
目前，临床尚没有有效的锌指蛋白281抑制剂。
技术实现要素：
本发明旨在克服现有技术不足，提供几种已知化合物用于制备锌指蛋白281抑制剂的用途，分别为alismoxide、ent-spathulenol、4α,10α-aromadendranediol、aromadendrane-4β,10α-diol。
alismoxide、ent-spathulenol、4α,10α-aromadendranediol、aromadendrane-4β,10α-diol的化学式如下所示。alismoxide最早被文献(terpenoidsofalismaorientalerhizomeandthecrudedrugalismatisrhizoma.phytochemistry,1994)公开。ent-spathulenol最早被文献(threeent-secoaromadendrane-typesesquiterpenehemiacetalsandabicyclogermacrenefromplagiochilaovalifoliaandplagiochilayokogurensis.phytochemistry,1980)公开。4α,10α-aromadendranediol和aromadendrane-4β,10α-diol最早被文献(sesquiterpenelactonesandasesquiterpenediolfromjamaicanambrosiaperuviana.phytochemistry,1987)公开。
本发明包括下面的技术方案：
技术方案a：
alismoxide用于制备锌指蛋白281抑制剂的生物医药用途。
alismoxide用于制备阻止结肠癌细胞增殖的药物的生物医药用途。
alismoxide用于制备阻止结肠癌细胞转移的药物的生物医药用途。
alismoxide用于制备阻止肝癌细胞增殖的药物的生物医药用途。
alismoxide用于制备阻止肝癌细胞转移的药物的生物医药用途。
技术方案b：
ent-spathulenol用于制备锌指蛋白281抑制剂的生物医药用途。
ent-spathulenol用于制备阻止结肠癌细胞增殖的药物的生物医药用途。
ent-spathulenol用于制备阻止结肠癌细胞转移的药物的生物医药用途。
ent-spathulenol用于制备阻止肝癌细胞增殖的药物的生物医药用途。
ent-spathulenol用于制备阻止肝癌细胞转移的药物的生物医药用途。
技术方案c：
4α,10α-aromadendranediol用于制备锌指蛋白281抑制剂的生物医药用途。
4α,10α-aromadendranediol用于制备阻止结肠癌细胞增殖的药物的生物医药用途。
4α,10α-aromadendranediol用于制备阻止结肠癌细胞转移的药物的生物医药用途。
4α,10α-aromadendranediol用于制备阻止肝癌细胞增殖的药物的生物医药用途。
4α,10α-aromadendranediol用于制备阻止肝癌细胞转移的药物的生物医药用途。
技术方案d：
aromadendrane-4β,10α-diol用于制备锌指蛋白281抑制剂的生物医药用途。
aromadendrane-4β,10α-diol用于制备阻止结肠癌细胞增殖的药物的生物医药用途。
aromadendrane-4β,10α-diol用于制备阻止结肠癌细胞转移的药物的生物医药用途。
aromadendrane-4β,10α-diol用于制备阻止肝癌细胞增殖的药物的生物医药用途。
aromadendrane-4β,10α-diol用于制备阻止肝癌细胞转移的药物的生物医药用途。
有益效果：
本发明发现，alismoxide、ent-spathulenol、4α,10α-aromadendranediol、aromadendrane-4β,10α-diol为锌指蛋白281的有效抑制剂，其可以抑制锌指蛋白281在肿瘤细胞中的表达。进一步研究发现，alismoxide、ent-spathulenol、4α,10α-aromadendranediol、aromadendrane-4β,10α-diol可以抑制肿瘤细胞的增殖和迁移，且对肿瘤细胞增殖和迁移能力的抑制程度与对锌指蛋白281的抑制程度呈正相关。因此，可以将alismoxide、ent-spathulenol、4α,10α-aromadendranediol、aromadendrane-4β,10α-diol开发成锌指蛋白281抑制剂。
附图说明
图1为低剂量alismoxide、ent-spathulenol、4α,10α-aromadendranediol、aromadendrane-4β,10α-diol对结肠癌细胞中znf281mrna含量的影响；
图2为高剂量alismoxide、ent-spathulenol、4α,10α-aromadendranediol、aromadendrane-4β,10α-diol对结肠癌细胞中znf281mrna含量的影响；
图3为低剂量alismoxide、ent-spathulenol、4α,10α-aromadendranediol、aromadendrane-4β,10α-diol对肝癌细胞中znf281mrna含量的影响；
图4为高剂量alismoxide、ent-spathulenol、4α,10α-aromadendranediol、aromadendrane-4β,10α-diol对肝癌细胞中znf281mrna含量的影响；
图5为低剂量alismoxide、ent-spathulenol、4α,10α-aromadendranediol、aromadendrane-4β,10α-diol对结肠癌细胞中znf281蛋白含量的影响；
图6为高剂量alismoxide、ent-spathulenol、4α,10α-aromadendranediol、aromadendrane-4β,10α-diol对结肠癌细胞中znf281蛋白含量的影响；
图7为低剂量alismoxide、ent-spathulenol、4α,10α-aromadendranediol、aromadendrane-4β,10α-diol对肝癌细胞中znf281蛋白含量的影响；
图8为高剂量alismoxide、ent-spathulenol、4α,10α-aromadendranediol、aromadendrane-4β,10α-diol对肝癌细胞中znf281蛋白含量的影响；
图9为低剂量alismoxide、ent-spathulenol、4α,10α-aromadendranediol、aromadendrane-4β,10α-diol对结肠癌细胞增殖能力的影响；
图10为高剂量alismoxide、ent-spathulenol、4α,10α-aromadendranediol、aromadendrane-4β,10α-diol对结肠癌细胞增殖能力的影响；
图11为低剂量alismoxide、ent-spathulenol、4α,10α-aromadendranediol、aromadendrane-4β,10α-diol对肝癌细胞增殖能力的影响；
图12为高剂量alismoxide、ent-spathulenol、4α,10α-aromadendranediol、aromadendrane-4β,10α-diol对肝癌细胞增殖能力的影响；
图13为低剂量alismoxide、ent-spathulenol、4α,10α-aromadendranediol、aromadendrane-4β,10α-diol对结肠癌细胞迁移能力的影响；
图14为高剂量alismoxide、ent-spathulenol、4α,10α-aromadendranediol、aromadendrane-4β,10α-diol对结肠癌细胞迁移能力的影响；
图15为低剂量alismoxide、ent-spathulenol、4α,10α-aromadendranediol、aromadendrane-4β,10α-diol对肝癌细胞迁移能力的影响；
图16为高剂量alismoxide、ent-spathulenol、4α,10α-aromadendranediol、aromadendrane-4β,10α-diol对肝癌细胞迁移能力的影响。
具体实施方式
下面结合附图和实施例具体介绍本发明内容。
实施例1：对锌指蛋白281的抑制作用
一、实验材料
人结肠癌细胞caco-2和人肝癌细胞hepg2购自中国科学院上海生化与细胞所细胞库。
dmem培养液购自美国gibco公司，胎牛血清购自以色列bioind公司。
alismoxide、ent-spathulenol、4α,10α-aromadendranediol、aromadendrane-4β,10α-diol自制，纯度均在98％以上，干燥保存。
二、实验方法
1、细胞培养
人结肠癌细胞caco-2、人肝癌细胞hepg2分别培养于含有10％胎牛血清、10000u/ml青霉素、10000u/ml链霉素的dmem培养基中，置37℃、5％co2(相对湿度90％)的培养箱中培养。收集对数期细胞用于后续实验。
2、分组干预
人结肠癌细胞caco-2、人肝癌细胞hepg2均分别分为：
对照组：不含药的培养基培养；
alismoxide组：又分为低浓度组(5μm)和高浓度组(10μm)，用含有不同浓度(5μm或10μm)alismoxide的培养基培养；
ent-spathulenol组：又分为低浓度组(5μm)和高浓度组(10μm)，用含有不同浓度(5μm或10μm)ent-spathulenol的培养基培养；
4α,10α-aromadendranediol组：又分为低浓度组(5μm)和高浓度组(10μm)，用含有不同浓度(5μm或10μm)4α,10α-aromadendranediol的培养基培养；
aromadendrane-4β,10α-diol组：又分为低浓度组(5μm)和高浓度组(10μm)，用含有不同浓度(5μm或10μm)aromadendrane-4β,10α-diol的培养基培养。
3、znf281mrna含量测定
按照上述分组干预方法对细胞培养48h，收集细胞。按trizol试剂盒(gibco公司)说明提取总rna，用逆转录试剂盒(takara公司)逆转录cdna，使用sybrgreeenⅰ荧光pcr扩增znf281和内参对照β-actin。引物序列如下。扩增条件：先94℃预变性5min，然后94℃变性15s，58℃退火30s，72℃延伸45s，循环35次。
znf281上游引物：5’-agcaccaccgtgacgtatta-3’
znf281下游引物：5’-agatgcacttggcttcctct-3’
β-actin上游引物：5’-ttcctccctggagaagag-3’
β-actin下游引物：5’-tgccacaggattccatac-3’
4、znf281蛋白含量测定
按照上述分组干预方法对细胞培养48h，收集细胞。加入细胞裂解液提取细胞总蛋白，bca法测定蛋白浓度。取总蛋白20μg制备蛋白样品变性上样，于8％～10％sds-page胶上电泳，pvdf转膜，膜封闭1.5h后，在孵育盒中加一抗(抗znf281抗体购于sigma，小鼠源抗β-actin抗体)4℃孵育过夜。tbst洗膜，加二抗(hrp标记的羊抗鼠抗体)，室温孵育1.5h。tbst洗膜，用化学发光法曝光显影，胶片扫描后，用imagej软件行灰度值分析。以znf281蛋白与内参β-actin蛋白灰度值的比值表示蛋白的相对含量。
5、数据处理
采用spss17.0软件处理数据。one-wayanova分析用于比较不同处理组细胞之间的差异。数据采用均值±标准差表示。以p＜0.05为差异具有统计学意义。
三、实验结果
1、alismoxide、ent-spathulenol、4α,10α-aromadendranediol、aromadendrane-4β,10α-diol对不同肿瘤细胞中znf281mrna含量的影响
与对照组相比，alismoxide、ent-spathulenol、4α,10α-aromadendranediol、aromadendrane-4β,10α-diol组肿瘤细胞中znf281mrna含量显著降低(p＜0.05)，且呈剂量依赖性。
结果如表1～4和图1～4所示。
表1低剂量药物对结肠癌细胞中znf281mrna含量的影响
表2高剂量药物对结肠癌细胞中znf281mrna含量的影响
表3低剂量药物对肝癌细胞中znf281mrna含量的影响
表4高剂量药物对肝癌细胞中znf281mrna含量的影响
2、alismoxide、ent-spathulenol、4α,10α-aromadendranediol、aromadendrane-4β,10α-diol对不同肿瘤细胞中znf281蛋白含量的影响
与对照组相比，alismoxide、ent-spathulenol、4α,10α-aromadendranediol、aromadendrane-4β,10α-diol组肿瘤细胞中znf281蛋白含量显著降低(p＜0.05)，且呈剂量依赖性。
结果如表5～8和图5～8所示。
表5低剂量药物对结肠癌细胞中znf281蛋白含量的影响
表6高剂量药物对结肠癌细胞中znf281蛋白含量的影响
表7低剂量药物对肝癌细胞中znf281蛋白含量的影响
表8高剂量药物对肝癌细胞中znf281蛋白含量的影响
实施例2：对肿瘤细胞增殖和迁移能力的抑制
一、实验材料
人结肠癌细胞caco-2和人肝癌细胞hepg2购自中国科学院上海生化与细胞所细胞库。
dmem培养液购自美国gibco公司，胎牛血清购自以色列bioind公司。
alismoxide、ent-spathulenol、4α,10α-aromadendranediol、aromadendrane-4β,10α-diol自制，纯度均在98％以上，干燥保存。
二、实验方法
1、细胞培养
人结肠癌细胞caco-2、人肝癌细胞hepg2分别培养于含有10％胎牛血清、10000u/ml青霉素、10000u/ml链霉素的dmem培养基中，置37℃、5％co2(相对湿度90％)的培养箱中培养。收集对数期细胞用于后续实验。
2、分组干预
人结肠癌细胞caco-2、人肝癌细胞hepg2均分别分为：
对照组：不含药的培养基培养；
alismoxide组：又分为低浓度组(5μm)和高浓度组(10μm)，用含有不同浓度(5μm或10μm)alismoxide的培养基培养；
ent-spathulenol组：又分为低浓度组(5μm)和高浓度组(10μm)，用含有不同浓度(5μm或10μm)ent-spathulenol的培养基培养；
4α,10α-aromadendranediol组：又分为低浓度组(5μm)和高浓度组(10μm)，用含有不同浓度(5μm或10μm)4α,10α-aromadendranediol的培养基培养；
aromadendrane-4β,10α-diol组：又分为低浓度组(5μm)和高浓度组(10μm)，用含有不同浓度(5μm或10μm)aromadendrane-4β,10α-diol的培养基培养。
3、细胞增殖抑制率的测定
采用mtt法。将细胞按5×104/ml接种于96孔板。待细胞贴壁后，按上述进行分组处理。另设空白对照组，仅加入细胞培养液。培养48h后，分别加入5mg/mlmtt，继续孵育4h。吸净上清液后加入dmso，置恒温振荡箱中，37℃振荡10min。在全自动酶标仪上，于490nm波长处测定各孔光密度od值，计算各组细胞增殖抑制率。细胞增殖抑制率＝[1－(给药组od值－空白对照组od值)/(对照组od值－空白对照组od值)]×100％。
4、细胞迁移能力的测定
采用划痕法。将对数生长期的肿瘤细胞，制成细胞悬液，以8×105/孔的细胞数接种6孔板，直至形成单层，用tip吸头沿培养板底部呈“一”字形划痕。按照上述分组方法用含有不同浓度药物和10％胎牛血清的dmem培养液替换原培养液，并加丝裂霉素c至1μg/ml抑制细胞分裂，24h后每2h观察1次，直至划痕被细胞填满。以过河所需时间作为观察指标，计算各组细胞迁移抑制率。计算公式如下：
细胞迁移抑制率＝(给药组过河时间-对照组过河时间)/对照组过河时间×100％。
5、数据处理
采用spss17.0软件处理数据。one-wayanova分析用于比较不同处理组细胞之间的差异。数据采用均值±标准差表示。以p＜0.05为差异具有统计学意义。
三、实验结果
1、alismoxide、ent-spathulenol、4α,10α-aromadendranediol、aromadendrane-4β,10α-diol对不同肿瘤细胞的增殖抑制作用
与对照组相比，alismoxide、ent-spathulenol、4α,10α-aromadendranediol、aromadendrane-4β,10α-diol组肿瘤细胞增殖能力显著降低(p＜0.05)，且呈剂量依赖性。
结果如表9～12和图9～12所示。
表9低剂量药物对结肠癌细胞增殖能力的影响
表10高剂量药物对结肠癌细胞增殖能力的影响
表11低剂量药物对肝癌细胞增殖能力的影响
表12高剂量药物对肝癌细胞增殖能力的影响
2、alismoxide、ent-spathulenol、4α,10α-aromadendranediol、aromadendrane-4β,10α-diol对不同肿瘤细胞迁移能力的抑制作用
与对照组相比，alismoxide、ent-spathulenol、4α,10α-aromadendranediol、aromadendrane-4β,10α-diol组肿瘤细胞迁移能力显著降低(p＜0.05)，且呈剂量依赖性。
结果如表13～16和图13～16所示。
表13低剂量药物对结肠癌细胞迁移能力的影响
表14高剂量药物对结肠癌细胞迁移能力的影响
表15低剂量药物对肝癌细胞迁移能力的影响
表16高剂量药物对肝癌细胞迁移能力的影响
本发明发现，本发明发现，alismoxide、ent-spathulenol、4α,10α-aromadendranediol、aromadendrane-4β,10α-diol为锌指蛋白281的有效抑制剂，其可以抑制锌指蛋白281在肿瘤细胞中的表达。进一步研究发现，alismoxide、ent-spathulenol、4α,10α-aromadendranediol、aromadendrane-4β,10α-diol可以抑制肿瘤细胞的增殖和迁移，且对肿瘤细胞增殖和迁移能力的抑制程度与对锌指蛋白281的抑制程度呈正相关。因此，可以将alismoxide、ent-spathulenol、4α,10α-aromadendranediol、aromadendrane-4β,10α-diol开发成锌指蛋白281抑制剂。
本发明保护范围不局限于上述实施例的具体内容。