一种补骨脂有效部位及其制备方法和应用与流程

本发明涉及一种补骨脂有效部位及其制备方法和应用，属于医药
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：抑郁症(depression)是由多种原因引起的，以抑郁为主要症状的一组心境障碍或情感性障碍，以抑郁心境自我体验为中心的临床症候群或状态，以显著而持久的心境低落为主要特征的慢性综合征。抑郁症通常表现为长时间情绪低落或悲痛欲绝，对日常生活丧失兴趣，精神萎靡不振，食欲减退，严重者甚至出现自杀等极端自残的行为，已成为严重威胁了人类身心健康的世界致残性疾病，预测其患病率至2020年将仅次于缺血性心脏病位居第2位。目前对于抑郁症的治疗，临床用药主要集中于一代的三环类抑郁药和单胺氧化酶抑制剂及二代的5-羟色胺再摄取抑制剂和5-羟色胺、去甲肾上腺素再摄取抑制剂，如氟西汀、文拉法辛等。但这些药物临床有效率在60％左右，服药后需较长时间才能达到最佳疗效，并且这些药物在长期服用后会出现严重的毒副作用，如马普替林和米安舍林容易诱发癫痫，服用氟西汀常存在胃肠道反应等毒副作用。由此可见，西药对于抑郁症的治疗会引发多种身体及心理上的痛苦，因此寻求一种天然安全的治疗药物已迫在眉睫。补骨脂又称破故纸，为豆科植物补骨脂(psoraleacorylifolial.)的干燥成熟果实，表面呈黑色、黑褐色或灰褐色，质硬，有油性，气香，味辛、微苦。作为常用补益类中药，补骨脂具有温肾助阳、温脾止泻、纳气平喘的作用。补骨脂始载于《雷公炮炙论》，主要生长分布于山西、安徽、江西、河南、湖北、广东、四川、贵州、云南等地。研究发现，补骨脂的提取物和相关成分具有抗肿瘤、抗炎、抗氧化及抗抑郁等多种药理作用，目前补骨脂在临床应用中主要用于治疗女性更年期、骨质疏松及白癜风等疾病。补骨脂的主要成分有香豆素类、黄酮类、异黄酮类和单萜酚类化合物。药理实验表明：补骨脂具有抗抑郁活性，且据研究报道其中所含的黄酮类成分(中国专利cn201410416292.7补骨脂二氢黄酮和补骨脂查尔酮类成分在抗抑郁药物制备中的应用)、补骨脂定(neuropsychopharmacologyandbiologicalpsychiatry，32，2008，510–519)和补骨脂酚(中国专利200610027643.0补骨脂酚类化合物的应用)为此药理活性的物质基础。然而，相关研究表明：补骨脂具有肝脏毒性，大鼠口服给予1.875、1.25和0.625g/kg补骨脂醇提物后，肝脏发生胆汁淤积型的肝脏损伤，相关胆汁合成和转运酶受到破坏，其毒性呈性别依赖性，补骨脂更易造成雌性大鼠肝脏损伤，且其损伤机制与胆汁酸的代谢异常作用和转化抑制有关(jethnopharmacol，144(1)，2012，73-81)。对补骨脂主要毒性成分引起肝毒性的机制研究发现：补骨脂中补骨脂素、异补骨脂素等香豆素成分可造成肝脏毒性，香豆素成分可通过影响肝微粒体p450，造成转氨酶升高引起肝脏损伤(toxicollett，209(1)，2012，67-77)。有临床报道发现，补骨脂可造成胆汁淤积型肝脏损伤(clintoxicol，43(6),589-591)。近期对补骨脂非香豆素成分的活性进行研究逐步增多，例如：中国专利cn101217968a提出了一种补骨脂酚的组合及其制备方法，具体制备方法是：取补骨脂，在70℃下用石油醚提取，再使用硅胶或cg-161树脂去除呋喃香豆素，分离得到补骨脂酚；中国专利cn101406513a提出补骨脂提取物、含有它的药物组合及其制备方法和用途，具体制备方法是：补骨脂药材经过60～95％乙醇提取，再依次用30％乙醇和95％乙醇洗脱，进过大孔树脂用30％和95％乙醇洗脱纯化，得到不含香豆素类的提取物，可用于更年期综合征的治疗用途。有研究表明补骨脂酚262.5mg/kg给予大鼠6周可引起胆汁转运酶减少，间接造成胆汁淤积(phytotherapyresearchptr，2017，31(8)，1265–1272)，因此补骨脂酚也具有潜在肝脏毒性，其在有效部位中的含量也应得到控制。但至今未见关于补骨脂黄酮、补骨脂定及补骨脂酚该有效部位的急性毒性和肝脏毒性的研究报道及毒性降低后该部位的药用价值的研究报道。技术实现要素：针对现有技术存在的上述问题，本发明的目的是提供一种补骨脂有效部位及其制备方法和应用，以拓宽补骨脂的临床应用。本发明所述的补骨脂有效部位，是由补骨脂的醇提物先依次经过大孔树脂和聚酰胺树脂纯化后再加水混悬，然后用石油醚萃取所得到的混悬液而得到，该有效部位含有补骨脂定、补骨脂黄酮和补骨脂酚，且含有的补骨脂酚的质量百分比≤3％。作为优选方案，所述补骨脂有效部位中不含有补骨脂素、异补骨脂素、补骨脂素苷和异补骨脂素苷。作为优选方案，所述补骨脂有效部位中补骨脂酚的质量百分比为1～3％。作为优选方案，所述补骨脂有效部位中含有补骨脂定、补骨脂总黄酮和补骨脂酚的总的质量百分比≥21％。本发明所述的补骨脂有效部位的制备方法，包括如下具体步骤：a)取补骨脂药材，用乙醇提取，得补骨脂的醇提物；b)将补骨脂的醇提物上大孔吸附树脂柱，以乙醇和水的混合溶液进行梯度洗脱，收集目标流份，减压浓缩，得补骨脂的大孔树脂提取物；c)将补骨脂的大孔树脂提取物上聚酰胺树脂柱，以乙醇和水的混合溶液进行梯度洗脱，收集目标流份，减压浓缩，得补骨脂的聚酰胺树脂提取物；d)将补骨脂的聚酰胺树脂提取物加水混悬，得混悬液；e)用石油醚萃取所得混悬液，弃去有机相，对水相浓缩干燥，即得所述补骨脂有效部位。作为优选方案，步骤a)包括如下操作：将补骨脂药材粉粹后用以70％乙醇水溶液回流提取1～3次，每次提取时间为1～2小时，合并提取液，过滤，滤液减压浓缩至无乙醇味，即得补骨脂的醇提物。作为进一步优选方案，每次提取，加入的乙醇水溶液的重量为补骨脂药材重量的5～15倍。作为优选方案，步骤b)中补骨脂的醇提物上大孔吸附树脂柱后，先用7～8倍柱体积的水洗脱(流速为1～2bv/h)，弃去洗脱液；再用5～6倍柱体积的95v％乙醇水溶液洗脱(流速为1～2bv/h)，收集洗脱液，减压浓缩，得补骨脂的大孔树脂提取物。作为优选方案，步骤b)中大孔吸附树脂柱分离纯化时，大孔吸附树脂柱材与补骨脂的醇提物的质量比为5：1～10：1。作为优选方案，步骤c)中补骨脂的大孔树脂提取物上聚酰胺树脂柱后，先用15～20倍柱体积的10～15v％的乙醇水溶液洗脱(流速为1～2bv/h)，弃去洗脱液；再用2～3倍柱体积的95v％乙醇水溶液洗脱(流速为1～2bv/h)，收集洗脱液，减压浓缩，得补骨脂的聚酰胺提取物。作为优选方案，步骤c)中聚酰胺柱分离纯化时，聚酰胺柱材与补骨脂的大孔树脂提取物的质量比为5：1～10：1。作为进一步优选方案，步骤c)中聚酰胺柱选用60-100目和/或100-200目的聚酰胺柱材。本发明所述的补骨脂有效部位的应用，是指以所述的补骨脂有效部位作为活性成分用于制备抗抑郁的药物或保健品。本发明所述的药物可以各种给药途径给予患者，包括但不限于口服、透皮、肌肉、皮下和静脉注射。本发明所述的药物的剂型不限，只要是能够使活性成分有效地到达体内的剂型都可以，包括：片剂、糖衣片剂、薄膜衣片剂、肠溶衣片剂、胶囊剂、硬胶囊剂、软胶囊剂、口服液、口含剂、颗粒剂、冲剂、丸剂、散剂、膏剂、丹剂、混悬剂、粉剂、溶液剂、注射剂、栓剂、软膏剂、硬膏剂、霜剂、喷雾剂、滴剂、贴剂等；优选口服剂型，如：胶囊剂、片剂、口服液、颗粒剂、丸剂、散剂、丹剂、膏剂等。所述的口服剂型可含有常用的赋形剂，诸如粘合剂、填充剂、稀释剂、压片剂、润滑剂、崩解剂、着色剂、调味剂和湿润剂，必要时可对片剂进行包衣。适宜的填充剂包括纤维素、甘露糖醇、乳糖和其它类似的填充剂；适宜的崩解剂包括淀粉、聚乙烯吡咯烷酮和淀粉衍生物，例如羟基乙酸淀粉钠；适宜的润滑剂包括，例如硬脂酸镁；适宜的药物可接受的湿润剂包括十二烷基硫酸钠。与现有技术相比，本发明具有如下显著性有益效果：1、经测试分析：本发明提供的补骨脂有效部位中含有补骨脂定、补骨脂黄酮和补骨脂酚，且含有补骨脂酚的质量百分比≤3％，相对于现有的补骨脂提取物，本发明提供的补骨脂有效部位基本无肝脏和肾脏毒性，安全性得到了显著性提高；2、经药物实验表明：本发明提供的补骨脂有效部位不仅具有显著的抗抑郁作用，并且安全低毒，因此可望用于制备抗抑郁的药物和保健品，相对于现有技术，取得了显著性进步和出乎意料的效果，对研究开发具有临床应用价值的补骨脂药物制剂具有重要意义；3、另外，本发明的制备方法简单，分离量大，生产效率高，使用的石油醚、乙醇等溶剂可回收，且得率较高，适用于规模化生产，具有工业应用价值。附图说明图1是实施例1中补骨脂的醇提物的hplc色谱图；图2是实施例1中补骨脂有效部位的hplc色谱图；图3是实施例4中补骨脂有效部位56天给药后小鼠的组织结构图；其中，图3a是小鼠心的组织结构图，图3b是小鼠肝的组织结构图，图3c是小鼠脾的组织结构图，图3d是小鼠肺的组织结构图，图3e是小鼠肾的组织结构图。具体实施方式下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。实施例1：补骨脂有效部位的制备a)将补骨脂药材粉粹后，用70v％的乙醇水溶液回流提取3次，每次提取时间为1～2小时，每次提取加入的乙醇水溶液的重量是补骨脂药材的重量的10倍，合并提取液，过滤，滤液减压浓缩至无乙醇味，得补骨脂的醇提物；b)将补骨脂的醇提物上大孔吸附树脂柱(大孔吸附树脂与补骨脂的醇提物质量比为6:1)，先用8倍柱体积的水洗脱(流速为1.5bv/h)，弃去洗脱液；再用6倍柱体积的95v％乙醇水溶液洗脱(流速为1.5bv/h)，收集洗脱液，减压浓缩，得补骨脂的大孔树脂提取物；c)将补骨脂的大孔树脂提取物上聚酰胺树脂柱(聚酰胺树脂与补骨脂的大孔树脂提取物的质量比为6:1，其中聚酰胺树脂为100-200目与60-100目的聚酰胺树脂按照质量比1:2比例混合而得)，先用18倍柱体积的13v％的乙醇水溶液洗脱(流速为1.5bv/h)，弃去洗脱液；再用3倍柱体积的95v％乙醇水溶液洗脱(流速为1.5bv/h)，收集洗脱液，减压浓缩，得补骨脂的聚酰胺树脂提取物；d)将补骨脂的聚酰胺树脂提取物加水混悬(加入的水的重量是补骨脂的聚酰胺提取物的重量的10倍)，得混悬液；e)所得混悬液用石油醚等体积萃取，弃去有机相，对水相浓缩干燥，即得所述补骨脂有效部位(产率为10.2％)。以补骨脂素、异补骨脂素、补骨脂定、补骨脂二氢黄酮甲醚、补骨脂二氢黄酮、补骨脂宁、补骨脂酚为对照品，通过高效液相色谱法(hplc)分别对制备的补骨脂的醇提物和补骨脂有效部位中主要成分进行测定。测试结果如图1和图2所示。图1是本实施例中的补骨脂的醇提物的hplc色谱图，从图1可见，补骨脂药材经乙醇提取后制得的补骨脂的醇提物中含有大量的有毒成分补骨脂酚，同时还含有大量的香豆素类有毒成分：补骨脂素、异补骨脂素、补骨脂素苷和异补骨脂素苷。图2是本实施例制备得到的补骨脂有效部位的hplc色谱图，从图2可见，本实施例制备得到的补骨脂有效部位主要含有补骨脂定、补骨脂黄酮(包括补骨脂二氢黄酮、补骨脂宁、补骨脂二氢黄酮甲醚)，补骨脂酚的含量显著降低，具体的说：补骨脂有效部位中补骨脂定的含量为4.98wt％；补骨脂二氢黄酮的含量为5.28wt％，补骨脂宁的含量为1.73wt％，补骨脂二氢黄酮甲醚的含量为7.98wt％；补骨脂酚的含量为2.35wt％；潜在毒性成分补骨脂酚的含量显著降低；同时，从图2可见，本实施例制备得到的补骨脂有效部位中不含毒性成分：补骨脂素、异补骨脂素、补骨脂素苷和异补骨脂素苷。实施例2：补骨脂有效部位对行为绝望小鼠体内试验试验目的：考察补骨脂有效部位对行为绝望小鼠的抗抑郁作用供试品：实施例1所得补骨脂有效部位。阳性对照品：盐酸氟西汀胶囊，patheonfrance(法国)公司产，批号7299ac；文拉法辛，pfizerirelandpharmaceuticals(美国)公司产，批号r11422f。试验动物：icr种小鼠，体重20～22g，雌性，由上海斯莱克实验动物有限公司提供，实验动物生产许可证号：scxk(沪)2012-0002。组别及给药设置如表1所示。表1组别及给药设置组别动物数量(只)给药剂量(mg/kg)阴性对照(溶剂用纯水)10/氟西汀1020文拉法辛1020补骨脂有效部位高剂量1060补骨脂有效部位中剂量1030补骨脂有效部位低剂量1015各给药组适应环境7天后，连续给药5天，末次给药后1小时后进行行为绝望试验，实验过程应避免外界干扰，保持室内整洁安静，每只动物结束实验后彻底清洁实验用具再进行下一只动物实验，避免组内或/和组间干扰，具体实验如下：(1)强迫游泳实验末次给药后1小时，将小鼠单独置于直径20cm，水深20cm，水温25℃的玻璃容器中，强迫游泳，烧杯周围用隔板隔开，保持实验过程安静，全程视频记录，记录6分钟内后4分钟内小鼠的不动时间，实验结果如表2所示。表2补骨脂有效部位对小鼠游泳不动时间的影响(n＝10)表中，与阴性对照组比较，*p<0.05，**p<0.01，与文拉法辛组比较，#p<0.05。由表2可见：与对照组相比，本发明的补骨脂有效部位能显著缩短绝望模型小鼠的游泳不动时间(p<0.05)，且具有浓度依赖性；说明本发明的补骨脂有效部位具有显著的抗抑郁活性。(2)悬尾应激实验末次给药后1小时，将小鼠尾部距离尾尖部2cm处固定，使小鼠倒悬于支架上，头部距离底部5cm，周围用隔板隔开，保持实验过程安静，全程视频记录，记录6分钟内后4分钟内小鼠的不动时间，实验结果如表3所示。表3补骨脂有效部位对小鼠悬尾不动时间的影响(n＝10)组别剂量(mg/kg)不动时间(s)阴性对照0107.80±14.75氟西汀2057.80±12.50**文拉法辛2070.20±10.64*补骨脂有效部位高剂量6042.20±10.52**#补骨脂有效部位中剂量3056.00±12.51*补骨脂有效部位低剂量1558.80±6.42*表中，与阴性对照组比较，*p<0.05，**p<0.01，与文拉法辛组比较，#p<0.05。由表3可见：与对照组相比，本发明的补骨脂有效部位能显著缩短绝望模型小鼠的悬尾不动时间(p<0.05)，且具有浓度依赖性；说明本发明的补骨脂有效部位具有显著的抗抑郁活性。实施例3：对小鼠脑内海马组织及血清中五羟色胺(5-ht)含量的测定实验目的：测定小鼠海马组织及血清中5-ht含量测定供试品及阳性对照品：同实施例2实验动物：同实施例2实验步骤：实施例2中的小鼠强迫游泳实验结束1小时后，摘眼球取血，拖颈处死小鼠，于冰台上分离脑组，取海马组织，称重后加入10倍体积生理盐水，匀浆，10000rpm离心1分钟，取上清备用，血液经4000rpm离心10分钟，取血清，上述海马组织离心后上清液及血清，采用elisa法测定5-ht含量，实验结果见表4和表5所示。表4补骨脂有效部位对小鼠脑内海马5-ht的影响(n＝10)组别剂量(mg/kg)5-ht(ng/ml)阴性对照052.58±7.85氟西汀2058.75±10.14*文拉法辛2058.75±6.91*补骨脂有效部位高剂量6071.83±8.09*补骨脂有效部位中剂量3059.30±8.81*补骨脂有效部位低剂量1560.54±6.10*表中，与阴性对照组比较，*p<0.05。由表4可见：与对照组相比，本发明的补骨脂有效部位能显著提高小鼠脑内海马部的5-ht含量(p<0.05)，说明本发明的补骨脂有效部位具有显著的抗抑郁活性。表5补骨脂有效部位对小鼠血清5-ht的影响(n＝10)组别剂量(mg/kg)5-ht(ng/ml)阴性对照042.61±14.78氟西汀2049.81±19.04*文拉法辛2047.09±13.93*补骨脂有效部位高剂量6058.54±10.27*补骨脂有效部位中剂量3043.72±16.54补骨脂有效部位低剂量1544.64±7.71表中，与阴性对照组比较，*p<0.05，**p<0.01。由表5可见：与对照组相比，本发明的补骨脂有效部位高剂量能显著提高小鼠血清中的5-ht含量(p<0.05)，说明本发明的补骨脂有效部位具有显著的抗抑郁活性。实施例4：小鼠56天给药亚慢性毒性试验试验目的：对补骨脂有效部位初步安全性评价供试品：实施例1制备的补骨脂有效部位。试验动物：icr种小鼠，体重20～22g，雌性，由上海斯莱克实验动物有限公司提供，实验动物生产许可证号：scxk(沪)2012-0002。试验方法：各给药组适应环境7天后，连续给药56天，给药分组及剂量如表6所示，每周记录体重变化，末次给药后24小时后眼眶取血进行生化检测，取心、肝、脾、肺、肾进行组织病理学检查，其中肝脏、肾脏称取重量，计算脏器指数，实验结果如图3及表7至表9所示。表6补骨脂有效部位56天给药分组及剂量组别动物数量(只)剂量(mg/kg)阴性对照组100补骨脂有效部位10300表7补骨脂有效部位56天给药体重变化(n＝10)给药天数(天)阴性对照组(克)补骨脂有效部位组(克)120.93±0.9521.00±0.72321.98±1.6822.80±1.27524.15±3.1128.35±3.19726.75±1.9629.05±1.851429.00±2.2331.48±2.172130.23±2.6132.53±2.512832.03±2.1432.35±2.603530.35±2.8532.85±2.684229.95±3.3733.23±3.674930.00±2.5834.10±3.275630.13±3.0634.30±3.34表8补骨脂有效部位56天给药肝脏、肾脏指数变化(n＝10)组别肝脏指数(％)肾脏指数(％)阴性对照组5.35±0.571.52±0.26补骨脂有效部位组4.29±0.771.24±0.16表9补骨脂有效部位56天给药后生化指标变化(n＝10)图3是补骨脂有效部位56天给药后小鼠的组织结构图；其中，图3a是小鼠心的组织结构图，图3b是小鼠肝的组织结构图，图3c是小鼠脾的组织结构图，图3d是小鼠肺的组织结构图，图3e是小鼠肾的组织结构图。综合表7至表9以及图3可见：给予补骨脂有效部位300mg/kg56天后，小鼠体重逐渐增加，与阴性对照组相比无明显差异；肝脏及肾脏脏器指数与阴性对照组相比无显著性差异；生化指标中相关转氨酶(alt、ast、alp)，胆红素(tbil)未见明显升高，肌酐、尿素(urea、crea)等指标也与阴性对照组无显著性差异；心(图3a)、肝(图3b)、脾(图3c)、肺(图3d)、肾(图3e)组织结构完整，未见明显的炎症、坏死及变形等异常改变；说明，本发明通过彻底除去补骨脂有效部位中的香豆素类及其糖苷成分，合理控制补骨脂有效部位中的补骨脂酚的含量，明显降低了毒性，相对于现有技术，取得了显著性进步，对研究开发具有临床应用价值的补骨脂药物制剂具有重要意义。综上实验可见：本发明制备的补骨脂有效部位不含补骨脂素、异补骨脂素、补骨脂素苷和异补骨脂素苷，并控制补骨脂有效部位中补骨脂酚的含量，该有效部位具有显著的抗抑郁性作用，同时对小鼠初步的毒理学试验表明该有效部位未见明显的毒性反应，相对于现有技术，取得了显著性进步和出乎意料的效果，对研究开发具有临床应用价值的补骨脂药物制剂具有重要意义；并且，所述制备方法简单、得率高，易于实现规模化生产，对促进补骨脂的广泛应用具有重要意义。最后需要在此指出的是：以上仅是本发明的部分优选实施例，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域的技术人员根据本发明的上述内容做出的一些非本质的改进和调整均属于本发明的保护范围。当前第1页12