用于促进肛瘘术后创面修复的中药组合物及其制备方法与流程

本发明涉及中药
技术领域：
，具体地说，是一种用于促进肛瘘术后创面修复的中药组合物及其制备方法。
背景技术：
：肛瘘(analfistula)是肛管或直肠与肛周围皮肤相通的肉芽肿性管道，由内口、瘘管、外口三个部分组成。内口常位于直肠下部或肛管，多为一个；外口在肛周围皮肤上，可为一个或者多个。经久不愈或间歇性反复发作是其特点，肛瘘为当前临床上最为常见的直肠肛管疾病之一，任何年龄均可发病，但多见于青壮年男性。研究报道显示，肛瘘的发病率占肛门直肠疾病的1.67％～3.6％。肛瘘通常采用手术治疗，术后因需敞开创口、充分引流，并通过创口换药清除管壁腐败组织，使创口愈合，同时又因创口开放，粪便和橡皮筋的刺激及肠内细菌所致的创口炎症、水肿等因素的影响，存在着创口愈合时间长，创面易感染、疼痛、渗液等缺点。另外，在创口愈合过程中，由于外口周围肉芽组织生长过快，易致创口假性粘合(桥形愈合)；引流不畅还可以引发新的支管。西药目前虽然有贝复济、依济复、金因肽等表皮生长因子，但对加速创口愈合尚缺乏行之有效的方法。经过长期的临床观察，认为肛瘘术后创面不仅表现为“红肿热痛、创面渗液”等“湿热”的症候外，还多表现为“创面周围皮肤颜色晦暗”的“血瘀”的症候，因此以“清热化瘀”为理论，对肛瘘术后伤口进行治疗，效果显著。中国专利文献cn106581532a公开了一种治疗痔、肛瘘术后伤口水肿的中药湿敷制剂及其制备方法，采用中药材苦参、当归、地肤子、五倍子、土茯苓及黄柏，配以辅料，制成治疗痔、肛瘘术后伤口水肿的中药湿敷制剂，该发明中药湿敷制剂有明确的缓解痔、肛瘘术后肛周水肿的治疗作用，能持续改善肛周伤口水肿的症状和体征，能较好治疗肛周疾病术后伤口水肿，使用方便，无毒副作用，病人评价好，但对于创面渗液、促进肉芽生长以及创口愈合方面的疗效未见描述。中国专利文献cn105477015a公开了一种用于肛瘘术后的外用中药洗剂及其制备方法，所述中药制剂由以下重量份的粉状原料制备而成：芒硝25～35份，硼砂15～25份，白矾5～15份，炙炉甘石25～35份，冰片5～15份。该发明制备的药剂溶解于水熏洗坐浴，具有消除或缓解肛瘘术后创面疼痛、水肿、渗液、愈合延迟等症状，具有清凉解毒、止痒消肿、收敛生肌之功效。但缺乏对于创面疼痛、水肿、渗液、愈合延迟每一项的效果的具体评价。技术实现要素：本发明的第一个目的是，针对现有技术中的不足，提供一种用于促进肛瘘术后创面修复的中药组合物。本发明的第二个目的是，提供一种上述中药组合物的制备方法。本发明的第三个目的是，提供一种上述中药组合物的用途。为实现上述第一个目的，本发明采取的技术方案是：一种用于促进肛瘘术后创面修复的中药组合物，所述的中药组合物由以下重量份的原料药制成：苦参27-33份、黄柏27-33份、芒硝27-33份、乳香17-23份、没药17-23份、当归27-33份。优选地，上述中药组合物由以下重量份的原料药制成：苦参29-31份、黄柏29-31份、芒硝29-31份、乳香19-21份、没药19-21份、当归29-31份。更优选地，上述中药组合物由以下重量份的原料药制成：苦参30份、黄柏30份、芒硝30份、乳香20份、没药20份、当归30份。优选地，所述的肛瘘术后创面修复包括缩短肛瘘术后创面疼痛、水肿、渗液时间，促进肉芽组织生长，提高创面愈合率，促进创面愈合。为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是：一种用于促进肛瘘术后创面修复的中药组合物的制备方法，包括以下步骤：称取苦参、黄柏、芒硝、乳香、没药、当归，洗净晾干，加入5-7倍的水，水开后文火煎煮至1.25-1.5倍药液，过滤，收集滤液；再向药渣中加水4-5倍，同上煎煮至1.25-1.5倍药液，过滤，收集滤液，将两次滤液合并，得熏洗药液。熏洗时将药液倒入熏洗仪中，38℃恒温熏洗15分钟，先熏后洗，每日两次。为实现上述第三个目的，本发明采取的技术方案是：上述中药组合物在制备促进肛瘘术后创面修复的药物中的应用。中医认为肛肠病术后创面表现为“红肿热痛”等“热”的症候外，还多表现为“创面周围皮肤潮湿，创面渗液，脓液粘稠较多，肉芽组织淡红”等“湿”的征象，另一方面术后病灶虽去，但肌肤、肌肉受损，致脉络断裂，经气被其所激，气血郁滞于络外，经脉气血不畅，因此其术后创面症状的病机主要责之于“湿热夹瘀”。因此肛肠病术后应以清热利湿为主，促进水肿消退、减少炎症渗出，辅以活血止痛，化瘀生肌。熏洗疗法是中医学外治法的一个重要方法,可借蒸腾的药气，熏灼患处，依靠药力和热力的作用，直接接触病变部位，使药力直达病所，荡涤污浊毒邪，使经气血脉通畅，气机调和，腠理疏通而诸症自愈。现代医学研究证明，中药熏洗坐浴对改善局部血液、淋巴循环，减轻组织水肿，改善上皮、肉芽的生长环境等方面有明显疗效。中药熏洗坐浴治疗肛肠疾病是药物与物理作用等多重作用融为一体而产生的效果：药物可通过蒸腾和温热作用，使皮肤附属器如汗腺、毛囊、皮脂腺等开放，促使炎性致病介质和代谢产物排除，增加药物穿透、吸收的通道，加速提高中药活性离子透皮功效，增加角质层的水合程度，皮肤的水合程度的提高，亦可提高药物的吸收率。由于药物经皮吸收和皮肤的厚度成反比，而肛门齿线是胚胎时期内胚层和外胚层连接处，屏障功能最弱，渗透力强，药物最易穿透皮肤，故肛门用药有利于药物的透入和吸收，直达病所，进而发挥其治疗作用。现代医学认为直肠周围血管密集、血运丰富、粘膜下组织疏松，熏洗坐浴可通过药物的溶化、弥散和浓度差，造成分子扩散运动，使药物移向肠壁而被直肠粘膜缓慢吸收，经血管吸收，通过淋巴体液、血液循环全身，从而达到治疗目的。方中苦参能清热燥湿杀虫，治热毒血痢，苦参碱还有直接抑制炎症的作用，现代药理学研究显示苦参在抗炎、抗过敏、保护肝脏和利尿作用都为苦参清热燥湿的表现，明代李时珍在《本草纲目》曰：“苦以味名，参以功名。”黄柏有清热、燥湿、泻火、解毒功效，药理研究还证明黄柏对某些横纹肌有一定的松弛作用，能降低肛管压力，改善肛管局部循环，促进伤口愈合，临床研究证实它对会阴部感染伤口有愈合促进作用。乳香有调气活血，定痛，追毒功效，现代药理研究乳香有抗炎、抗肿瘤功效。没药是有活血止痛、消肿生肌等功效，现代药理研究表明没药具有抗炎、镇痛多种药理活性。芒硝清热解毒、消肿止痛。当归活血化瘀、消肿止痛，现代药理研究显示当归具有抗菌、消炎作用，当归对体外大肠杆菌、霍乱弧菌均有抗菌作用，当归水提取物能降低血管通透性，外用能加速兔耳创面愈合，使局部组织充血、白细胞和纤维浸润，新生上皮再生，对局部组织有止血和加强末梢循环的作用。以上诸药配伍，可谓相辅相成，相得益彰，共奏清热燥湿、活血止痛、消肿生肌之功。因此中药超声雾化熏洗不仅可抑菌，抑制急性炎症反应及渗出；还能增加局部微循环，降低肛管静止压力，改善伤口氧含量，以提高局部抗感染和修复能力，从而改善症状并促进伤口愈合。本发明优点在于：1、本发明的中药组合物诸药配伍有序，相辅相成，相得益彰，共奏清热燥湿、活血止痛、消肿生肌之功。2、临床数据显示，本发明的中药组合物能明显缩短肛瘘术后创面疼痛、水肿、渗液时间，促进肉芽组织生长，提高创面愈合率，促进创面愈合。3、动物实验表明，本发明的中药组合物能有效改善肛瘘术后大鼠伤口局部炎症反应，减少渗出和局部水肿，降低血管通透性，促进胶原纤维的合成和创面血管化，加速新生肉芽和上皮组织的生长，从而促进伤口愈合。4、本发明中药药味数少，易于取材，成本低，疗效高，为纯中药制剂，无毒副作用，易于被患者接受。附图说明图1是术后14天疼痛积分图。图2是术后14天创面渗液积分图。图3是术后14天水肿积分图。图4是术后肉芽形态积分图。图5是创面模型组伤口组织形态学改变。图6是生理盐水组伤口组织形态学改变。图7是高锰酸钾组伤口组织形态学改变。图8是中药组伤口组织形态学改变。图9是各组大鼠胶原纤维合成及分布情况，其中，a为创面模型组，b为生理盐水组，c为高锰酸钾组，d为中药组。具体实施方式下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围；此外应理解，在阅读了本发明记载的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。实施例1称取苦参30g、黄柏30g、芒硝30g、乳香20g、没药20g、当归30g，洗净晾干，加入800-1000ml的水，水开后文火煎煮至200-250ml，过滤，收集滤液；再向药渣中加水750ml，同上煎煮至200-250ml，过滤，收集滤液，将两次滤液合并，得熏洗药液。实施例2称取苦参33g、黄柏33g、芒硝33g、乳香17g、没药17g、当归27g，洗净晾干，加入800-1000ml的水，水开后文火煎煮至200-250ml，过滤，收集滤液；再向药渣中加水750ml，同上煎煮至200-250ml，过滤，收集滤液，将两次滤液合并，得熏洗药液。实施例3称取苦参27g、黄柏27g、芒硝27g、乳香23g、没药23g、当归33g，洗净晾干，加入800-1000ml的水，水开后文火煎煮至200-250ml，过滤，收集滤液；再向药渣中加水750ml，同上煎煮至200-250ml，过滤，收集滤液，将两次滤液合并，得熏洗药液。实施例4称取苦参31g、黄柏31g、芒硝31g、乳香19g、没药19g、当归29g，洗净晾干，加入800-1000ml的水，水开后文火煎煮至200-250ml，过滤，收集滤液；再向药渣中加水750ml，同上煎煮至200-250ml，过滤，收集滤液，将两次滤液合并，得熏洗药液。实施例5称取苦参29g、黄柏29g、芒硝29g、乳香21g、没药21g、当归31g，洗净晾干，加入800-1000ml的水，水开后文火煎煮至200-250ml，过滤，收集滤液；再向药渣中加水750ml，同上煎煮至200-250ml，过滤，收集滤液，将两次滤液合并，得熏洗药液。实施例6临床试验1资料与方法1.1研究对象来源选择2015年01月至2017年12月期间，在上海市普陀区中心医院肛肠科肛瘘术后的病人120例，并将病人随机分为观察组(中药组)60例，对照组(高锰酸钾组)60例。1.2纳入标准(1)年龄18-65岁；(2)符合2006年中华中医药学会肛肠分会等三个学会共同制定的《肛瘘临床诊治指南》的低位单纯肛瘘的诊断标准；(3)己完成完整的病史询问和体格检查，心脏、肝肾功能、凝血功能正常，排除手术禁忌症；(4)接受肛瘘手术，且半年内未接受过其他手术治疗的患者；(5)对研究人员观察和治疗有良好的依从性，自愿参加，签订知情同意书。1.3排除标准(1)年龄在18岁以下或65岁以上；(2)妊娠或哺乳期妇女；(3)有心、脑血管疾病、糖尿病等代谢疾病、造血系统疾病、肝、肾功能严重异常、患精神病患者；(4)肛瘘合并证实有直肠或肛管器质性病变(如:直肠息肉、肛管结核性溃疡、直肠恶性肿瘤或炎症性肠道疾病等)；(5)半年内接受过其他手术治疗的肛瘘的患者；(6)过敏体质及瘢痕体质；(7)不愿意加入本临床观察。1.4剔除与脱落标准(1)凡不符合纳入标准而被误入的病例应予剔除；(2)未按规定治疗或资料不全等影响疗效评价和安全性评价者应予剔除；(3)受试者依从性差，疗程中自行退出者；(4)合并使用本方案禁止使用的治疗方法或自行中途更换治疗方法者；(5)发生严重不良事件或并发症，不宜继续接受治疗而被中止试验的病例。1.5剔除与脱落病例的处理(1)当受试者脱落后，主管医生应采取登门、预约电话、信件等方式，尽可能与受试者联系询问理由，记录最后一次治疗时间，完成所能完成的评估项目；(2)因不良反应、治疗无效而退出试验的病例，主管医生应根据受试者实际情况采取相应的治疗措施；(3)一旦取得随机号码，即成为试验观察的对象，不管以后诊断如何及治疗是否完整；(4)及时填写病例报告表；(5)所有剔除与脱落病例于试验结束后进行意向性分析。1.6研究病例中止(1)研究中出现严重不良反应，不宜继续参加研究者；(2)研究期间受试者出现其它急重症，需采取紧急措施者；(3)受试者中途提出退出。1.7方法采用完全随机、双盲、对照临床实验研究。本试验随机设计采用spss17.o统计软件包，进行随机编码，将全部病例随机分为实验组和对照组。严格按照诊断标准、纳入标准和排除标准筛选病例，确定入组后，按照申请随机编码流程获得随机号码，直到完成总观察例数后结束试验。2治疗方案2.1治疗方法患者住院前行常规术前检查，术后常规换药。2.2分组情况(1)实验组：所有熏洗治疗药物由上海市普陀区中心医院药剂科统一制备，取实施例1中制得的熏洗药液，熏洗时将药液倒入熏洗仪中，38℃恒温熏洗15分钟，先熏后洗，每日两次。(2)对照组：将高锰酸钾0.4g放入2000ml38℃温开水中，配成1:5000浓度，熏洗时将药液倒入熏洗仪中，38℃恒温药液熏洗15分钟，高锰酸钾由济南康福生制有限公司提供，国药准字h37022233。2.3合并用药规定(1)除研究用药外，临床研究期间停用其他治疗肛瘘术后的疼痛、出血、水肿的药物，以及与本病相关的西药；(2)研究过程中遇有合并疾病必须要服用的药物或其他治疗，必须在病例报告表中药名、药量、服用方法、使用原因使用次数和时间，以便总结和分析；(3)研究开始前已有合并疾病和症状(除本病以外的症状)应详细记录，研究开始出现的任何合并疾病，均应视为不良反应事件，记录在“不良反应事件”表中；3疗效评价指标及标准3.1疗效评价指标详细询问病史，观察主要症状的变化，连续观测患者用药后疼痛、水肿、渗液情况。以上症状积分均采用：无0分，轻度2分，中度4分，重度6分；肉芽形态采用：无肉芽0分，肉芽鲜红活润颗粒状、擦之易出血2分，肉芽苍白、擦之不易出血4分，肉芽晦暗肿胀、擦之不易出血6分。分别于用药14天内对患者进行随访评分，并与药前比较以评价疗效。记录创面情况：于术后第一次换药时(术后第一天)及术后第3、7、14天观察，创面旁放一游标标尺，记录愈合天数，计算创面面积、创面愈合率。其中，愈合天数＝从手术至病人创面完全愈合时的天数；创面面积＝最大长径×最大宽径；创面愈合率(％)＝(初始面积-观察时面积)/初始面积×100％。3.2疗效评价标准疗效评定标准：参照1994年国家中医药管理局制定的《中华人民共和国中医药行业标准·中医肛肠科病证诊断疗效标准》，结合临床制订疗效评定标准。痊愈：创面完全愈合，创面上皮完全覆盖，疤痕坚实；显效：创面缩小75％以上，创面肉芽组织新鲜，颜色鲜红；好转：创面缩小75％-25％，创面肉芽组织较新鲜，色红；无效：创面缩小不足25％，创面肉芽组织色暗，生长很少，无明显缩小趋势。4统计学分析本试验数据管理按照临床研究数据管理标准操作规程的要求进行，采用excel软件编制数据录入程序，进行数据录入与管理。每份数据均进行双份录入并校对，对报告不一致的结果值，逐项核对原始crf表，予以更正，从而保证数据的准确性。统计分析将采用spss17.o，计数资料用chi-squaretest，计量资料用independentsamplestest或方差分析，愈合率的比较用snk-q对临床资料分别进行检验，以p<0.05为差异有显著性。5.结果5.1可比性分析本试验入组病例数共120例，其中治疗组(中药组)及对照组(高锰酸钾组)各60例。两组病例间性别经卡方检验，年龄经方差分析，p值均>0.05，差异无统计学意义，具有可比性。具体结果见表1。表1两组一般情况比较5.2术后疼痛情况二组疼痛积分比较采用方差分析。用药前疼痛积分经统计学检验，二组无统计学差异(p＞0.05)，术后第3d的疼痛积分经统计学检验，二组有统计学差异(p＜0.05)，术后第7d的疼痛积分经统计学检验，二组有统计学差异(p＜0.05)，术后第14d的疼痛积分经统计学检验，二组无统计学差异(p＞0.05)。说明中药组在减轻术后疼痛方面优于高锰酸钾组(见表2，图1)。表2术后14天疼痛积分表时间治疗组对照组统计检验p值用药前3.72±0.7013.96±0.2833.840p＞0.05术后3d2.52±0.8863.92±0.396104.029p＜0.05术后7d2.07±0.8863.00±0.54693.992p＜0.05术后14d1.12±0.4801.48±0.54591.086p＞0.055.3术后创面渗液情况二组创面渗液积分比较采用方差分析。用药前渗液积分经统计学检验，二组无统计学差异(p＞0.05)，术后第3d的创面渗液积分经统计学检验，二组有统计学差异(p＜0.05)，术后第7d的创面渗液积分经统计学检验，二组统计学有差异(p＜0.05)，术后第14d的创面渗液积分经统计学检验，二组有统计学差异(p＜0.05)。说明中药组在减轻术后创面渗液情况方面优于高锰酸钾组(见表3，图2)。表3术后14天创面渗液积分表时间治疗组对照组统计检验p值用药前3.42±0.4803.92±0.3960.327p＞0.05术后3d0.84±1.0763.60±0.990178.219p＜0.05术后7d0.08±0.3961.64±0.776160.277p＜0.05术后14d0.000±0.0000.40±0.80812.250p＜0.055.4术后创面水肿情况二组创面水肿积分比较采用方差分析。用药前创面水肿积分经统计学检验，二组无统计学差异(p＞0.05)，术后第3d的水肿积分经统计学检验，二组有差异(p＜0.05)，术后第7d的水肿积分经统计学检验，二组有差异(p＜0.05)，术后第14d的水肿积分经统计学检验，二组有差异(p＜0.05)。说明中药组在减轻术后创面水肿方面优于高锰酸钾组(见表4，图3)。表4术后14天水肿积分表时间治疗组对照组统计检验p值用药前4.12±0.6273.64±0.6571.297p＞0.05术后3d2.16±1.2673.72±0.9046.986p＜0.05术后7d0.24±0.6571.08±1.15819.916p＜0.05术后14d0.000±0.0000.44±0.83713.821p＜0.055.5术后肉芽形态二组术后肉芽形态比较采用方差分析。用药前肉芽形态积分经统计学检验，二组无差异(p＞0.05)，术后第3d的肉芽形态积分经统计学检验，二组有统计学差异(p＜0.05)，术后第7d的肉芽形态积分经统计学检验，二组有统计学差异(p＜0.05)，术后第14d的肉芽形态积分经统计学检验，二组有统计学差异(p＜0.05)。说明中药组在促进肉芽组织生长方面优于高锰酸钾组(见表5，图4)。表5术后肉芽形态积分表时间治疗组对照组统计检验p值用药前0.02±0.1830.04±0.1573.941p＞0.05术后3d0.96±1.0090.12±0.48028.247p＜0.05术后7d2.20±0.8330.80±1.14349.000p＜0.05术后14d3.92±0.3962.04±0.75543.238p＜0.055.6创面愈合天数及愈合率二组创面愈合天数积分比较采用方差分析，经统计学检验，二组有显著差异(p＜0.01)，说明中药组在促进创面愈合方面优于高锰酸钾组。(见表6)表6二组创面愈合天数及愈合率比较时间治疗组对照组统计检验p值愈合天数17.30±3.26521.06±4.73829.780p＜0.01愈合率93.46±2.13081.87±3.62014.640p＜0.055.7两组有效率比较经ridit检验分析，p＜0.05，两组术后14天疗效评定有差异，治疗组疗效优于对照组。(见表7)表7两组疗效比较综上，本研究显示本发明的中药组合物熏洗能明显缩短肛瘘术后创面疼痛、水肿、渗液时间，促进肉芽组织生长，提高创面愈合率，促进创面愈合。而高锰酸钾溶液坐浴只有单纯的清洁创口的作用，浓度难于掌握，且浓度过高时对皮肤粘膜有刺激作用，使创面老化，延误创面愈合，用具及皮肤容易着色，不易清洗。实施例7促进肛瘘术后创面修复的机理研究1研究内容以sd大鼠肛旁切口术复制人类肛瘘术后创伤模型，通过光镜、透视电镜等技术手段，诠释中药组熏洗改善肛瘘术后创面愈合显著疗效的作用，并以创伤组织局部微血管通透性为靶点，研究中药组方对术后创伤组织炎性并发症的防治作用，通过观察其调节微血管渗透信号通路src/ve—cadherin活性的变化，初步揭示其作用机制。2研究方案(1)以sd大鼠肛旁创面模型为研究对象，观察创面第一到七天时，中药组、生理盐水组、创面模型组、高锰酸钾组各组之间创面愈合率等情况，通过光镜、观察创面上皮爬行、肉芽组织增生、成纤维细胞、炎症细胞浸润、毛细血管通透性、组织水肿等愈合及炎症情况；(2)用realtime-pcr、免疫荧光法等方法，从mrna转录水平、蛋白表达及分布三方面检测src/ve—cadherin信号通路相关因子(src、ve—cadherin)表达、分布和活性情况。3实验方案3.1实验动物及分组采用清洁级sd大鼠40只，雄性，体重250±20g，由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供。将造模大鼠随机分为：创面模型组、生理盐水组、高锰酸钾组、中药组、每组10只。治疗分别用生理盐水、1:5000高锰酸钾液、实施例1中药外洗，创面模型组只造模不外洗。3.2药物准备中药组熏洗治疗药物由上海市普陀区中心医院药剂科统一制备，采用实施例1中制得的熏洗药液。高锰酸钾、生理盐水由上海国药集团化学试剂有限公司提供。3.3造模参照岑氏法于术前3天用8％na2s脱毛,造模时用氯胺酮(15mg/100g)麻醉后,于肛门旁作直径为2cm大小圆形皮肤切口，全层切除皮肤及筋膜直至肌肉表层。止血后放入钢丝笼内分笼饲养,不予包扎任其自然感染，形成肛旁伤口模型。3.4治疗及取材术后24小时起，各组分别用药物或生理盐水熏洗治疗，每天两次，每次20分钟。其中中药组将熏洗液倒入水浴箱内，自制分隔铁丝笼，笼高25cm以上，以sd大鼠不致跳出为度，药液以没大鼠伤口上3cm为度,铁丝笼置38度恒温水浴箱，待药液达38℃时用开始外洗，其他各组同上。于术后7天各组大鼠进行取材。3.5观察及检测(1)肉眼观测术后第1、3、7天各组创面色泽、渗出、愈合率、上皮爬行等情况；其中术后伤口面积大小采用leica显微镜自带分析软件进行分析计算。(2)光镜观察伤口炎症及愈合情况及胶原合成及分布情况。术后第7天，将动物麻醉(氯胺酮15mg/100g)处死，用眼科手术剪分离新生创面肉芽组织，并成块取下，以10％中性福尔马林固定标本，常规石蜡切片，he染色，光镜(型号dm2000，德国leica公司)下观察伤口组织水肿、炎症细胞浸润、肉芽组织增生、愈合等情况。(3)光镜观察各组胶原合成及分布情况；将石蜡切片常规脱蜡至水，水洗后苏木素染核，再次水洗，用masson染色液染色、蒸馏水冲洗，接着磷钼酸水溶液、直接放入淡绿染液，最后水洗2-3次，10.1％冰醋酸溶液1min，水洗2-3次后用无水乙醇脱水、二甲苯透明，最后中性树胶封片；采用双盲法观察高倍视野下组织切片胶原纤维的厚度和结构以及在组织中的分布情况。(4)采用realtime-pcr法检测各组创面肉芽组织中src/ve-cadherin信号通路相关因子src、ve-cadherin的mrna表达差异。先组织匀浆，采用trizol提取组织总rna，用琼脂糖电泳和紫外分光光度计检测质量和纯度。分别取各组的总rna，进行rt反应合成cdna。src、ve-cadherin和actb引物设计参照genebank提供的引物序列，应用引物设计软件设计引物，由上海生工生物有限公司合成。(5)用免疫荧光法分析各组大鼠创面肉芽组织中src、ve-cadherin的表达及分布规律。免疫荧光染色检测方法：4μm连续石蜡切片，二甲苯脱蜡，乙醇梯度水化，3％h2o2室温下孵育20min，以消除内源性过氧化物酶活性，pbs溶液冲洗3次，每次10min，使1％tritonx-100的pbs溶液破膜30min，pbs洗净后，接着动物血清封闭非特异性抗原1h；封闭结束后每张切片分别滴加一抗(兔抗大鼠src一抗1:100稀释；山羊抗大鼠ve-cadherin一抗1:200)，4℃过夜，次日37℃继续孵育1h后，pbs洗2次，每次10min，后滴加二抗(src：fitc标记的山羊抗兔二抗1:100；ve-cadherin：tr标记的兔抗山羊二抗1:80)，37℃孵育1h，pbs洗2次，dapl显色，指甲油封片镜检。镜检采用德国leica公司荧光显微镜，每张切片随机选取5个视野，拍照后通过leica软件分析系统分别计算各视野中相应蛋白的表达量，取其平均值作为该切片相应蛋白的表达量，所得数据经统计分析软件spss18.0计算平均值后进行各组间比较统计分析。4结果4.1术后第3、7天各组大鼠创面愈合率比较分别于造模当天、造模后第3天、造模后第7天对伤口进行拍照，伤口旁放一标尺，用数码照相机(固定镜头、光圈及物距)记录伤口情况，将照片用leica软件系统分析计算伤口面积大小，所得数据采用spss18.0统计分析软件进行计算。结果显示造模当天各组大鼠间伤口面积大小没有统计学差异(p＞0.05)，具有可比性。造模后第3天创面模型组、生理盐水组、高锰酸钾组、中药组的创面愈合率相比无统计学差异(p＞0.05)；造模后第7天，与创面模型组比较，高锰酸钾组、中药组创面愈合率均明显提高，差异具有统计学意义(p＜0.05)；与生理盐水组相比较，高锰酸钾组、中药组明显提高创面愈合率，差异具有统计学意义(p＜0.05)；与高锰酸钾组相比，中药组明显提高术创面愈合率，差异具有统计学意义(p＜0.05)；而创面模型组和生理盐水组术后第7天创面愈合率比较无统计学差异(p＞0.05)。详见表8。表8造模后第3、7天各组愈合率比较组别例数术后第3天术后第7天创面模型组1016.57±1.3732.71±3.15生理盐水组1016.75±2.4333.09±2.13高锰酸钾组1016.33±1.3941.00±2.00*#中药组1017.62±1.1358.72±6.27*#δ*p＜0.05，与创面模型组比较；#p＜0.05，与生理盐水组比较；δp＜0.05，与高锰酸钾组比较。4.2he染色光镜组织学观察创面模型组可见新生肉芽组织增生，肉芽组织中度水肿，并可见较多内皮细胞、中性粒细胞和成纤维细胞，增生的成纤维细胞间可见少量的新生毛细血管血管(见图5)；生理盐水组可见肉芽组织增生，新生肉芽组织呈现中度水肿，并可见到较多内皮细胞及成纤维细胞，但排列不整齐，形体较小；增生的成纤维细胞间可见少量的新生血管，且管腔较小(见图6)；高锰酸钾组可见新生肉芽组织增生，新生肉芽组织轻度水肿，并可见较多中性粒细胞及成纤维细胞数量多于创面模型组和生理盐水组，且增生的成纤维细胞间可见少量新生毛细血管，管腔同样较小(见图7)；中药组成纤维细胞数量多，排列比较整齐，形体肥大，核浓，核仁多，说明分泌旺盛，表面皮肤呈现爬行性修复，皮下可见到大量新生内皮细胞、纤维母细胞和丰富的新生毛细血管，且管腔较大，表明血供丰富，血液循环良好，无明显炎性坏死和水肿(见图8)。4.3光镜下masson'strichrome三色染色法观察各组大鼠伤口组织胶原合成情况光镜下胶原染色各组大鼠胶原合成及分布情况：masson'strichrome三色染色法染色结果显示：创面模型组伤口皮肤真皮层明显变薄，并且真皮层内胶原较为稀疏，排列杂乱不规则，胶原纤维束排列疏松间隙较大，可见到少量新生毛细血管，但管腔较为狭窄，血供不丰富；生理盐水组胶原纤维排列杂乱无章、分散、排列紊乱，胶原纤维束排列疏松，未见明显毛细血管增生；高锰酸钾组大鼠伤口组织内胶原合成与比生理盐水组和创面模型组厚实且相对有序、规则，但不如中药组，胶原层之间仍可见到较大空隙，可见少量新生毛细血管，但管腔较狭窄，表明血供不丰富；中药组大鼠的真皮内胶原层厚、胶原排列致密且有序，紧密填充于组织间隙，成纤维细胞排列整齐、紧密，新生毛细血管丰富，且管腔较大，表明血供丰富，血液循环良好(见图9)。4.4造模后第7天各组大鼠伤口组织中src、ve-cadherin的mrna相对表达量rt-pcr结果显示，在术后第7天各组大鼠伤口组织中src的mrna的表达差异无统计学意义(p＞0.05)；而各组大鼠伤口组织中ve-cadherin的mrna表达则呈现较明显差异(见表9)：与创面模型组相比较，高锰酸钾组、中药组的ve-cadherin的mrna表达明显提高，差异具有统计学意义(p＜0.05)；与生理盐水组相比较，高锰酸钾组、中药组的ve-cadherin的mrna表达明显提高，差异具有统计学意义(p＜0.05)；与高锰酸钾组相比较，中药组的ve-cadherin的mrna表达明显提高，差异具有统计学意义(p＜0.05)；而创面模型组与生理盐水组ve-cadherin的mrna表达无明显差异(p＞0.05)。表9各组大鼠src、ve-cadherinmrna表达的灰度值比较组别nsrcve-cadherin创面模型组100.65±0.050.55±0.02生理盐水组100.67±0.060.51±0.05高锰酸钾组100.69±0.130.75±0.05*#中药组100.58±0.171.49±0.07*#δ*p＜0.05，与创面模型组比较；#p＜0.05，与生理盐水组比较；δp＜0.05；与高锰酸钾组比较。4.5免疫荧光法检测造模后第7天各组大鼠伤口组织中src、ve-cadherin的表达及分布情况免疫荧光染色显示，造模后第7天各组大鼠伤口新生肉芽组织中均有src阳性表达，分布部位主要是集中在肉芽组织中增生的内皮细胞、成纤维细胞等组织间隙中，也有少量分布于细胞核周围及细胞膜上，散发出点状的绿色荧光，少量密集区域融合成片。经leica图像定量分析软件分析计算，造模后第7天，创面模型组和生理盐水组伤口新生肉芽组织中src的表达量接近，两组间比较差异没有统计学意义(p＞0.05)，但此两组的src表达量均明显高于其余2组，差异具有统计学意义(p＜0.05)；高锰酸钾组的src表达低于生理盐水组和创面模型组，而高于中药组，差异具有统计学意义(p＜0.05)；中药组的src表达最低，明显低于创面模型组、生理盐水组和高锰酸钾组，差异具有统计学意义(p＜0.05)(见表10)。造模后第7天各组大鼠伤口组织细胞也均有ve-cadherin阳性表达，分布部位主要是集中在内皮细胞、成纤维细胞等组织间隙中及血管内皮细胞细胞膜之间，散发出点状的红色荧光。经leica图像定量分析结果显示，生理盐水组和创面模型组伤口组织中ve-cadherin的表达量接近，两组间比较差异没有统计学意义(p＞0.05)，但其表达明显低于其余2组，差异具有统计学意义(p＜0.05)；高锰酸钾组的ve-cadherin表达高于生理盐水组和创面模型组，低于中药组，差异具有统计学意义(p＜0.05)；中药组的ve-cadherin表达最高，明显高于创面模型组、生理盐水组和高锰酸钾组，差异具有统计学意义(p＜0.05)(见表10)。表10造模后第7天各组大鼠伤口组织中src、ve-cadherin的表达量组别nsrcve-cadherin创面模型组102513.46±795.08δ222.61±30.08δ生理盐水组102543.92±335.86δ237.51±10.06δ高锰酸钾组101567.15±142.06*#649.89±58.26*#清热化瘀组10685.99±106.19*#δ1298.98±227.71*#δ注：*p＜0.05，与创面模型组比较；#p＜0.05，与生理盐水组比较；δp＜0.05；与高锰酸钾组比较。5讨论伤口愈合是一个极其复杂的过程，受到诸如炎症反应、多种细胞生长因子、局部血管化程度等多种因素的影响，所以关于伤口愈合的研究要全面、综合的考虑，以免片面的认识造成实验结论的错误。因此本着这样的宗旨，我们动物实验的设计思路是以术后炎症反应、渗出、血管通透性作为切入点，采用肉眼观察、创面愈合率比较、he染色法、rt-pcr和免疫荧光等多种检测方法来进行检测分析，从宏观到微观，从基因到蛋白多角度，综合全面的评价中药方对伤口愈合过程的影响。综合多种检测方法的结果，我们得出结论认为本发明的中药组合物能有效改善肛瘘术后大鼠伤口局部炎症反应，减少渗出和局部水肿，降低血管通透性，促进胶原纤维的合成和创面血管化，加速新生肉芽和上皮组织的生长，从而促进伤口愈合；组方中黄柏具有改善微循环和疏通微血管的作用，能防止血栓形成；苦参具有较强抑菌抗炎的作用，能抑制包括金葡菌、溶血性链球菌、大肠杆菌、绿脓杆菌等多种肛旁伤口常见细菌；因此本方不但能有效杀菌抗炎，降低炎症反应，减少炎性物质对组织的损伤，还能改善局部循环，减轻组织水肿；能从多方面为伤口愈合创造有利条件。高锰酸钾与生理盐水相比有一定的抗炎、抗渗作用，但对于胶原纤维合成、肉芽组织生长、创面血管化、上皮组织爬行均无明显促进作用；可能是由于高锰酸钾有较强的抑菌作用，消除细菌污染保持了伤口的相对清洁，从而降低了局部伤口的炎症反应，但是其仅仅只是单纯的抑菌剂，既不能有效促进创面血液循环丰富血供，也不能有效的促进创面肉芽组织生长、胶原纤维合成等，因此它能在一定程度上利于伤口愈合，提高创面愈合率，但是作用有限。生理盐水作为一种等渗溶液能起到一定的清洁伤口的作用，但是由于清洁能力有限，不能起到杀菌、抑菌、抗炎的作用，同时又不能影响到细胞生长因子、血管化、局部微循环等与伤口愈合有关的多方面因素，因此生理盐水不能有效促进伤口愈合。实施例8药物对比实验1实验方案1.1实验动物及分组采用清洁级sd大鼠50只，雄性，体重250±20g，由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供。将造模大鼠随机分为：创面模型组、高锰酸钾组、对比例1组、对比例2组、中药组，每组10只。治疗分别用生理盐水、1:5000高锰酸钾液、对比例1、对比例2、实施例1中药外洗，创面模型组只造模不外洗。1.2药物准备中药组熏洗治疗药物由上海市普陀区中心医院药剂科统一制备，采用实施例1中制得的熏洗药液。对比例1组：组方为黄柏30g、芒硝30g、乳香20g、没药20g，制作方法同实施例1。对比例2组：组方为苦参30g、黄柏30g、芒硝30g、当归30g，制作方法同实施例1。高锰酸钾、生理盐水由上海国药集团化学试剂有限公司提供。1.3造模参照岑氏法于术前3天用8％na2s脱毛,造模时用氯胺酮(15mg/100g)麻醉后,于肛门旁作直径为2cm大小圆形皮肤切口，全层切除皮肤及筋膜直至肌肉表层。止血后放入钢丝笼内分笼饲养,不予包扎任其自然感染，形成肛旁伤口模型。1.4治疗及取材术后24小时起，各组分别用药物或生理盐水熏洗治疗，每天两次，每次20分钟。其中中药组将熏洗液倒入水浴箱内，自制分隔铁丝笼，笼高25cm以上，以sd大鼠不致跳出为度，药液以没大鼠伤口上3cm为度,铁丝笼置38度恒温水浴箱，待药液达38℃时用开始外洗；其他各组同上。2实验结果分别于造模当天、造模后第3天、造模后第7天对伤口进行拍照，伤口旁放一标尺，用数码照相机(固定镜头、光圈及物距)记录伤口情况，将照片用leica软件系统分析计算伤口面积大小，所得数据采用spss18.0统计分析软件进行计算。结果显示造模当天各组大鼠间伤口面积大小没有统计学差异(p＞0.05)，具有可比性。造模后第3天创面模型组、高锰酸钾组、对比例1组、对比例2组、中药组的创面愈合率相比无统计学差异(p＞0.05)；造模后第7天，与创面模型组比较，高锰酸钾组、对比例1组、对比例2组、中药组创面愈合率均明显提高，差异具有统计学意义(p＜0.05)；与高锰酸钾组相比，对比例1组、对比例2组的创面愈合率相比无统计学差异(p＞0.05)，中药组明显提高术创面愈合率，差异具有统计学意义(p＜0.05)。详见表11。表11造模后第3、7天各组愈合率比较组别例数术后第3天术后第7天创面模型组1016.57±1.3732.71±3.15高锰酸钾组1016.33±1.3941.00±2.00*对比例1组1016.78±1.1538.84±4.26*对比例2组1016.54±1.4242.46±3.45*中药组1017.62±1.1358.72±6.27*δ*p＜0.05，与创面模型组比较；δp＜0.05；与高锰酸钾组比较。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本
技术领域：
的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。当前第1页12