本发明涉及一种超声示踪的超声造影剂，具体涉及一种用于干细胞超声示踪的超声造影剂及其制备方法。
背景技术：
干细胞(stemcell)是一类具有自我复制能力的多向分化潜能细胞,它的种类包括胚胎干细胞、骨髓间充质干细胞、造血干细胞、神经干细胞、肌腱干细胞等等。目前,干细胞已经被广泛应用于医学的多个领域，如细胞替代治疗、基因治疗、组织工程、再生医学等，而干细胞再生医学的发展正在为现代医学带来一场变革。对于干细胞移植疗法，如何让移植干细胞准确分布到损伤部位并维持其高的存活率以保障干细胞疗法的疗效，以及如何保障干细胞疗法的安全性，是目前干细胞疗法及其临床转化亟需解决的关键问题。因此，发展可以对移植干细胞在活体内的情况进行原位示踪的活体影像技术，这对于干细胞的基础研究及其临床转化都具有重要意义。
近年来随着分子影像学的发展，“超声分子影像学”逐渐成为研究热点，超声成像技术可体内示踪、实时监测干细胞,并且无创、无毒、无放射性污染,具有实时动态、成像速度快、多次重复观察,敏感度高等优点。同时，通过超声实时成像指导干细胞移植疗法可防止注射失误以确保足够的细胞递送到目标治疗位置，并通过超声图像反映移植的干细胞的生存能力和数量来监测治疗效果，达到了辅助增强干细胞治疗的效果。
在现有技术中，对于干细胞的超声示踪成像，国内其他课题组中有极个别类似研究，如用微米级别的超声微泡标记干细胞，形成干细胞－微泡共同体，但普通脂质微泡粒径多为微米级且稳定性能差，使该体系示踪时间较短，未能满足干细胞移植治疗的临床需求；且我们用cd90修饰脂质plga纳米微泡造影剂，使其能被干细胞特异性内吞，辅助增强了干细胞的造影能力，因此，本发明具有更高的实用性和成像效果。
技术实现要素：
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种用于干细胞超声示踪的超声造影剂。
本发明中所使用的脂质plga纳米微泡是一种多功能超声造影剂，该材料相较于普通脂质微泡，具有稳定性高、体内循环时间长、粒径较小，可穿过内皮间隙到达靶区的优势。本发明利用干细胞表面大量表达cd90抗原分子的特性，采用生物素－链霉亲和素桥接作用将生物素化的cd90抗体与脂质plga纳米微泡相连，制备了cd90靶向脂质plga纳米微泡，通过抗原抗体介导的内吞作用，可增强干细胞的吞噬。因此，在本发明中，构建了基于干细胞表面cd90抗原与抗体嵌合介导的脂质plga纳米微泡－干细胞复合体，并且通过动物实验验证了该复合体的体外超声造影能力。
本发明一个方面提供了一种用于干细胞超声示踪的超声造影剂，所述超声造影剂包括cd90靶向的脂质plga纳米微泡和干细胞；所述cd90靶向的脂质plga纳米微泡包括plga外壳和空气内核，所述plga外壳表面连接有cd90抗体；所述干细胞内吞cd90靶向的脂质plga纳米微泡。
在具体的技术方案中，所述plga外壳由聚乳酸-羟基乙酸共聚物(plga)和二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺(dspe)-聚乙二醇(peg)-生物素混合而成。
在具体的技术方案中，所述聚乙二醇修饰的二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺中的peg选自peg1000-peg4000，优选为peg2000。
在具体的技术方案中，所述聚乳酸-羟基乙酸共聚物和二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-生物素之间的质量比为(100-300):1，优选为200:1。
在具体的技术方案中，所述cd90抗体经过生物素修饰形成生物素化的cd90抗体，链霉亲和素一端与生物素化的二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺－聚乙二醇连接，一端与生物素化的cd90抗体连接，通过生物素－链霉素反应，形成生物素－链霉素－生物素结构。
在具体的技术方案中，cd90靶向的脂质plga纳米微泡通过以下方法制备而成：
(1)将plga和dspe-peg-生物素溶于有机溶剂中；
(2)加入nh4hco3水溶液于步骤(1)所的的混合液中，然后进行乳化；
(3)将步骤(2)所的乳化液加入pva溶液中，均质后，反应完全即得生物素化的脂质plga纳米微泡；
(4)将生物素化的脂质plga纳米微泡与cd90抗体通过生物素－链霉亲和素反应连接制备cd90靶向脂质plga纳米微泡。
本发明另一个方面提供了用于干细胞超声示踪的超声造影剂的制备方法，包括如下步骤：
(1)将plga和dspe-peg-生物素溶于有机溶剂中；
(2)加入nh4hco3水溶液于步骤(1)所得的混合液中，然后进行乳化；
(3)将步骤(2)所的乳化液加入pva溶液中，均质后，反应完全即得生物素化的脂质plga纳米微泡；
(4)将生物素化的脂质plga纳米微泡与cd90抗体通过生物素－链霉亲和素反应连接制备cd90靶向脂质plga纳米微泡；
(5)cd90靶向脂质plga纳米微泡与干细胞通过抗原抗体反应介导干细胞的内吞作用，得到用于干细胞超声示踪的超声造影剂。
本发明在一个方面提供了用于干细胞超声示踪的超声造影剂在制备超声实时成像指导干细胞移植治疗、辅助监测干细胞治疗的药物或检测试剂中的用途。本发明所用的干细胞为市售骨髓间充质干细胞。
有益效果：
(1)本发明构建的cd90靶向脂质plga纳米微泡超声造影剂，其靶点在干细胞表面大量表达，增强了干细胞的内吞作用，使修饰过的干细胞的超声成像能力增强。
(2)本发明所构建脂质plga纳米微泡，制作工艺简单，生物安全性高，同时它在体内的较强稳定性保证了该复合体拥有足够的成像时间。
(3)本发明实现了用超声技术观察干细胞，是干细胞示踪技术的一大进步，通过超声实时成像指导干细胞移植疗法可辅助增强治疗效果。
参考文献：
1.ayerm,klokha.cell-mediateddeliveryofsyntheticnano-andmicroparticles.jcontrolrelease.2017；259:92-104.
2.caof,lins,xiex,rayp,patelm,zhangx,etal.invivovisualizationofembryonicstemcellsurvival,proliferation,andmigrationaftercardiacdelivery.circulation.2006；113(7):1005-14.
3.chenf,hableelg,zhaoer,jokerstjv.multifunctionalnanomedicinewithsilica:roleofsilicainnanoparticlesfortheranostic,imaging,anddrugmonitoring.jcolloidinterfacesci.2018；521:261-79.
4.chenf,mam,wangj,wangf,chernsx,zhaoer,etal.exosome-likesilicananoparticles:anovelultrasoundcontrastagentforstemcellimaging.nanoscale.2017；9(1):402-11.
5.cheny,zhangc,shens,guos,zhongl,lix,etal.ultrasound-targetedmicrobubbledestructionenhancesdelayedbmcdeliveryandattenuatespost-infarctioncardiacremodellingbyinducingengraftmentsignals.clinsci(lond).2016；130(23):2105-20.
6.cuiw,tavris,benchimolmj,itanim,olsones,zhangh,etal.neuralprogenitorcellslabelingwithmicrobubblecontrastagentforultrasoundimaginginvivo.biomaterials.2013；34(21):4926-35.
7.goodfellowf,simchickga,mortensenlj,sticesl,zhaoq.trackingandquantificationofmagneticallylabeledstemcellsusingmagneticresonanceimaging.advfunctmater.2016；26(22):3899-915
附图说明
图1为脂质plga纳米微泡－干细胞复合体结构示意图。
图2为不同时间点检测该超声造影剂在体外的超声造影成像图。
图3为该超声造影剂在小鼠皮下的超声造影成像图。
图4为该超声造影剂在种有皮下移植瘤的小鼠的瘤内造影成像图。
图5为该空白超声造影剂和在分别成脂、成骨分化诱导剂中培养后的显微镜图。
具体实施方式
实施例1脂质plga纳米微泡－干细胞复合体的制备：
(1)将plga和dspe-peg2000-生物素溶于二氯甲烷中。
(2)加入适量浓度为6％的nh4hco3水溶液于上述plga磷脂混合液中，使用超声破碎仪将此溶液乳化。
(3)将乳化液加入浓度为4％pva溶液中，均质完成后，室温下磁力搅拌2.5-3h，即得生物素化的脂质plga纳米微泡。
(4)将生物素化的脂质plga纳米微泡与cd90抗体通过生物素－链霉亲和素反应连接制备cd90靶向脂质plga纳米微泡。
(5)cd90靶向脂质plga纳米微泡与用全骨髓贴壁培养法从sd大鼠的股骨、胫骨骨髓腔提取出来的大鼠骨髓间充质干细胞通过抗原抗体反应介导干细胞的内吞作用，构建了脂质plga纳米微泡－干细胞复合体，即一种可用于干细胞超声示踪的超声造影剂，如图1所示。
实施例2造影效果维持时间：
将实施例1方法制备的脂质plga纳米微泡－干细胞复合体加入一定量至1％琼脂糖溶液制备的超声凝胶仿体内，分别于2小时、4小时、36小时用16mhz超声探头观察其在体外二维及造影模式下的成像效果。结果见图2。该实例是说明超声造影剂在体外可维持造影能力的时间长度，可以看出在36小时时依然可以稳定地提供较好的超声成像与造影效果，此项结果说明了该复合体有助于观察干细胞移植后在定点注射区域附近的分布情况。
实施例3超声造影剂指导干细胞在动物体内的定点注射：
将制备的脂质plga纳米微泡－干细胞复合体以1000rpm的转速离心4分钟，收集细胞后，用pbs缓冲液稀释将细胞至2×107个/ml。
将该复合体原位注射至种有c6移植瘤的小鼠的皮下(图3)或肿瘤内部(图4)，16mhz小动物超声探头置于观察部位表面，可观察到注射区域局部相比未注射区域超声增强显影效果明显。
根据非抗体组和抗体组的超声成像效果对比可见，加入抗体的靶向脂质plga微泡可与干细胞表面分子产生特异性结合，通过这种干细胞的特异性内吞作用可增强和稳定该造影剂的超声信号。
实施例4超声造影剂未影响干细胞的分化能力：
实验步骤如下：将制备的脂质plga纳米微泡－干细胞复合体均匀铺至6孔板内，待细胞达到70％-80％融合后，分别加入成脂、成骨分化诱导液，每3天换液一次，诱导21天后，对培养的细胞进行细胞分化水平的鉴定。
干细胞诱导为脂肪细胞的鉴定一般用油红o染色，油红为脂肪染色剂，易溶于脂质，染后脂质呈红色；干细胞诱导为骨细胞使用的是茜素红染色，茜素红染色是特异的钙盐染色方法，利用沉积的钙与茜素红发生显色反应后矿化结节呈现红色的效果。结果如图5所示。实验结果显示超声造影剂并未影响干细胞的分化能力。