一种表没食子儿茶素没食子酸酯纳米缓释制剂及其制备方法与流程

本发明涉及一种表没食子儿茶素没食子酸酯纳米缓释制剂及其制备方法。

背景技术：

表没食子儿茶素没食子酸酯((-)-epigallocatechin-3-o-gallate，egcg)是从绿茶中分离得到的儿茶素类单体物质，其含量占茶多酚的50％左右，有研究显示表没食子儿茶素没食子酸酯的生物活性和药理作用都比较强。近年来，随着对儿茶素的研究越来越广泛，表没食子儿茶素没食子酸酯的也在不断的深入，由于它具有它抗衰老、抗癌、抗炎，抗氧化抗清除自由基等药理作用，目前已经在生物医学、保健、食品工业、日用化工等领域究中表现出十分重要的作用，应用前景将会十分可观。

但是表没食子儿茶素没食子酸酯性质很不稳定，容易受光、氧、温度、ph等外界因素的影响而发生变化，表没食子儿茶素没食子酸酯容易被降解，其生物利用率极低。纳米药物技术已被广泛运用，与传统的药物相比，具有更高的生物利用率、溶解性、靶向性，能提高药物的药效，是医学研究的前沿和热点。近年来，也已经有许多研究者已经制备了表没食子儿茶素没食子酸酯纳米制剂，如壳聚糖包裹表没食子儿茶素没食子酸酯纳米粒，β-球蛋白包裹表没食子儿茶素没食子酸酯纳米粒，硫化镉包裹表没食子儿茶素没食子酸酯纳米粒，这些包裹材料所形成的纳米粒表没食子儿茶素没食子酸酯纳米粒的粒径比较大，粒径粘连，不稳定，且制备的制剂不能口服，还有包裹材料具有毒性(如金属材料)或者载体材料昂贵，并且他们的制备工艺复杂，制备条件要求苛刻和制备过程可能产生有毒有害物质等不足。这些严格限制了他们的应用。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是提供一种无毒无害，生物相容性好，生物降解性好的表没食子儿茶素没食子酸酯纳米缓释制剂及其制备方法。

为了解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：一种表没食子儿茶素没食子酸酯纳米缓释制剂，包括被包裹药物表没食子儿茶素没食子酸酯和包裹材料聚氰基丙烯酸正丁酯。

进一步地，所述表没食子儿茶素没食子酸酯纳米缓释制剂的粒径为30～40纳米。

进一步地，所述表没食子儿茶素没食子酸酯纳米缓释制剂的包封率为70.73～80.15％。

本发明提供一种上述表没食子儿茶素没食子酸酯纳米缓释制剂的制备方法，包括以下步骤：

(1)原料配制

配制油相原料：在乙酸乙酯中分散α-氰基丙烯酸正丁酯；

配制乳化相原料：在超纯水中分散乳化剂和稳定剂；

(2)聚合反应

聚合反应选用界面聚合反应或乳化聚合反应；

界面聚合反应的过程为：将表没食子儿茶素没食子酸酯加入到油相原料中，得到混合物ⅰ，然后将混合物ⅰ逐渐加入到乳化相原料中进行界面聚合反应；

乳化聚合反应的过程为：将表没食子儿茶素没食子酸酯加入到乳化相原料中，得到混合物ⅱ，然后将油相原料逐渐加入到混合物ⅱ中进行乳化聚合反应。

进一步地，所述乳化剂为泊洛沙姆-68，所述稳定剂为右旋糖苷-70。在实施本发明的过程中，发明人发现采用这两种具体原料，能够保证α-氰基丙烯酸正丁酯充分反应，而且无毒无害，另外泊洛沙姆-68是一种适用于制备注射剂的乳化剂，这样有利于后续用于注射剂的开发。

进一步地，每5毫升超纯水中分散有乳化剂20～40毫克、稳定剂45～55毫克。在实施本发明的过程中，发明人发现，在这个范围内，制得的表没食子儿茶素没食子酸酯纳米缓释制剂粒子粒径较小、分布均一，而低于上述范围，则形成的纳米粒粒径偏大且不均一，高于上述范围，则辅料占过大比重，浪费原料。

进一步地，油相原料中，每1毫升乙酸乙酯中分散有α-氰基丙烯酸正丁酯8～17微升。在实施本发明的过程中，发明人发现，低于上述范围，制得的表没食子儿茶素没食子酸酯纳米缓释制剂包封率较低，高于上述范围，聚合反应不完全，也会浪费单体材料。

进一步地，油相原料和乳化相原料在界面聚合反应或乳化聚合反应中的用量体积比均为5：1。在实施本发明的过程中，发明人发现，采用这个比例，反应效率更高，能够保证反应充分进行，且方便操作。

进一步地，表没食子儿茶素没食子酸酯与α-氰基丙烯酸正丁酯的质量体积比为1～8毫克：8～17微升。在实施本发明的过程中，发明人发现，采用这个比例，反应效率更高，原料浪费少，且能保证产物粒径在30～40纳米，包封率在70.73～80.15％。

进一步地，在界面聚合反应或乳化聚合反应中，混合物ⅰ逐渐加入到乳化相原料中以及油相原料逐渐加入到混合物ⅱ中的滴入总时间为4～8分钟。

进一步地，在界面聚合反应或乳化聚合反应中，以800～950转每分钟的转速进行磁力搅拌。在实施本发明的过程中，发明人发现，采用这种条件能够使制备的纳米粒粒子较小、分布均匀。

进一步地界面聚合反应的过程中，混合物ⅰ中表没食子儿茶素没食子酸酯的质量浓度为1～8g/l，乳化聚合反应的过程中，混合物ⅱ中表没食子儿茶素没食子酸酯的质量浓度为0.2～1.6g/l。浓度过低的话，药物过少，浪费包裹单体，而浓度过高，则会导致包封率过低，在实施本发明的过程中，发明人发现，在上述范围，既能保证包封率，又能保证利用率。

进一步地，界面聚合反应和乳化聚合反应的时间均为2.5～3.5小时。在实施本发明的过程，发明人发现此范围能够保证反应充分。

进一步地，还包括以下步骤：

(3)后处理

聚合反应后，先除去有机溶剂，然后通过经搅拌处理和过滤后得到表没食子儿茶素没食子酸酯纳米缓释制剂的混悬液，或者通过冷冻干燥制得表没食子儿茶素没食子酸酯纳米缓释制剂的冻干粉。

进一步地，步骤(3)中，搅拌处理采用磁力搅拌，转速为800～950转每分钟，时间为半小时，过滤采用孔径为2～5微米的滤纸。在去除有机溶剂后，再搅拌半小时是为了保证聚合反应完全，进行过滤是为了去除在聚合反应中生成的一些絮状物。

进一步地，除去有机相通过在30～40℃条件下真空旋转蒸发除去。可以防止未被包裹的egcg被高温氧化。

本发明还提供一种药物，包括上述表没食子儿茶素没食子酸酯纳米缓释制剂和辅料。该药物可制成片剂、注射剂、栓剂、丸剂等药物常用制剂，均属于本发明的保护范畴。具体制备方法可参照制药领域的常规方法制备，所用辅料可根据剂型不同选择制药领域通用的辅料。具体实施中，可以直接在所制备的表没食子儿茶素没食子酸酯纳米缓释制剂的混悬液或冻干粉加入适当的医药或食品辅料，即可制得任何可供药用或食品作用的剂型或材料。

本发明的有益效果体现在：

本发明提供的表没食子儿茶素没食子酸酯纳米缓释制剂利用聚氰基丙烯酸正丁酯生物相容性好，生物降解性好，低毒性等性能方面的优势而制备出无毒无害，生物相容性好，生物降解性好的纳米粒，且表没食子儿茶素没食子酸酯能够缓慢释放，从而获得更广泛的生物医学应用。

本发明提供的表没食子儿茶素没食子酸酯纳米缓释制剂是一种纳米粒，可利用纳米尺寸粒径小的优势来应用在很多极小尺寸级的领域，为表没食子儿茶素没食子酸酯的充分开发应用提供了更为便利的前景。

本发明提供的表没食子儿茶素没食子酸酯纳米缓释制剂的制备方法，不使用水和丙酮系统，没有丙酮溶剂残留的问题，不需要ph的调节和其他过程的干预，其工艺简单、成本低、反应条件要求低，不仅带来经济效益，环保意义，还具有很大的社会效益，具有很高的应用前景。

本发明提供的表没食子儿茶素没食子酸酯纳米缓释制剂的制备方法能够制备得到粒径为30～40纳米，pdi为0.09～0.3，电动势为-13.47±7.50～-29.52±4.68mv，包封率为70.73～80.15％，分散均匀无粘连的表没食子儿茶素没食子酸酯纳米缓释制剂。

本发明从原料的来源和整个生产工艺过程中没有加入任何有毒有害的材料，也没有产生任何有毒有害的物质。而2015年药典对有机溶剂乙酸乙酯溶剂残留没有很严格的要求，就连有机溶剂乙酸乙酯的容剂残留也无毒性。所以本发明制备的表没食子儿茶素没食子酸酯纳米缓释制剂具有生物相容性好且无任何毒副作用，作为医用生物纳米制剂或药物靶向传递制剂具有很好的发展前景。并且溶剂残留无限制可作为广泛生产的制剂。

本发明提供的表没食子儿茶素没食子酸酯纳米缓释制剂可以作注射、口服、涂抹等缓释制剂，利用表没食子儿茶素没食子酸酯的本身药理活性和聚氰基丙烯酸正丁酯生物相容性，可用于人体或动物各种疾病的治疗。

附图说明

图1为实施例1制得的表没食子儿茶素没食子酸酯纳米缓释制剂的扫描电镜图；

图2为实施例1制得的表没食子儿茶素没食子酸酯纳米缓释制剂的透射电镜图。

图3为实施例1制得的表没食子儿茶素没食子酸酯纳米缓释制剂的粒径分布图。

图4为实施例1和实施例7制得的表没食子儿茶素没食子酸酯纳米缓释制剂的x射线衍射图。

图5为实施例8的释放试验结果图。

具体实施方式

下面将参考附图来详细说明本发明。需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

实施例1

表没食子儿茶素没食子酸酯纳米缓释制剂的制备

制备方法包括以下步骤：

(1)原料配制

配制油相原料：在1毫升乙酸乙酯中均匀分散17微升的α-氰基丙烯酸正丁酯；

配制乳化相原料：在5毫升超纯水中均匀分散25毫克的泊洛沙姆-68和50毫克的右旋糖苷-70，室温下，超声溶解，搅拌混合均匀；

(2)聚合反应

精密称取2毫克表没食子儿茶素没食子酸酯加入到油相原料中，摇动混合匀均匀，得到混合物ⅰ，然后将混合物ⅰ在6分钟内逐滴滴入到乳化相原料中进行界面聚合反应，反应在转速850转每分钟的磁力搅拌下进行，反应的总时间为3小时；

(3)后处理

聚合反应后，先在35℃条件下蒸发除去有机溶剂，然后经过半小时磁力搅拌、过滤后得到表没食子儿茶素没食子酸酯纳米缓释制剂的混悬液，其中，磁力搅拌转速为800转每分钟，过滤时采用孔径为4微米的滤纸。

本实施例制得的表没食子儿茶素没食子酸酯纳米缓释制剂的扫描电镜图见图1，透射电镜(tem)图见图2，粒径直观图见图3，x射线衍射图见图4。

可以得出，本实施例制得的表没食子儿茶素没食子酸酯纳米缓释制剂粒径小，粒子呈球形，尺寸30～40纳米，分布均匀，分散良好，无颗粒粘连现象，包封率为77.82％。

图4中，a为实施例1制得的表没食子儿茶素没食子酸酯纳米缓释制剂的x射线衍射图，c为空白聚氰基丙烯酸正丁酯纳米粒的x射线衍射图，d为表没食子儿茶素没食子酸酯与空白聚氰基丙烯酸正丁酯纳米粒的物理混合物的x射线衍射图，e为表没食子儿茶素没食子酸酯的x射线衍射图。从图4中可看出，若表没食子儿茶素没食子酸酯未被包裹，其特征峰会如d所示出现e中的特征峰但由于药物浓度相对较低，特征衍射峰强度较小。而经过聚合反应制得的实施例1的x射线峰中已观察不到表没食子儿茶素没食子酸酯的特征衍射峰，说明本实施例中，表没食子儿茶素没食子酸酯已被充分包裹。

实施例2

表没食子儿茶素没食子酸酯纳米缓释制剂的制备

制备方法包括以下步骤：

(1)原料配制

配制油相原料：在1毫升乙酸乙酯中均匀分散10微升的α-氰基丙烯酸正丁酯；

配制乳化相原料：在5毫升超纯水中均匀分散25毫克的泊洛沙姆-68和50毫克的右旋糖苷-70，室温下，超声溶解，搅拌混合均匀；

(2)聚合反应

精密称取1毫克表没食子儿茶素没食子酸酯加入到油相原料中，摇动混合匀均匀，得到混合物ⅰ，然后将混合物ⅰ在4分钟内逐滴滴入到乳化相原料中进行界面聚合反应，反应在转速800转每分钟的磁力搅拌下进行，反应的总时间为3.5小时；

(3)后处理

聚合反应后，先在30℃条件下蒸发除去有机溶剂，然后经过半小时磁力搅拌、过滤后得到表没食子儿茶素没食子酸酯纳米缓释制剂的混悬液，其中，磁力搅拌转速为950转每分钟，过滤时采用孔径为2微米的滤纸。

本实施例制得的表没食子儿茶素没食子酸酯纳米缓释制剂的扫描电镜图、透射电镜(tem)图、粒径直观图和x射线衍射图与实施例1相似，为简洁描述起见，不再赘示。

本实施例制得的表没食子儿茶素没食子酸酯纳米缓释制剂的粒子呈球形，分布均匀，分散良好，无颗粒粘连现象，包封率为80.15％。

实施例3

表没食子儿茶素没食子酸酯纳米缓释制剂的制备

制备方法包括以下步骤：

(1)原料配制

配制油相原料：在1毫升乙酸乙酯中均匀分散15微升的α-氰基丙烯酸正丁酯；

配制乳化相原料：在5毫升超纯水中均匀分散20毫克的泊洛沙姆-68和45毫克的右旋糖苷-70，室温下，超声溶解，搅拌混合均匀；

(2)聚合反应

精密称取2毫克表没食子儿茶素没食子酸酯加入到油相原料中，摇动混合匀均匀，得到混合物ⅰ，然后将混合物ⅰ在8分钟内逐滴滴入到乳化相原料中进行界面聚合反应，反应在转速900转每分钟的磁力搅拌下进行，反应的总时间为2.5小时；

(3)后处理

聚合反应后，先在40℃条件下蒸发除去有机溶剂，然后经过半小时磁力搅拌、过滤后得到表没食子儿茶素没食子酸酯纳米缓释制剂的混悬液，其中，磁力搅拌转速为850转每分钟，过滤时采用孔径为3微米的滤纸。

本实施例制得的表没食子儿茶素没食子酸酯纳米缓释制剂的扫描电镜图、透射电镜(tem)图、粒径直观图和x射线衍射图与实施例1相似，为简洁描述起见，不再赘示。

本实施例制得的表没食子儿茶素没食子酸酯纳米缓释制剂的粒子呈球形，分布均匀，分散良好，无颗粒粘连现象，包封率为76.95％。

实施例4

表没食子儿茶素没食子酸酯纳米缓释制剂的制备

制备方法包括以下步骤：

(1)原料配制

配制油相原料：在1毫升乙酸乙酯中均匀分散8微升的α-氰基丙烯酸正丁酯；

配制乳化相原料：在5毫升超纯水中均匀分散35毫克的泊洛沙姆-68和50毫克的右旋糖苷-70，室温下，超声溶解，搅拌混合均匀；

(2)聚合反应

精密称取4毫克表没食子儿茶素没食子酸酯加入到乳化相原料中，摇动混合匀均匀，得到混合物ⅱ，然后将油相原料在4分钟内逐滴滴入到混合物ⅱ中进行界面聚合反应，反应在转速950转每分钟的磁力搅拌下进行，反应的总时间为2.5小时；

(3)后处理

聚合反应后，先在38℃条件下蒸发除去有机溶剂，然后在-80℃条件下冷冻，并经过48小时冷冻干燥制得表没食子儿茶素没食子酸酯纳米缓释制剂的冻干粉。

本实施例制得的表没食子儿茶素没食子酸酯纳米缓释制剂的扫描电镜图、透射电镜(tem)图、粒径直观图和x射线衍射图与实施例1相似，为简洁描述起见，不再赘示。

本实施例制得的表没食子儿茶素没食子酸酯纳米缓释制剂的粒子呈球形，分布均匀，分散良好，无颗粒粘连现象，包封率为74.91％。

实施例5

表没食子儿茶素没食子酸酯纳米缓释制剂的制备

制备方法包括以下步骤：

(1)原料配制

配制油相原料：在1毫升乙酸乙酯中均匀分散10微升的α-氰基丙烯酸正丁酯；

配制乳化相原料：在5毫升超纯水中均匀分散25毫克的泊洛沙姆-68和55毫克的右旋糖苷-70，室温下，超声溶解，搅拌混合均匀；

(2)聚合反应

精密称取6毫克表没食子儿茶素没食子酸酯加入到乳化相原料中，摇动混合匀均匀，得到混合物ⅱ，然后将油相原料在5分钟内逐滴滴入到混合物ⅱ中进行界面聚合反应，反应在转速800转每分钟的磁力搅拌下进行，反应的总时间为3小时；

(3)后处理

聚合反应后，先在38℃条件下蒸发除去有机溶剂，然后在-80℃条件下冷冻，并经过48小时冷冻干燥制得表没食子儿茶素没食子酸酯纳米缓释制剂的冻干粉。

本实施例制得的表没食子儿茶素没食子酸酯纳米缓释制剂的扫描电镜图、透射电镜(tem)图、粒径直观图和x射线衍射图与实施例1相似，为简洁描述起见，不再赘示。

本实施例制得的表没食子儿茶素没食子酸酯纳米缓释制剂的粒子呈球形，分布均匀，分散良好，无颗粒粘连现象，包封率为72.88％。

实施例6

表没食子儿茶素没食子酸酯纳米缓释制剂的制备

制备方法包括以下步骤：

(1)原料配制

配制油相原料：在1毫升乙酸乙酯中均匀分散10微升的α-氰基丙烯酸正丁酯；

配制乳化相原料：在5毫升超纯水中均匀分散40毫克的泊洛沙姆-68和45毫克的右旋糖苷-70，室温下，超声溶解，搅拌混合均匀；

(2)聚合反应

精密称取8毫克表没食子儿茶素没食子酸酯加入到乳化相原料中，摇动混合匀均匀，得到混合物ⅱ，然后将油相原料在8分钟内逐滴滴入到混合物ⅱ中进行界面聚合反应，反应在转速950转每分钟的磁力搅拌下进行，反应的总时间为3.5小时；

(3)后处理

聚合反应后，先在30℃条件下蒸发除去有机溶剂，然后在-80℃条件下冷冻，并经过48小时冷冻干燥制得表没食子儿茶素没食子酸酯纳米缓释制剂的冻干粉。

本实施例制得的表没食子儿茶素没食子酸酯纳米缓释制剂的扫描电镜图、透射电镜(tem)图、粒径直观图和x射线衍射图与实施例1相似，为简洁描述起见，不再赘示。

本实施例制得的表没食子儿茶素没食子酸酯纳米缓释制剂的粒子呈球形，分布均匀，分散良好，无颗粒粘连现象，包封率为70.73％。

在扫描电子显微镜和透射电子显微镜下观察，实施例1至6制得的表没食子儿茶素没食子酸酯纳米缓释制剂粒径小，粒子呈球形，分布均匀、分散良好，无颗粒粘连现象；经粒度分析仪分析，实施例1至6制得的表没食子儿茶素没食子酸酯纳米缓释制剂产品的粒径为30～40纳米，电动势为-13.47±7.50～-29.52±4.68mv。

实施例7

表没食子儿茶素没食子酸酯纳米缓释制剂的制备

制备方法包括以下步骤：

(1)原料配制

配制油相原料：在1毫升乙酸乙酯中均匀分散17微升的α-氰基丙烯酸正丁酯；

配制乳化相原料：在5毫升超纯水中均匀分散25毫克的泊洛沙姆-68和50毫克的右旋糖苷-70，室温下，超声溶解，搅拌混合均匀；

(2)聚合反应

精密称取2毫克表没食子儿茶素没食子酸酯加入到乳化相原料中，摇动混合匀均匀，得到混合物ⅱ，然后将油相原料在6分钟内逐滴滴入到混合物ⅱ中进行界面聚合反应，反应在转速850转每分钟的磁力搅拌下进行，反应的总时间为3小时；

(3)后处理

聚合反应后，先在35℃条件下蒸发除去有机溶剂，然后经过半小时磁力搅拌、过滤后得到表没食子儿茶素没食子酸酯纳米缓释制剂的混悬液，其中，磁力搅拌转速为800转每分钟，过滤时采用孔径为4微米的滤纸。

本实施例制得的表没食子儿茶素没食子酸酯纳米缓释制剂的扫描电镜图、透射电镜(tem)图和粒径直观图与实施例1相似，为简洁描述起见，不再赘示。

本实施例制得的表没食子儿茶素没食子酸酯纳米缓释制剂的粒子呈球形，分布均匀，分散良好，无颗粒粘连现象，包封率为77.24％。

图4中，b为实施例7制得的表没食子儿茶素没食子酸酯纳米缓释制剂的x射线衍射图，从图4中同样可看出，本实施例表没食子儿茶素没食子酸酯已被充分包裹。

实施例8

表没食子儿茶素没食子酸酯纳米缓释制剂的释放试验

以含有20mm维生素c的pbs盐缓冲液(ph7.4)为释放介质，准确称取2.0毫克表没食子儿茶素没食子酸酯与10毫升释放介质均匀混合，实施例1(图中用egcg纳米粒(油)表示)和实施例7(图中用egcg纳米粒(水)表示)得到的表没食子儿茶素没食子酸酯纳米缓释制剂的混悬液与释放介质均匀混合后总体积为10毫升，转入经edta溶液和超纯水处理过的透析袋中，将透析袋两端扎紧，绑于浆上，分别置于盛有30毫升释放介质的溶出瓶中，在恒温(37℃)摇床(100r/min)中恒速震荡。

分别于0.5小时，1小时，2小时，4小时，6小时，9小时，13小时，20小时，28小时，36小时，48小时取样1毫升置4℃冰箱冷冻保存，每次取样后再补充1毫升的释放介质溶液，将所取样品经高速低温离心机18000转/分钟、4℃离心30分钟，取上清液0.8毫升经0.45微米微孔滤膜过滤，取续滤液。

采用hplc法测定不同时间点样品上清液含量，每次进样10ul，测定表没食子儿茶素没食子酸酯的峰面积，并按标准曲线回归方程计算表没食子儿茶素没食子酸酯的浓度，得出累积释药百分数并绘制释药曲线，实验结果如图5所示。

其结果表明利用界面/乳化聚合反应所制得的表没食子儿茶素没食子酸酯纳米缓释制剂与表没食子儿茶素没食子酸酯本身释放进行比较均具有缓慢释放的作用，并且界面聚合反应所制备的表没食子儿茶素没食子酸酯纳米缓释制剂的缓慢释放的作用略优于乳化聚合反应所制备的表没食子儿茶素没食子酸酯纳米缓释制剂。

应当理解本文所述的例子和实施方式仅为了说明，并不用于限制本发明，本领域技术人员可根据它做出各种修改或变化，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。