本发明涉及细胞生物学
技术领域：
，更具体地说，本发明涉及一种治疗动脉粥样硬化的多效因子注射液及制备方法。
背景技术：
：心血管系统是当今严重威胁人类健康常见的重要疾病。在我国和欧美等一些发达国家，心血管系统疾病的发病率和死亡率均居第一位。动脉粥样硬化(atherosclerosis)是心血管疾病中最常见的疾病，主要累及大、中动脉。我国as发病率呈上升趋势，多见于中、老年人，以40-50岁发展最快。人类对动脉粥样疾病的相关研究已有100余年的历史。随着社会的发展和生活水平的提高，感染性疾病所导致的死亡不断减少，而动脉粥样硬化疾病导致的死亡迅速增多，目前已成为全球人口死亡的首位原因。动脉粥样硬化(atherosclerosis，as)是老年人心脑血管疾病发生的主要诱因，血管的衰老和动脉粥样硬化的发生在生理生化指标上有很多共同特点，有相同的生化通路，某些信号通路的改变直接导致血管内皮细胞生长缓慢修复能力降低和形态的改变，因此血管内皮细胞衰老是as的病理生理机制之一，血管内皮细胞衰老出现在as形成之前，并且和as的发生成正相关，血管内皮细胞衰老是as发生的主要诱因。目前，治疗动脉粥样硬化的方法分为综合治疗、药物治疗和手术治疗。综合治疗是控制饮食、加强体育锻炼和其他生活方式的改变。但此种方法只能起到预防的作用，并不能缓解已形成的疾病。目前多数国内外西医研究者采用的方法为经皮介入治疗、长期抗血栓形成及抗凝治疗，或采用大剂量降脂药物来使破裂或腐蚀板块稳定。但是以上方法所使用的药物在长期服用时，会造成肝肾功能损伤等副作用，不利于患者恢复健康；同时治疗费用较高，对于患者的负担较重。因此，动脉粥样硬化急需一种有效的治疗方法。技术实现要素：本发明的一个目的是解决至少上述问题，并提供至少后面将说明的优点。本发明还有一个目的是提供了一种能够有效的延缓内皮细胞衰老，从而预防和防治动脉粥样硬化的治疗动脉粥样硬化的多效因子注射液及其制备方法。为了实现上述目的，本发明公开了一种治疗动脉粥样硬化的多效因子注射液，包括以下组分：浓度为400ng/ml～200μg/ml的间充质干细胞多效因子液、质量体积比为1％～5％的人血白蛋白、质量体积比为1％～5％的复方维生素、质量体积比为1％～8％的甘露醇、质量体积比为0.5％～2.5％的葡萄糖以及余量的生理盐水。间充质干细胞(mesenchymalstemcell，mscs)是干细胞家族的重要成员，因其具有多向分化潜能、自我更新能力，以及分泌多种因子参与损伤的组织与器官的修复与再生而被广泛应用于多种疾病的治疗。间充质干细胞在生长过程中能产生各种生物活性物质，如神经生长因子、基质红细胞源性生长因子、血管内皮细胞生长因子、表皮生因子、白细胞介素-6、白细胞介素-7、巨核细胞集落刺激因子、肿瘤坏死因子、干扰素等。目前的研究认为，这些生物活性物质使间充质干细胞具有免疫调节、降低炎症的功能，从而对受体组织和器官进行调节控制，并达到对其进行生理性修复和再生等作用。优选地，本发明所述的治疗动脉粥样硬化的多效因子注射液，包括以下组分：浓度为100μg/ml的间充质干细胞多效因子液、质量体积比为2％的人血白蛋白、质量体积比为2％的复方维生素、质量体积比为5％的甘露醇、质量体积比为1.5％的葡萄糖以及余量的生理盐水。本发明还公开了一种治疗动脉粥样硬化的多效因子注射液的制备方法，包括如下步骤：步骤一、取新鲜胎儿脐带，进行分离、培养、传代，当传至第三代时，收集上层培养液，得到间充质干细胞多效因子液；步骤二、按照权利要求1所述的配方，配制并称取质量体积比为1％～5％的人血白蛋白、质量体积比为1％～5％的复方维生素、质量体积比为1％～8％的甘露醇及质量体积比为0.5％～2.5％的葡萄糖，并混匀；步骤三、将浓度为400ng/ml～200μg/ml的间充质干细胞上清液重悬于步骤二混匀后的液体中，并加入余量的生理盐水，制备得到治疗动脉粥样硬化的多效因子注射液。优选地，本发明中，所述步骤一中，间充质干细胞多效因子液的制备过程为：a)、取新鲜足月健康胎儿脐带，冲洗去除血渍，剥离华尔通氏胶，将剥离后的华尔通氏胶剪成小于1mm3的小块；b)、将剪碎的华尔通氏胶均匀涂布于细胞培养器的底部，向所述细胞培养器中缓慢加入无血清培养基，置于在37℃、5v/v％co2、饱和湿度环境中培养；c)、将培养7天后更换无血清培养液，待培养至细胞达到70％的融合，移去无血清培养液，添加浓度分别为0.25％和0.1％的胰蛋白酶-乙二胺四乙酸钠消化1min，细胞收缩脱离瓶壁，此时加入先前移去的培养上清液，中和胰蛋白酶-edta溶液，并使用移液管轻轻吹打，将细胞悬液移入50ml离心管，离心后除去上清液，重新加入无血清完全培养基将离心后的细胞重悬；d)、按照1传1.5接种10cm培养皿，待细胞培养融合60～80％时进行传代培养，将第三代脐带间充质干细胞每毫升接种1×105个细胞，置于5v/v％co2、37℃培养箱中培养72h后收集上清液，制成间充质干细胞多效因子液。优选地，本发明中，所述d)中还包括对收集的上清液进行离心和过滤，具体为：离心转速为1800～3000rpm，离心时间为15min，收集离心后的上清液；使用10nm～50nm的滤膜对离心后的上清液进行过滤，收集滤液得到间充质干细胞多效因子液。优选地，本发明中，所述a)中，使用含2倍100u/ml青霉素和链霉素的生理盐水冲洗去除血渍。优选地，本发明中，所述c)中，离心的转速为1000rpm，离心时间为5min。本发明公开的治疗动脉粥样硬化的多效因子注射液在制备治疗动脉粥样硬化药物的应用。本发明所述的治疗动脉粥样硬化的多效因子注射液可制作成用于全身给药的制剂中，更优选通过注射，以确保其有效的扩散到全身的血流。本发明至少包括以下有益效果：1、本发明提供的治疗动脉粥样硬化的多效因子注射液能够有效的延缓内皮细胞衰老，从而预防和治疗动脉粥样硬化。2、本发明提供的治疗动脉粥样硬化的多效因子注射液中的间充质干细胞的使用保证了治疗动脉粥样硬化的多效因子注射液延缓血管内皮细胞衰老的功效。3、本发明提供的治疗动脉粥样硬化的多效因子注射液在制备治疗动脉粥样硬化药物的应用，通过注射确保有效的扩散到全身血流。本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。附图说明图1为本发明所述的治疗动脉粥样硬化的多效因子注射液的β-gal染色结果。图2为本发明所述的治疗动脉粥样硬化的多效因子注射液的huvecp16ink4a蛋白表达结果。具体实施方式下面结合附图及实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不排除一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。实施例1本发明公开了一种治疗动脉粥样硬化的多效因子注射液，包括以下组分：浓度为400ng/ml的间充质干细胞多效因子液、质量体积比为1％的人血白蛋白、质量体积比为5％的复方维生素、质量体积比为3％的甘露醇、质量体积比为0.5％的葡萄糖及余量的生理盐水。实施例2本发明公开了一种治疗动脉粥样硬化的多效因子注射液，包括以下组分：浓度为800ng/ml的间充质干细胞多效因子液、质量体积比为3％的人血白蛋白、质量体积比为1％的复方维生素、质量体积比为5％的甘露醇、质量体积比为2.5％的葡萄糖及余量的生理盐水。实施例3本发明公开了一种治疗动脉粥样硬化的多效因子注射液，包括以下组分：浓度为10μg/ml的间充质干细胞多效因子液、质量体积比为2％的人血白蛋白、质量体积比为3％的复方维生素、质量体积比为2％的甘露醇、质量体积比为1％的葡萄糖及余量的生理盐水。实施例4本发明公开了一种治疗动脉粥样硬化的多效因子注射液，包括以下组分：浓度为50μg/ml的间充质干细胞多效因子液、质量体积比为1.5％的人血白蛋白、质量体积比为4％的复方维生素、质量体积比为6％的甘露醇、质量体积比为2％的葡萄糖及余量的生理盐水。实施例5本发明公开了一种治疗动脉粥样硬化的多效因子注射液，包括以下组分：浓度为100μg/ml的间充质干细胞多效因子液、质量体积比为2％的人血白蛋白、质量体积比为2％的复方维生素、质量体积比为5％的甘露醇、质量体积比为1.5％的葡萄糖和余量的生理盐水。实施例6本发明公开了一种治疗动脉粥样硬化的多效因子注射液，包括以下组分：浓度为200μg/ml的间充质干细胞多效因子液、质量体积比为5％的人血白蛋白、质量体积比为5％的复方维生素、质量体积比为8％的甘露醇、质量体积比为1.5％的葡萄糖及余量的生理盐水。本发明实施例1～实施例6中所述的治疗动脉粥样硬化的多效因子注射液的制备过程为：步骤一、取新鲜胎儿脐带，进行分离、培养、传代，当传至第三代时，收集上层培养液，得到间充质干细胞多效因子液；步骤二、按照权利要求1所述的配方，配制并称取质量体积比为1％～5％的人血白蛋白、质量体积比为1％～5％的复方维生素、质量体积比为1％～8％的甘露醇及质量体积比为0.5％～2.5％的葡萄糖，并混匀；步骤三、将浓度为400ng/ml～200μg/ml的间充质干细胞多效因子液重悬于步骤二混匀后的液体中，并加入余量的生理盐水，制备得到治疗动脉粥样硬化的多效因子注射液。同时，步骤一中，间充质干细胞的制备过程为：在超净工作台中进行操作，取新鲜足月健康胎儿脐带，用含2倍100u/ml青霉素和链霉素的生理盐水冲洗去除血渍，将华尔通氏胶剥离，将剥离后的华尔通氏胶剪成1立方毫米以下块状，将块状的华尔通氏胶均匀涂布在细胞培养器底部，向细胞培养器中缓慢加入10ml无血清培养基，置37℃、体积分数为5％的二氧化碳、饱和湿度培养箱中培养。将原代细胞培养7天后，更换无血清培养液，培养至细胞达到70％的融合，移去无血清培养液，添加浓度分别为0.25％和0.1％的胰蛋白酶-乙二胺四乙酸钠(edta)消化1min，脐带msc收缩脱离瓶壁，此时加入先前移去的培养上清液，中和胰蛋白酶-edta溶液，并使用移液管轻轻吹打，将脐带msc悬液移入50ml离心管。1000rpm离心5min，去除上清液；重新加入无血清完全培养基将msc重悬，并计数。按照1传1.5接种10cm培养皿。msc培养融合70％左右时参照上述方法传代培养。将p3代脐带间充质干细胞每毫升接种1×105个细胞，置于5v/v％co2、37℃培养箱中培养72h，72h后收集上清液，对收集的上清液进行离心和过滤，离心转速为1800～3000rpm，离心时间为15min，收集离心后的上清液；使用10nm～50nm的滤膜对离心后的上清液进行过滤，收集滤液得到间充质干细胞上清液，制成间充质干细胞多效因子液。以实施例5为例，对实施例5所述的间充质干细胞进行衰老性能测试：一、制备angⅱ诱导的huvec衰老模型将huvec贴壁生长于含10％胎牛血清的无酚红培养基中，置于5v/v％co2、37℃培养箱中培养，24h换液以维持良好生长状态。用0.25％胰蛋白酶进行消化﹑传代，待细胞长至亚融合时无血清培养12h，使细胞达到同步化。加入angⅱ3μg/ml，持续刺激48h，第12小时﹑24小时各补充angⅱ一次即为angⅱ诱导的huvec衰老模型。二、制备本发明提供的实施例的实验组使用不含angⅱ的上述培养液培养实施例5所述的治疗动脉粥样硬化的多效因子注射液48h。三、制备对照组向实施例5所述的治疗动脉粥样硬化的多效因子注射液中加入angⅱ，第12小时、24小时各补充angⅱ一次，第23小时补充多效因子液一次，多效因子液的终浓度为200ng/ml-400ng/ml，angⅱ的终浓度为3μg/ml-5μg/ml，持续刺激48h。本发明对huvec衰老模型、实验组和对照组进行了衰老细胞鉴定：β-半乳糖苷酶(β-gal)是一种可鉴定衰老细胞生物学标志物，按照β-gal染色试剂盒(碧云天公司)说明书进行操作及相关试剂配置：用pbs(ph为7.2)清洗各组细胞，加入适量细胞固定工作液，用pbs清洗细胞3次，加入适量细胞固定工作液，在37℃孵育16h，普通光学显微镜下观察，待出现细胞蓝染时，去除染色液，加入pbs后观察计数。每组标本随机选取视野，观察1000个细胞，细胞质蓝染者为衰老细胞，计数衰老细胞占观察细胞总数的百分比。对huvec衰老模型、对照组和实验组进行细胞周期变化测试、p16ink4a免疫细胞化学染色检测、westernblot检测p16ink4a蛋白水平。1、细胞周期变化每组细胞以0.25％胰蛋白酶消化，收集细胞，用预冷的磷酸盐缓冲液洗涤2次，调整细胞数至1×109个/l，逐滴加入预冷的70％乙醇固定，1kr/min离心，磷酸盐缓冲液洗2次后悬浮于0.5mlpbs中，缓慢加入5ml冷乙醇，4℃固定过夜。4℃过夜。次日，1kr/min离心，磷酸盐缓冲液洗涤，加入0.5ml的碘化丙啶(propidiumiodide，pi终浓度50mg/l)，4℃避光反应30min。流式细胞仪分析检测细胞周期变化。每组细胞分别为huvec衰老模型、实验组和对照组。2、p16ink4a免疫细胞化学染色检测将各组细胞分组干预后，细胞爬片，pbs洗细胞，采用sp法进行免疫组化染色，dab显色，常规脱水、透明、封固。在40×10倍的光镜视野下，分别对相邻切片的p16ink4a染色阳性细胞进行统计，每张切片随机数3个视野，求出均值用表示，得出阳性细胞百分率。3、westernblot检测p16ink4a蛋白水平收集各组细胞，用冷pbs洗2次，加入预冷的含1％蛋白酶抑制剂的ripa裂解液充分裂解细胞，4℃，14kr/min离心10min，取上清分装，－20℃保存待用。根据bca蛋白浓度定量试剂盒操作说明测定蛋白样品浓度，每个样品上样量为20μl，蛋白经过sds-page凝胶电泳分离后至pvdf膜，5％脱脂奶粉的tbst室温下缓慢摇动封闭60min，加入一抗(兔抗人p16ink4a，1:100)在4℃摇床孵育过夜，tbst洗涤后，与二抗(1:1000)室温摇床孵育0.5h，常规洗膜化学发光试剂显色，alphaimager图象处理系统扫描测定感光区带平均积分吸光度。统计学处理计量结果以x±s表示，采用spss13.0软件进行统计学分析，数据资料比较采用单因素方差分析，p＜0.05为差异有显著性。结果：衰老相关的β-半乳糖苷酶(β-gal)染色β-gal是一种鉴别细胞衰老的生物学标志，在ph值6.0条件下，随细胞老化，胞内产生的蓝色沉淀物也越多即染色阳性，产物也增多，如图1所示，β-gal染色结果显示：实验组细胞几乎不表达β-gal蓝染细胞；angⅱ诱导组β-gal蓝染阳性细胞数明显增加，为81.24％±6.46％；对照组β-gal染色阳性率明显低于angⅱ诱导组，有统计学意义(p＜0.05)。细胞周期分析流式细胞仪分析显示实验组huvec的各期比例正常；angⅱ诱导组大部分huvec停滞于g0/g1期，s期及g2/m期趋于消失，对照组s期及g2/m期细胞明显增多(表1)。表1.各组huvec的衰老指标比较(x±s)g0～g1phaseg2～mphasesphase实验组48.25％±5.10％20.46％±2.24％30.29％±2.66％angii诱导组88.36％±6.45％3.18％±0.33％7.56％±0.42％对照组60.10％±5.26％16.34％±2.2o％24.46％±3.10％p16ink4a蛋白表达抑癌基因p16ink4a能在抑制细胞生长、促进细胞衰老方面发挥着重要的生物学作用。p16ink4a基因主要通过p16ink4a-cyclin/ckd-rb信号转导途径调控细胞周期，其是细胞周期调控的关键因子，一旦收到来自p16ink4a途径的衰老信号后，p16ink4a蛋白就成为调控衰老过程的中心环节，停止增殖且发生一系列衰老形态和功能上的变化。因此，通过p16ink4a的表达来检测血管内皮细胞的衰老。如图2所示，图2中左数第二个为实验组，依次类推。与实验组比较，angⅱ诱导组p16ink4a表达明显升高(p＜0.01)；与angⅱ诱导组相比，对照组p16ink4a表达降低(p＜0.05)，表明对照组通过下调p16ink4a蛋白的表达延缓血管内皮细胞衰老。尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节与这里示出与描述的图例。当前第1页12