一种多肽水凝胶及其制备方法和应用与流程

本发明属于材料学领域，涉及一种水凝胶，具体来说是一种多肽水凝胶及其制备方法和应用。

背景技术：

研究表明，多肽因为其特殊的化学结构，决定了其具有优良的生物相容性和生物可降解性、生物活性。选择具有特定性能的氨基酸类型，例如疏水性以及芳香性，可得到具有特定性能的自组装多肽水凝胶。

因为自组装多肽水凝胶是多肽分子之间通过氢键、静电、π-π堆积相互作用等非共价键自发形成的稳定的聚集体，所以多肽水凝胶对外界微小的刺激能做出快速反应，如温度、ph值，离子强度、电场、磁场等。水凝胶是以水为分散介质的凝胶材料，由于其特殊的孔结构以及三维网状结构特性。水凝胶在吸水溶胀后，能够继续保持其原有的结构而不解聚，使其可以运用到生物支架，生物载药等领域。

技术实现要素：

针对现有技术中的上述技术问题，本发明提供了一种多肽水凝胶制备方法和应用，所述的这种多肽水凝胶制备方法和应用要解决现有技术中对阿霉素的释放控制效果不佳的技术问题。

本发明提供了一种多肽水凝胶的合成步骤，其结构式如下所示：

其中，n＝0-4,r1-r5可为h、f、cl、br或者i；r6可为fmoc、nap、pyene、boc、2-chloro-z或者acetyl基团，h或者自由的氨基；r7可为自由的羧基、酰胺基或者甲胺基。

本发明还提供了上述的一种多肽水凝胶的制备方法，包括如下步骤：

1)一个合成具有不同侧链长度以及不同取代基的非天然氨基酸的步骤；所述的非天然氨基酸的结构式为，其中，n＝0-4，r1-r5为h、f、cl、br或者i；

所述的非天然氨基酸的合成包括如下步骤：

a.将乙酰氨基丙二酸二乙酯溶解于乙醇，加入乙醇钠，所述的乙酰氨基丙二酸二乙酯、乙醇和乙醇钠的物料比为9mmol：10～30ml：:8～15mmol，常温搅拌2～4小时，随后滴加不同链长，不同取代基的烷烃溴取代物，所述的烷烃溴取代物的结构式如下所示，

n＝0-4，r1-r5为h、f、cl、br或者i；在70～90摄氏度反应，tlc检测反应是否完全，反应完全后，反应体系用乙酸乙酯进行萃取，随后水洗，过柱，纯化，得到棕褐色固体，其中，n＝0-4，r1-r5为h、f、cl、br或者i；

b.取上述棕褐色固体溶于1～3m氢氧化钠的乙醇溶液，90～100摄氏度反应2～4小时，随后冷却至25～35摄氏度，用8～15m盐酸溶液调节ph至5.0，过滤，滤液冷却至5-10摄氏度，用8～15m盐酸溶液调ph至1.0，悬浊液在5摄氏度搅拌反应1小时，过滤保留沉淀物，干燥得到白色固体；

c.取上述白色固体溶于二甲基亚砜，加入氯化钾，随后溶解于水中，白色固体、二甲基亚砜和氯化钾的物料比为9mmol：15～30ml：1mol，用8～15m浓盐酸调ph至8.0，反应体系加入d-氨基酰胺酶，所述的白色固体和d-氨基酰胺酶的物料比为1mmol:36mg，35～45摄氏度搅拌反应10～16个小时，过滤，沉淀物用正己烷洗，45～55摄氏度干燥得到固体；

d.取上述固体溶于水中，加入碳酸氢钠与乙二胺四乙酸二钠，所述的固体、碳酸氢钠与乙二胺四乙酸二钠的摩尔比为1：0.2：0.05，搅拌，用碳酸钠调节ph至7-8，反应体系用冰浴冷却至0摄氏度，将9-芴甲基-n-琥珀酰亚胺基碳酸酯溶解于乙腈当中，所述的9-芴甲基-n-琥珀酰亚胺基碳酸酯和乙腈的物料比为0.035mol：40～70ml，随后将9-芴甲基-n-琥珀酰亚胺基碳酸酯的乙腈溶液滴加至反应体系当中，9-芴甲基-n-琥珀酰亚胺基碳酸酯和上述固体的摩尔比为1:1，室温反应10～14小时，反应结束后，用乙酸乙酯萃取，硫酸钠干燥，随后过柱纯化，得到白色固体，取得到的白色固体样品进行结构表征，

2)采用固相合成多肽的方法，将步骤1)的非天然氨基酸与树脂连接，然后再连接下一个非天然氨基酸，在所述的非天然氨基酸的末端r6用fmoc、nap、pyene、boc、2-chloro-z、acetyl基团、h或者自由的氨基封尾；通过采用不同的树脂，实现对多肽的碳末端r7的修饰，修饰为自由的羧基、酰胺基或者甲胺基，然后再将多肽从树脂上剪切下来，使用高效液相色谱仪分离纯化；将纯化的多肽溶液冻干，得到的多肽结构分子的结构式为

3)将冻干的多肽用ph7.0～7.4的pbs(磷酸缓冲盐溶液)分散，置于超声仪中超声，随后加热到70～85℃直至体系澄清，然后冷却至室温得到多肽水凝胶。

进一步的，所述的多肽水凝胶自组装的浓度为0.5-2mg/ml。

本发明还提供了一种多肽水凝胶载药系统，在上述的多肽水凝胶中加入阿霉素，所述的阿霉素在载药系统中的浓度为1-2mg/ml。

本发明还提供了上述的多肽水凝胶作为载药系统材料的用途。

本发明首先合成具有不同侧链长度以及不同取代基的非天然氨基酸，然后采用固相合成多肽的方法，将天然或非天然氨基酸与树脂连接，然后再连接下一个天然或者非氨基酸，所述的天然氨基酸为任意一种天然氨基酸，然后将多肽从树脂上剪切下来，纯化、冻干，得到白色粉末状固体；将白色粉末状固体用pbs分散，超声，加热直至体系澄清，随后冷却至室温得到自组装多肽水凝胶，然后将多肽水凝胶运用到阿霉素药物的运载系统中。

多肽自组装凝胶在电子透射显微镜在可直接观察到该多肽自组装水凝胶的形态、大小以及均一程度。运用此多肽自组装水凝胶，可制备一种药物运载释放系统，通过测试其药物释放动力学研究，发现通过控制多肽水凝胶的化学结构，能达到有效地调控药物的运载量以及释放速度等动力学参数。

本发明和已有技术相比，其技术进步是显著的。通过测试其性能，发现采用本发明的多肽水凝胶通过调控其化学结构能达到有效地调控控制药物释放的动力学性能，由于多肽的良好生物相容性，本发明是潜在优良的载药系统。

附图说明：

图1为实施例3中得到的多肽水凝胶的扫描电子显微镜图像。(scalebar:1μm)

图2为实施例4得到的多肽水凝胶的流变力学图。

图3为实施例5得到的多肽水凝胶药物释放的曲线图。

图4为实施例6得到的多肽水凝胶的变温cd图。

图5为实施例1中得到非天然氨基酸的核磁氢谱图。

图6为实施例1中得到非天然氨基酸的核磁碳谱图。

图7为实施例1中得到非天然氨基酸的高分辨质谱图。

图8为实施例2中得到多肽分子的分离高效液相色谱图。

图9为实施例2中得到多肽分子的质谱图。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明，而不用于限制本发明的范围。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

实施例1

本发明采用的非天然氨基酸的合成路线如下所示：

合成路线：

1.9mmol乙酰氨基丙二酸二乙酯溶解于15ml乙醇，加入10mmol乙醇钠，常温搅拌3小时。随后滴加9mmol1-溴-3苯基丙烷，在80摄氏度反应，tlc检测反应是否完全。反应完全后，反应体系用乙酸乙酯进行萃取，随后水洗，过柱，纯化，得到棕褐色固体。

2.取上述棕褐色固体溶于10ml1.8m热的氢氧化钠乙醇溶液，100摄氏度反应3小时。随后冷却至30摄氏度，用浓盐酸调节ph至5.0，过滤，滤液冷却至5-10摄氏度，用浓盐酸调ph至1.0，悬浊液在5摄氏度搅拌反应1小时，过滤保留沉淀物，干燥得到白色固体。

3.取上述9mmol白色固体溶于20ml二甲基亚砜，加入1mol氯化钾，随后溶解于水中，用8-15m浓盐酸调ph至8.0。反应体系加入d-氨基酰胺酶，所述白色固体和d-氨基酰胺酶的物料比为：1mmol：36mg，40摄氏度搅拌反应12个小时，过滤，沉淀物用正己烷洗，50摄氏度干燥得到固体。

4.取上述固体溶于水中，加入碳酸氢钠与乙二胺四乙酸二钠，所述的固体、碳酸氢钠与乙二胺四乙酸二钠的摩尔比为1：0.2：0.05，搅拌20min，用碳酸钠调节ph至7-8，反应体系用冰浴冷却至0摄氏度，将9-芴甲基-n-琥珀酰亚胺基碳酸酯溶解于乙腈当中，所述的9-芴甲基-n-琥珀酰亚胺基碳酸酯和乙腈的物料比为0.035mol：40～70ml，随后将9-芴甲基-n-琥珀酰亚胺基碳酸酯的乙腈溶液滴加至反应体系当中，，9-芴甲基-n-琥珀酰亚胺基碳酸酯和上述固体的摩尔比为1:1，室温反应12小时，反应结束后，用乙酸乙酯萃取，硫酸钠干燥，随后过柱纯化，得到白色固体，取得到的白色固体样品进行结构表征。

5.取得到的白色固体样品进行结构表征，包括核磁共振氢谱图(图5，1hoffmoc-app-oh)和核磁共振碳谱图(图6，13coffmoc-app-oh)，以及高分辨质谱图(图7，hrmsoffmoc-app-oh)，证实合成出来的样品结构准确。

实施例2

本发明的一种多肽水凝胶的结构式如下所示:

其合成的具体步骤如下：

1)用固相合成法将实施例1的非天然氨基酸与树脂连接，然后再连接下一个非天然氨基酸，非天然氨基酸的氨基端用fmoc保护；然后再将多肽分子从树脂上剪切下来，使用高效液相色谱仪分离纯化(图8，分离高效液相色谱图)，并用质谱对多肽分子的分子量进行鉴定(图9，多肽分子质谱图)，随后冻干，得到白色粉末即得到上述多肽，上述过程的流程如下所示：

将步骤1)所得到的多肽粉末用pbs溶剂分散(浓度为2mg/ml)，置于超声仪中超声，随后80度加热直至体系变澄清，冷却至室温得到多肽水凝胶。(此处为二肽形成水凝胶的操作步骤。)

实施例3

将10mg实施例2的白色冻干粉末转移到5ml的ep管(或者透明玻璃瓶)中，先加入5ml的pbs，超声仪中超声10分钟，随后80℃加热直至体系变澄清，冷却至室温得到自组装的多肽水凝胶。用光学显微镜观察；取出少量的分散有多肽多凝胶涂布在干净的硅片表面，使用扫描电子显微镜表征多肽水凝胶的形貌，结果如图1所示。

实施例4

将上述制备好的多肽凝胶均匀地流变测试仪当中，测试其流变力学性质，如图2所示。(g’≈1300，g”≈50)

实施例5

在实施例2制备多肽水凝胶加热冷却过程中，在冷却至37℃还没有形成水凝胶的溶液中，滴加一定量的阿霉素，使其最终浓度为1-2mg/ml,然后继续冷却静置，直至多肽水凝胶逐渐形成。图3显示阿霉素在多肽水凝胶中的释放情况，如图3所示。载药量为1mg/ml的水凝胶在60小时，释放阿霉素的量为80％，而载药量为2mg/ml的水凝胶在60小时后，其阿霉素释放量为63％。

实施例6

将上述制备好的多肽凝胶均匀地分散至pbs当中，测量其变温cd，如图4所示。在25摄氏度时，水凝胶的二级结构为规整的β折叠，而且π-π作用力是最强的，随着温度β折叠的二级结构逐渐破坏，形成的π-π作用力也随之减弱。

以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制，应当指出，对于本领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还将可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，当可利用以上所揭示的技术内容而做出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对上述实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。