本发明公开了一种生物质止血海绵的制备方法，属于医疗材料制备技术领域。
背景技术：
海绵，是一种多孔材料，能够用于清洁物品。人们常用的海绵由木纤维素纤维或发泡塑料聚合物制成。另外，还有三类其他材料制成的合成海绵，分别为低密度聚醚（不吸水海绵）、聚乙烯醇（高吸水材料，无明显气孔）和聚酯。目前国内日常民用创伤止血材料主要是创口贴，外科手术用止血材料为明胶海绵。二者虽都有止血功效，但其消炎止血效果较差。
外伤是危害人类健康的严重问题，据世界卫生组织创伤治疗指南报道，全球每天有16000人因外伤致死，而且因为外伤导致的医疗费用高达所有全球医疗支出的16％，其中创伤者中有1/3是因失血以及失血相关的多脏器衰竭而致死。如果能及时有效地止血，对挽救伤员生命，稳定伤情，为后续治疗创造条件十分重要。作为止血材料，是指盖在伤口上、有保护作用的覆盖物，可以协助控制出血，防止感染并吸收分泌物，止血材料对于及时止血有着重要的意义。同时，止血对术中减少失血、保持术野清晰、防止重要组织损伤、保证手术安全以及术后创口愈合等均具有重要意义。随着医学的发展，止血材料种类繁多，就生物相容性而言，常用的生物相容性止血材料有：可吸收性明胶海绵、胶原蛋白海绵等明胶类止血材料；氧化纤维素、氧化再生纤维素类止血材料；壳聚糖/甲壳素类、淀粉多聚糖类等天然生物多聚糖类止血材料等。
目前，临床上止血产品繁多，剂型多样，有液体、粉剂、凝胶剂及海绵剂等，其中海绵剂止血材料以其独特的理化结构优势在临床止血尤其在填充止血应用领域中占据主导地位。据统计现已在临床推广应用的医用海绵类产品多达40余种以胶原类材料产品为主。目前的止血海绵都普遍存在一些缺陷：遇水后基本无物理支撑性能、力学性能较差；制备的海绵未经过发泡处理，产品孔隙率小吸液速度缓慢；所得海绵产品骨架疏松，轻轻碰触极易破碎无法充分发挥物理压迫及封闭创面止血的功能，交联所得产品孔径小吸液能力差。
因此，发明一种吸液率高且力学性能好的生物质止血海绵对医疗材料制备技术领域具有积极意义。
技术实现要素：
本发明主要解决的技术问题，针对目前现有用于止血的医用材料海绵的吸液率较低，不能用于大量的吸液，抑菌性能有待提高，并且海绵产品骨架疏松，力学性能较差，遇水后基本无物理支撑性能，无法充分发挥物理压迫及封闭创面止血功能的缺陷，提供了一种生物质止血海绵的制备方法。
为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是：
一种生物质止血海绵的制备方法，其特征在于具体制备步骤为：
（1）取100～120g桑树皮放入400～450ml质量分数为30%的硫酸溶液中浸泡，取出酸浸处理的桑树皮置于水浴锅中，加热升温，向水浴锅中加入100～120ml氢氧化钠溶液、50～60ml多聚磷酸钠溶液、30～40ml硅酸钠溶液，蒸煮后，过滤，去除滤液得到碱煮桑皮；
（2）将上述碱煮桑皮用150～180ml盐酸浸泡后，取出浸泡后的桑皮用木锤敲打，并用水冲洗3～5次后放入烘箱中，加热升温，干燥，得到脱胶桑皮纤维；配制n-甲基吗啉水溶液，将n-甲基吗啉水溶液与脱胶桑皮纤维混合，得到230～250ml的混合液，将混合液放入旋转蒸发仪中，同时向旋转蒸发仪中添加5～10ml没食子酸丙酯，加热升温，旋转蒸发，得到胶状纺丝原液；
（3）取40～50g草鱼干鱼鳞加入装有400～450ml无菌去离子水的烧杯中，将烧杯水浴加热，升温，再将4～5g胰蛋白酶加入烧杯中，保温酶解，过滤去除滤液，得到酶解鱼鳞，将酶解鱼鳞用去离子水洗涤3～5次，再将洗涤后的酶解鱼鳞与去离子水混合，水浴加热升温，灭酶，降温，保温浓缩，得到明胶液；
（4）将50～55g壳聚糖粉末置于烧杯，向烧杯中加入醋酸溶液，调节ph，得到壳聚糖酸液，将烷基酰胺丙基二甲基胺甜菜碱溶液与壳聚糖酸液等体积混合，置于高速离心机中以4000～4200r/min的转速离心15～20min，去除上层液，得到沉淀物，将沉淀物置于烘箱中，加热升温，干燥，得到羧基化壳聚糖；
（5）按重量份数计，将20～30份羧基化壳聚糖、50～60份明胶液、15～20份固体双氧水、100～120份去离子水、10～15份茶多酚混合，置于高速分散机中以3000～3300r/min的转速高速分散13～15min，得到混合胶液，将胶状纺丝原液置于真空抽气机中，加热升温，静置脱泡后倒入注射泵，挤压喷出纤维原丝至混合胶液中，得到海绵体，再将海绵体置于冷冻干燥机中，冷冻干燥，得到生物质止血海绵。
步骤（1）所述的硫酸溶液的质量分数为30%，控制浸泡温度为50～55℃，浸泡处理时间为1～2h，加热升温后温度为90～100℃，氢氧化钠溶液的质量分数为40%，多聚磷酸钠溶液的质量分数为4%，硅酸钠溶液的质量分数为6%，蒸煮时间为2～3h。
步骤（2）所述的盐酸的质量分数为10%，浸泡时间为8～10min，敲打时间为30～35min，加热升温后温度为100～110℃，干燥时间为10～12h，n-甲基吗啉水溶液的质量分数为30%，n-甲基吗啉水溶液与脱胶桑皮纤维混合质量比为15︰1，加热升温后温度为90～95℃，旋转转速为110～130r/min，旋转蒸发时间为30～40min。
步骤（3）所述的水浴加热升温后温度为35～40℃，保温酶解时间为4～5h，洗涤后的酶解鱼鳞与去离子水混合质量比为1︰10，水浴加热升温后温度为90～95℃，灭酶时间为10～15min，降温后温度为55～60℃，保温浓缩时间为6～7h。
步骤（4）所述的醋酸溶液的质量分数为2%，调节ph为5.2～5.6，烷基酰胺丙基二甲基胺甜菜碱溶液的质量分数为20%，加热升温后温度为100～120℃，干燥时间为2～3h。
步骤（5）所述的加热升温后温度为70～80℃，控制真空抽气机内真空度为100～200pa，静置脱泡时间为3～4h，冷冻干燥温度为-50～-30℃，冷冻干燥时间为2～3h。
本发明的有益效果是：
（1）本发明以桑树皮为原料，经过酸浸处理后，放入氢氧化钠溶液、多聚磷酸钠溶液和硅酸钠溶液的混合液中，水浴蒸煮后过滤得到碱煮桑皮，将碱煮桑皮再次酸浸中和后，经过木锤敲打、水洗干燥得到脱胶桑皮纤维，将脱胶桑皮纤维与n-甲基吗啉水溶液混合放入旋转蒸发仪中，添加没食子酸丙酯，旋转蒸发得到胶状纺丝原液，取草鱼干鱼鳞加入无菌去离子水中，用胰蛋白酶酶解、再过滤得到酶解鱼鳞，将酶解鱼鳞与去离子水混合，在高温条件下灭酶除菌，再降温浓缩得到明胶液，以废弃的虾壳为原料，经过酸浸、碱煮得到凝胶，再将凝胶干燥得到壳聚糖粉末，配制壳聚糖酸液，将烷基酰胺丙基二甲基胺甜菜碱溶液与壳聚糖酸液混合，经过离心分离、干燥得到羧基化壳聚糖，将羧基化壳聚糖、明胶液、固体双氧水、茶多酚等物质混合，置于高速分散机中高速分散得到混合胶液，最后将混合胶液倒入流延成型机中流延成型，再干燥得到清洁型杀菌明胶膜，本发明所制备的清洁型杀菌明胶膜会吸收空气中的水分，再分散形成胶体，烷基酰胺丙基二甲基胺甜菜碱作为一种表面活性物质，附着在止血海绵表面，由于它能够水解生成碱性阳离子使止血海绵的吸水性能提高，并且改变止血海绵的表面活性，提升吸液面积；
（2）本发明所制备止血海绵是以生物质纤维中的黄酮物质、茶多酚，固体双氧水等抗氧化物质来达到抑菌效果，所用生物质桑皮纤维内层沿纵向分布着较深的条纹，且有中腔结构，具有较多的微孔，桑皮纤维经过n-甲基吗啉水溶液处理过后，纤维的分子量降低，使得纤维间的黄酮类物质分散至桑皮纤维内部的微孔中，经过凝固浴凝固后，n-甲基吗啉会溶解至凝固浴中，黄酮类物质穿插固定于桑皮纤维内部条纹中，桑皮纤维通过硅酸钠与纤维素中羟基以氢键吸引，使得纤维与黄酮类物质的粘合力增大，而黄酮类物质对大肠杆菌、葡萄球菌等有抑制生长的效果，它在纤维中附着结合力强，抑菌效果持久，低分子量的纤维素也会使纤维的网状结构分布密度增大，从而使得桑皮纤维抑菌性增强，韧性提高，本发明止血海绵以纤维为物理支撑海绵体，提高其封闭创面的止血功能，壳聚糖经过羧基化后，极易水溶且锁水性强，并且它会电离出丰富的氨基阳离子能与机体内带负电荷的红细胞发生电性吸附形成血凝块止血，止血效果明显，应用前景广阔。
具体实施方式
取100～120g桑树皮放入400～450ml质量分数为30%的硫酸溶液中浸泡，控制浸泡温度为50～55℃，浸泡处理时间为1～2h，取出酸浸处理的桑树皮置于水浴锅中，加热升温至90～100℃，向水浴锅中加入100～120ml质量分数为40%的氢氧化钠溶液、50～60ml质量分数为4%的多聚磷酸钠溶液、30～40ml质量分数为6%的硅酸钠溶液，蒸煮2～3h后，过滤，去除滤液得到碱煮桑皮；将上述碱煮桑皮用150～180ml质量分数为10%的盐酸浸泡8～10min后，取出浸泡后的桑皮用木锤敲打30～35min，并用水冲洗3～5次后放入烘箱中，加热升温至100～110℃，干燥10～12h，得到脱胶桑皮纤维；配制质量分数为30%的n-甲基吗啉水溶液，将n-甲基吗啉水溶液与脱胶桑皮纤维按质量比为15︰1混合，得到230～250ml的混合液，将混合液放入旋转蒸发仪中，同时向旋转蒸发仪中添加5～10ml没食子酸丙酯，加热升温至90～95℃，以110～130r/min的转速旋转蒸发30～40min，得到胶状纺丝原液；取40～50g草鱼干鱼鳞加入装有400～450ml无菌去离子水的烧杯中，将烧杯水浴加热，升温至35～40℃，再将4～5g胰蛋白酶加入烧杯中，保温酶解4～5h，过滤去除滤液，得到酶解鱼鳞，将酶解鱼鳞用去离子水洗涤3～5次，再将洗涤后的酶解鱼鳞与去离子水按质量比为1︰10混合，水浴加热升温至90～95℃，灭酶10～15min，降温至55～60℃，保温浓缩6～7h，得到明胶液；将50～55g壳聚糖粉末置于烧杯，向烧杯中加入质量分数为2%的醋酸溶液，调节ph至5.2～5.6，得到壳聚糖酸液，将质量分数为20%的烷基酰胺丙基二甲基胺甜菜碱溶液与壳聚糖酸液等体积混合，置于高速离心机中以4000～4200r/min的转速离心15～20min，去除上层液，得到沉淀物，将沉淀物置于烘箱中，加热升温至100～120℃，干燥2～3h，得到羧基化壳聚糖；按重量份数计，将20～30份羧基化壳聚糖、50～60份明胶液、15～20份固体双氧水、100～120份去离子水、10～15份茶多酚混合，置于高速分散机中以3000～3300r/min的转速高速分散13～15min，得到混合胶液，将胶状纺丝原液置于真空抽气机中，加热升温至70～80℃，控制真空抽气机内真空度为100～200pa，静置脱泡3～4h后倒入注射泵，挤压喷出纤维原丝至混合胶液中，得到海绵体，再将海绵体置于冷冻干燥机中，在-50～-30℃条件下冷冻干燥2～3h，得到生物质止血海绵。
取100g桑树皮放入400ml质量分数为30%的硫酸溶液中浸泡，控制浸泡温度为50℃，浸泡处理时间为1h，取出酸浸处理的桑树皮置于水浴锅中，加热升温至90℃，向水浴锅中加入100ml质量分数为40%的氢氧化钠溶液、50ml质量分数为4%的多聚磷酸钠溶液、30ml质量分数为6%的硅酸钠溶液，蒸煮2h后，过滤，去除滤液得到碱煮桑皮；将上述碱煮桑皮用150ml质量分数为10%的盐酸浸泡8min后，取出浸泡后的桑皮用木锤敲打30min，并用水冲洗3次后放入烘箱中，加热升温至100℃，干燥10h，得到脱胶桑皮纤维；配制质量分数为30%的n-甲基吗啉水溶液，将n-甲基吗啉水溶液与脱胶桑皮纤维按质量比为15︰1混合，得到230ml的混合液，将混合液放入旋转蒸发仪中，同时向旋转蒸发仪中添加5ml没食子酸丙酯，加热升温至90℃，以110r/min的转速旋转蒸发30min，得到胶状纺丝原液；取40g草鱼干鱼鳞加入装有400ml无菌去离子水的烧杯中，将烧杯水浴加热，升温至35℃，再将4g胰蛋白酶加入烧杯中，保温酶解4h，过滤去除滤液，得到酶解鱼鳞，将酶解鱼鳞用去离子水洗涤3次，再将洗涤后的酶解鱼鳞与去离子水按质量比为1︰10混合，水浴加热升温至90℃，灭酶10min，降温至55℃，保温浓缩6h，得到明胶液；将50g壳聚糖粉末置于烧杯，向烧杯中加入质量分数为2%的醋酸溶液，调节ph至5.2，得到壳聚糖酸液，将质量分数为20%的烷基酰胺丙基二甲基胺甜菜碱溶液与壳聚糖酸液等体积混合，置于高速离心机中以4000r/min的转速离心15min，去除上层液，得到沉淀物，将沉淀物置于烘箱中，加热升温至100℃，干燥2h，得到羧基化壳聚糖；按重量份数计，将20份羧基化壳聚糖、50份明胶液、15份固体双氧水、100份去离子水、10份茶多酚混合，置于高速分散机中以3000r/min的转速高速分散13min，得到混合胶液，将胶状纺丝原液置于真空抽气机中，加热升温至70℃，控制真空抽气机内真空度为100pa，静置脱泡3h后倒入注射泵，挤压喷出纤维原丝至混合胶液中，得到海绵体，再将海绵体置于冷冻干燥机中，在-50℃条件下冷冻干燥2h，得到生物质止血海绵。
取110g桑树皮放入420ml质量分数为30%的硫酸溶液中浸泡，控制浸泡温度为52℃，浸泡处理时间为1.5h，取出酸浸处理的桑树皮置于水浴锅中，加热升温至95℃，向水浴锅中加入110ml质量分数为40%的氢氧化钠溶液、55ml质量分数为4%的多聚磷酸钠溶液、35ml质量分数为6%的硅酸钠溶液，蒸煮2.5h后，过滤，去除滤液得到碱煮桑皮；将上述碱煮桑皮用165ml质量分数为10%的盐酸浸泡9min后，取出浸泡后的桑皮用木锤敲打32min，并用水冲洗4次后放入烘箱中，加热升温至105℃，干燥11h，得到脱胶桑皮纤维；配制质量分数为30%的n-甲基吗啉水溶液，将n-甲基吗啉水溶液与脱胶桑皮纤维按质量比为15︰1混合，得到240ml的混合液，将混合液放入旋转蒸发仪中，同时向旋转蒸发仪中添加7ml没食子酸丙酯，加热升温至92℃，以120r/min的转速旋转蒸发35min，得到胶状纺丝原液；取45g草鱼干鱼鳞加入装有420ml无菌去离子水的烧杯中，将烧杯水浴加热，升温至37℃，再将4g胰蛋白酶加入烧杯中，保温酶解4.5h，过滤去除滤液，得到酶解鱼鳞，将酶解鱼鳞用去离子水洗涤4次，再将洗涤后的酶解鱼鳞与去离子水按质量比为1︰10混合，水浴加热升温至92℃，灭酶12min，降温至57℃，保温浓缩6.8h，得到明胶液；将52g壳聚糖粉末置于烧杯，向烧杯中加入质量分数为2%的醋酸溶液，调节ph至5.4，得到壳聚糖酸液，将质量分数为20%的烷基酰胺丙基二甲基胺甜菜碱溶液与壳聚糖酸液等体积混合，置于高速离心机中以4100r/min的转速离心17min，去除上层液，得到沉淀物，将沉淀物置于烘箱中，加热升温至110℃，干燥2.5h，得到羧基化壳聚糖；按重量份数计，将25份羧基化壳聚糖、55份明胶液、17份固体双氧水、110份去离子水、12份茶多酚混合，置于高速分散机中以3150r/min的转速高速分散14min，得到混合胶液，将胶状纺丝原液置于真空抽气机中，加热升温至75℃，控制真空抽气机内真空度为150pa，静置脱泡3.5h后倒入注射泵，挤压喷出纤维原丝至混合胶液中，得到海绵体，再将海绵体置于冷冻干燥机中，在-40℃条件下冷冻干燥2.5h，得到生物质止血海绵。
取120g桑树皮放入450ml质量分数为30%的硫酸溶液中浸泡，控制浸泡温度为55℃，浸泡处理时间为2h，取出酸浸处理的桑树皮置于水浴锅中，加热升温至100℃，向水浴锅中加入120ml质量分数为40%的氢氧化钠溶液、60ml质量分数为4%的多聚磷酸钠溶液、40ml质量分数为6%的硅酸钠溶液，蒸煮3h后，过滤，去除滤液得到碱煮桑皮；将上述碱煮桑皮用180ml质量分数为10%的盐酸浸泡10min后，取出浸泡后的桑皮用木锤敲打35min，并用水冲洗5次后放入烘箱中，加热升温至110℃，干燥12h，得到脱胶桑皮纤维；配制质量分数为30%的n-甲基吗啉水溶液，将n-甲基吗啉水溶液与脱胶桑皮纤维按质量比为15︰1混合，得到250ml的混合液，将混合液放入旋转蒸发仪中，同时向旋转蒸发仪中添加10ml没食子酸丙酯，加热升温至95℃，以130r/min的转速旋转蒸发40min，得到胶状纺丝原液；取50g草鱼干鱼鳞加入装有450ml无菌去离子水的烧杯中，将烧杯水浴加热，升温至40℃，再将5g胰蛋白酶加入烧杯中，保温酶解5h，过滤去除滤液，得到酶解鱼鳞，将酶解鱼鳞用去离子水洗涤5次，再将洗涤后的酶解鱼鳞与去离子水按质量比为1︰10混合，水浴加热升温至95℃，灭酶15min，降温至60℃，保温浓缩7h，得到明胶液；将55g壳聚糖粉末置于烧杯，向烧杯中加入质量分数为2%的醋酸溶液，调节ph至5.6，得到壳聚糖酸液，将质量分数为20%的烷基酰胺丙基二甲基胺甜菜碱溶液与壳聚糖酸液等体积混合，置于高速离心机中以4200r/min的转速离心20min，去除上层液，得到沉淀物，将沉淀物置于烘箱中，加热升温至120℃，干燥3h，得到羧基化壳聚糖；按重量份数计，将30份羧基化壳聚糖、60份明胶液、20份固体双氧水、120份去离子水、15份茶多酚混合，置于高速分散机中以3300r/min的转速高速分散15min，得到混合胶液，将胶状纺丝原液置于真空抽气机中，加热升温至80℃，控制真空抽气机内真空度为200pa，静置脱泡4h后倒入注射泵，挤压喷出纤维原丝至混合胶液中，得到海绵体，再将海绵体置于冷冻干燥机中，在-30℃条件下冷冻干燥3h，得到生物质止血海绵。
对比例以广州某公司生产的生物质止血海绵作为对比例对本发明制得的生物质止血海绵和对比例中的生物质止血海绵进行性能检测，检测结果如表1所示：
测试方法：
吸液率测定方法：将实施例1～3和对比例中的止血海绵切割为相同规格大小，观察其吸水室温下纯水的倍数及孔隙率；
止血试验：取实例1～3和对比例中的止血海绵切割成相同规格大小对兔耳出血模型和兔股动脉出血模型进行止血，测得止血时间；
拉伸强度测试采用海绵拉伸强度测试机进行检测；
断裂伸长率测试采用海绵泡沫断裂伸长率检测仪进行检测；
大肠杆菌平均菌数测试按jc/t897-2002的规定进行抑菌性能检测；
金黄色葡萄球菌平均菌数测试按jc/t897-2002的规定进行抑菌性能检测；
白色念球菌抑菌率的测试按gb/t20944.2-2007的规定进行性能检测。
表1止血海绵性能测定结果
根据上述中数据可知本发明制得的吸液倍数高，吸液率高，用于兔子耳缘动脉出血模型的止血时间为35s，用于兔子股动脉出血模型的止血时间为185s，由以上数据可知本发明生止血海绵的止血速度快，能有效止血，拉伸强度和断裂伸长率高，力学性能好，抑菌率高，具有广阔的应用前景。