本发明属于生物材料领域，具体涉及sis冷凝胶在制备止血材料中的应用。
背景技术：
在日常生活中，由于外伤、手术等情况下导致大量出血的状况，如果不及时止血，可能会引起感染和创伤加剧，因此控制出血是急救和创伤治疗的重要步骤。合适的止血材料能明显缩短手术时间，对创伤或术后恢复至关重要。合格的止血材料不但具备良好的止血性能，还需要具有优良的生物相容性，无毒副作用，无刺激性，易于加工成型等。廖建贵等研究了脱细胞猪小肠黏膜下层(smallintestinalsubmucosa，sis)粉末与1-乙基-3-(3-二甲氨丙基)碳二亚胺盐酸盐[1-ethyl-3-(3-dimethyllaminopropyldvb)carbodiimidehydrochloride，edc]冷冻交联，成功制备成能作为细胞移植载体的sis冷凝胶，具有良好的生物、物理性能。但是，该冷冻凝胶的其他生物性能未见报道。
技术实现要素：
有鉴于此，本发明的目的之一在于提供sis冷凝胶在制备止血材料中的应用；本发明的目的之二在于提供sis冷凝胶颗粒在制备止血材料中的应用。
为实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案：
1、sis冷凝胶在制备止血材料中的应用，所述sis冷凝胶由脱细胞猪小肠黏膜下层粉末用edc和nhs交联制得。
优选的，所述交联具体步骤为：将脱细胞猪小肠黏膜下层粉溶于ph5.6、0.05m的mes液中，获得脱细胞猪小肠黏膜下层粉溶解液，然后将脱细胞猪小肠黏膜下层粉溶解液与3mol/ledc液和1.5mol/lnhs液液按体积比为8：1：1混合，然后置于成型器中凝固为胶冻状的固体后，将其置于-80℃冷冻过夜，然后置于18～25℃融化，用0.1m/lna2hpo4漂洗2h，每30分钟换液一次，然后去离子水漂洗2h，每30分钟换液一次；-20℃冷冻2h定型，然后在样品架温度-20℃，冻干机内壁温度-90℃，预冻1h；再在冻干机内压强低于0.01kp，持续冷冻2-3天至样品完全冻干，即得sis冷凝胶。
优选的，所述脱细胞猪小肠黏膜下层粉末由小肠粘膜下层经脱脂、脱细胞、打浆、胃蛋白酶酶解、过滤、盐析、离心、溶解后再次盐析、离心、溶解、透析、冻干后打粉制得。
优选的，所述脱脂为将小肠粘膜下层捞出，用蒸馏水清洗3次，每次5分钟；清洗后将猪小肠粘膜下层挤干水分，用甲醇、氯仿体积比为1：1的混合液，于4℃摇床振荡12h，12h后更换脱脂液，继续4℃摇床振荡12h；振荡结束后，将猪小肠粘膜下层捞出，置于滤网内，以蒸馏水反复冲洗至无明显刺鼻气味为止。
优选的，所述脱细胞将脱脂后的猪小肠粘膜下层于用生理盐水配置含质量分数为0.05％的胰酶和质量分数为0.05％edta的溶液18～25℃振荡48h，生理盐水冲洗去除胰蛋白酶及脱下的细胞，清洗结束后，再以蒸馏水清洗3次，挤干水分即可。
优选的，所述打浆为将脱细胞猪小肠黏膜下层用体积分数为0.05％的冰醋酸浸泡12h，然后破壁机内打碎，打碎过程不断加入0.05％的冰醋酸溶液，直至碎片变为粘稠的胶状液体。
优选的，所述胃蛋白酶酶解为将打浆的脱细胞猪小肠粘膜下层置于盆内，按胃蛋白酶与猪小肠粘膜下层的质量比1:100加入胃蛋白酶，混匀后，置于37℃摇床振荡48h，将小肠粘膜下层胶原之间的连接打开。
优选的，所述盐析为用2mol/l的nacl进行盐析；
所述透析为将透析袋用加入2(w/v，g/ml)％碳酸氢钠和ph8.0、1mmol/ledta的液体，煮沸10分钟；煮沸过后的透析袋用蒸馏水彻底清洗，清洗后再用ph8.0、1mmol/ledta的液体煮沸10分钟；煮沸结束，待液体冷却后，将透析袋连同烧杯放置于4℃冰箱内备用；然后向透析袋中倒入冰醋酸溶解后猪小肠黏膜下层粉末溶液，再以丝线结扎密封透析袋，用体积分数为0.05％的冰醋酸液体透析。
2、sis冷凝胶颗粒在制备止血材料中的应用，所述sis冷凝胶颗粒由脱细胞猪小肠黏膜下层粉末用edc和nhs交联制成冷凝胶后打碎至粒径为1-2mm的颗粒。
本发明的有益效果在于：本发明公开了sis冷凝胶及sis冷凝胶颗粒在制备止血材料中的应用，通过将脱细胞猪小肠黏膜下层粉末用edc和nhs交联制得sis冷凝胶，其制备方法简单，制得的材料吸水性能好，具有很好的组织相容性和较低的免疫原性，明显缩短创面出血时间和出血量，可以用于开发止血材料。
附图说明
为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：
图1为三种止血材料(a：sis粉末；b：sis冷凝胶；c：sis冷凝胶颗粒)。
图2为三种止血材料的电镜结构(a：sis粉末；b：sis冷凝胶；c：sis冷凝胶颗粒)。
图3为sis粉末和sis冷凝胶颗粒创面止血的电镜图(a：sis粉末；b：sis冷凝胶颗粒)。
图4为家兔肝脏止血试验(a：不做处理；b：sis冷凝胶填塞创口)。
具体实施方式
下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。
实施例1、获取新鲜猪小肠粘膜下层
获取新鲜猪小肠粘膜下层，包括如下步骤：
(1)机械刮除法制备猪小肠粘膜下层
1)在重庆市畜牧研究院屠宰场宰杀猪后，立即取出新鲜猪小肠，自来水冲洗3遍，去除肠腔内容物；
2)将其剪成约20cm长短，放入烧杯内，自来水冲洗10分钟；
3)将冲洗后的小肠置于案板上，左手按住一端，右手持刀柄或勺柄反复搔刮肠子，去除肠腔内容物、粘膜层、肌肉层和浆膜层，直至肠子变为透明为止；
4)将搔刮后的肠子以剪刀剪开，手持刀柄将内壁再刮一次，将获取的猪小肠粘膜下层置于烧杯内，自来水冲洗10分钟；
(2)脱脂
1)将自来水冲洗后的小肠粘膜下层捞出，置于烧杯内，加入蒸馏水清洗，以玻璃棒搅拌清洗3次，每次5分钟；
2)将清洗后的猪小肠粘膜下层挤干水分，放入玻璃烧杯内，向烧杯内加入甲醇、氯仿体积比为1：1的混合液，保鲜膜密封烧杯口，将其置于4℃摇床振荡12h，12h后可见大量油脂脱出，更换脱脂液后，继续4℃摇床振荡12h；
3)振荡结束后，将猪小肠粘膜下层捞出，置于滤网内，以蒸馏水反复冲洗数次，直至无明显刺鼻气味为止。
(3)脱细胞
1)在玻璃烧杯内加入0.9％生理盐水配制含0.05％胰酶、0.05％edta的液体，将脱脂后清洗干净后的猪小肠粘膜下层挤干水分，放入烧杯内，液体将小肠组织完全淹没后，搅拌均匀，室温振荡48h；
2)振荡结束后，去除烧杯内的液体，以生理盐水冲洗3次(每次5分钟)，尽量去除胰蛋白酶及脱下的细胞；
3)清洗结束后，再以蒸馏水清洗3次，挤干水分，称重后置于烧杯内备用。
实施例2、sis粉末制备
(1)打浆
1)将脱细胞后清洗干净、挤干水分的猪小肠粘膜下层以剪刀剪砕，置于玻璃烧杯内，向烧杯内加入体积分数为0.05％的冰醋酸，保鲜膜封口，置于4℃冰箱浸泡12h(经过冰醋酸的浸泡，猪小肠粘膜下层逐渐膨胀，中途可根据情况添加冰醋酸)；
2)将冰醋酸浸泡膨胀后的猪小肠粘膜下层碎片放入破壁机内打碎，为防止温度过高导致变性，打浆过程中可不断加入体积分数为0.05％的冰醋酸溶液，直至碎片变为粘稠的胶状液体；
(2)蛋白酶酶解：将打碎的粘稠状液体置于盆内，根据胃蛋白酶与猪小肠粘膜下层的质量比为1:100加入胃蛋白酶，混匀后，置于37℃摇床振荡48h，将小肠粘膜下层胶原之间的连接打开；
(3)过滤：经过48h酶解后，将粘稠状液体以双层纱布进行过滤，去除较大的颗粒；
(4)盐析：过滤后的液体分装于1l的烧杯内，向每个烧杯内加入2mol/l的nacl进行盐析，并以玻璃棒快速顺时针搅拌，可见大块的白色固体析出；
(5)离心：将析出的固体置于500ml离心瓶内，配平后置于4℃预冷的离心机内，8000rpm离心45分钟；
(6)溶解后再次盐析、离心、溶解：离心后的固体加入体积分数0.05％的冰醋酸，4℃搅拌器搅拌至完全溶解，溶解后的液体再次进行盐析、离心、溶解；
(7)透析(去除胃蛋白酶及氯化钠)
1)先将透析袋取出，剪成长约50-60cm的小段；
2)将透析袋放在玻璃烧杯内，向烧杯内加入2％(w/v)碳酸氢钠和1mmol/ledta(ph8.0)的液体，酒精灯煮沸10分钟；
3)煮沸过后的透析袋用蒸馏水彻底清洗，清洗后再用1mmol/ledta(ph8.0)的液体煮沸10分钟；
4)煮沸结束，待液体冷却后，将透析袋连同烧杯放置于4℃冰箱内备用；
5)戴上橡胶手套，将透析袋从液体中取出，以丝线将其一端结扎密封，向袋中倒入冰醋酸溶解后的sis溶液，再以丝线结扎密封透析袋(透析袋不宜装的过满，以防透析过程中吸水胀破)；
6)将装上sis溶解液的透析袋置于水桶内，向桶中加入大量体积分数为0.05％的冰醋酸液体，直到透析袋被完全淹没；
7)将水桶置于4℃冷库内，磁力搅拌器搅拌48h,每4h更换一次透析液。
(8)冻干
1)透析后的sis溶液分装于培养皿内，厚度为0.5cm,盖上盖子，置于-20℃冰箱冷冻过夜；
2)冷冻过夜后，开启冻干机，设置冻干参数(样品架温度-20℃，冻干机内壁温度-90℃)，预冻1h；
3)将在-20℃冷冻过夜定型的sis液体放入冻干机内，设置好冻干参数后，检查冻干机密封性，打开真空泵，直至显示冻干机内压强低于0.01kpa；
4)持续真空冷冻2-3天，样品被冻干。
(9)冻干后打粉
观察样品冻干后，关闭冻干机，将样品取出，在冲压式粉碎机中将其打碎至粉末状，得sis粉末，装于离心管。
实施例3.sis冷凝胶的制备
(1)取1g冻干后的sis粉末溶于80ml0.05mmes(ph＝5.6)液中，4℃搅拌过夜至完全溶解；
(2)交联：用一20ml空针抽取16mlsis溶解液，另一20ml空针抽取2mledc(3mol/l)液、2mlnhs(1.5mol/l)液在三通管混合均匀后(v:v:v/8：1：1)，注射于90mm培养皿内(每皿10ml)；
(3)冷冻致孔：5分钟后，待培养皿内的液体凝固为胶冻状的固体后，将其置于-80℃冻硬过夜；
(4)清洗：冷冻过夜后，将样本取出，置于室温条件下，待其中的冰晶颗粒融化后，将制备好的sis冷凝胶置于0.1m/lna2hpo4漂洗2h,每30分钟换液一次，然后去离子水漂洗2h，每30分钟换液一次；
(5)冻干保存：将漂洗干净的sis冷凝胶放置于培养皿内，置于-20℃冰箱内冷冻2h定型；
(6)开启冻干机，设置冻干参数(样品架温度-20℃，冻干机内壁温度-90℃)，预冻1h；
(7)将在-20℃冷冻定型的sis冷凝胶放入冻干机内，设置好冻干参数后，检查冻干机密封性，打开真空泵，直至显示冻干机内压强低于0.01kp，持续冷冻2-3天至样品完全冻干。
实施例4、sis冷凝胶颗粒的制备
在冲压式粉碎机中将其打碎至颗粒状；使用孔径不同的筛网控制颗粒的大小在1-2mm之间，结果如图1所示，同时观察sis冷凝胶和sis粉末结构。
图2为三种止血材料的电镜结构。
检测3种止血材料的吸水性，结果显示sis冷凝胶的吸水性6226.37％±579.64％，sis粉末的吸水性为2392％±27.32％；sis冷凝胶颗粒的吸水性为3079.33％±120.55％。结果表明，sis冷凝胶的吸水效果最佳。
检测sis粉末和sis冷凝胶颗粒的出血时间，同时以纱布、福和泰和瞬时作为对照，结果如表1所示。
表1、出血时间检测
将sis粉末和sis冷凝胶颗粒均匀撒于创面，创面电镜图如图3所示。
然后在在家兔肝脏上以直径1cm的打孔器贯穿肝脏形成贯通伤(图4)，图4中a不做处理，图4中b以sis冷凝胶填塞创口，在3分钟、20分钟时观察出血情况，不处理组流血致家兔死亡，处理组填塞冷凝胶后出血立即停止，至20分钟时亦无出血，家兔存活。
上述结果表明，本发明制得的材料具有较好的止血效果，能够开发为止血材料。
最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。