一种制备具有多级结构的三维矿化胶原支架材料的方法与流程

本发明涉及材料领域，具体是一种制备具有多级结构的三维矿化胶原支架材料的方法。

背景技术

骨是一种复杂的、动态的物质。骨包含一种矿化基质，其中心空腔含有红骨髓，能够确保哺乳动物始终维持骨组织的完整。临床中，由于肿瘤、创伤、遗传疾病导致的颌面部骨组织缺损一直居高不下。据统计，每年由于肿瘤切除导致骨缺损就有上百万人口。随着器官和组织的供应不足，使用天然或合成的生物材料移植体如聚合物、金属、陶瓷、自体或异体移植骨等材料作为移植体的组织工程学的高速发展应运而生。制备类天然骨材料就要完全复制其等级结构和表面形貌，间隙区和重叠区交错排列的纳米拓补构造便于细胞的附着、增殖和分化。具严格等级结构的三维矿化胶原支架材料模拟了天然骨的等级结构和表面形态，并以此提供利于招募宿主细胞的微环境，最后从结构和功能上实现骨再生。然而引导三维支架材料自组装的能量调控机理尚未明确。材料合成步骤中的能量交换完全不同于活体中的自然过程。自然界中通过连续不断地消耗生物能达到等级结构错列的纳米结构，这是一个能量升高的过程。生物体在酶的作用和三磷酸腺苷的消耗下，在胶原纤维的间隙区域实现钙离子的选择性通过和纳米羟基磷灰石的结晶化沉积。与之相反，体外的自组装是个消耗自由能的能量下降的过程。一些体外模型解释了纤维内矿化的机理，包括毛细力理论、尺寸排外理论和静电相互作用理论。然而，这些理论只适用于解释羟基磷灰石的纤维内成核，不能解释等级结构的产生。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种制备具有多级结构的三维矿化胶原支架材料的方法，以解决上述背景技术中提出的问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种制备具有多级结构的三维矿化胶原支架材料，包括以下原料及采购来源：鼠尾i型原胶原溶液(bdbio-sciences)、透析袋(3500da,invitrogen,paisly,uk)、paa(m.w.72，2000，5000)(sigma-aldrich,usa)、磷酸缓冲液(gibco,invitrogen,paisly,uk)及甘氨酸(sigma-aldrich，usa)；利用聚合物与钙的螯合物作为中间体，通过控制中间体自由能选择合适分子量及浓度的聚合物对钙离子进行络合及转移，制备具骨样多级结构的三维矿化胶原支架材料和非多级结构胶原支架及纤维外矿化胶原支架材料，所述聚合物分子量越高羧基含量越大，与钙离子结合强度越大，从而自由能越低；所述聚合物分子量越低羧基含量越小，不易于钙离子结合其自由能越高，当中间体自由能高于钙离子与胶原间隙区结合自由能，并低于钙离子与胶原重叠区结合自由能时；由热力学控制钙离子定向专递给胶原间隙区，实现具骨样多级结构的三维矿化胶原。

作为本发明进一步的方案：所述聚合物为聚丙烯酸，聚乳酸，聚甲基丙烯酸，聚甲基丙烯酸甲酯，聚马来酸，聚天冬氨酸，聚谷氨酸，聚乙二醇的嵌段共聚物中的一种。

作为本发明进一步的方案：聚合物与钙结合的中间体自由能由以下公式计算得出：

△g(聚合物-钙中间体)＝-rtlnk(聚合物-钙中间体)+rtln([聚合物-钙中间体浓度])/([钙离子浓度]^螯合数[聚合物浓度])

控制聚合物其分子量可调控聚合物-钙中间体的自由能，当聚合物-钙中间体的自由能在1720～2265之间时，中间体的自由能与钙离子结合自由能高于钙离子与胶原间隙区结合自由能并低于钙离子与胶原重叠区结合自由能时，实现具严格等级具有骨样多级结构的矿化胶原；所述聚丙烯酸分子量小于1720时，聚丙烯酸-钙中间体的自由能其与钙离子结合自由能既即高于钙离子与胶原间隙区结合自由能，又高于钙离子与胶原重叠区结合自由能时，此时钙离子的传输失去选择性同时沉积于胶原的间隙区和重叠区，形成无等级结构的矿化胶原；当聚丙烯酸分子量大于2265时，聚丙烯酸-钙中间体的自由能此时钙离子与中间体结合足够稳定，自由能同时低于钙离子与胶原间隙区及重叠区结合自由能，此时钙离子不向胶原内部传输，形成纤维外矿化胶原。

作为本发明进一步的方案：所述的制备具有多级结构的三维矿化胶原支架材料的方法，其特征在于，具体步骤如下：

(1)胶原矿化：将盛有0.001～100g的i型原胶原的透析袋浸入到矿化液中，矿化液包含磷酸源和i型白色硅酸盐水门汀，矿化液的磷酸盐部分包含136.9mmnacl,2.7mm的kcl,8.3mm的na2hpo4,1.25mm的k2hpo4·3h2o,以及3.08mm的na3n,溶剂为水，用hcl和naoh将溶液ph调节为7.4；矿化液中硅酸盐水门汀的含量为0.001～10g，矿化液的体积为1～100ml，提供持续不断释放的钙离子；

(2)羟基磷灰石的有序结晶沉积：在矿化液中加入聚丙烯酸，所述聚丙烯酸分子量区间1720～2265，同时使所述聚丙烯酸在矿化液中浓度保持为0.2mm～1mm，在湿润的环境中于25℃下透析一周，每三天换一次矿化液；

(3)三维多孔框架的合成：将步骤(2)得到的矿化胶原离心、搅拌得到悬浮液，注入到模具中冷冻干燥得到三维海绵状的胶原支架；为确保稳定的微环境，在含有1-乙基(3-二甲基氨丙基)碳化二亚胺盐酸盐的乙醇溶液中进一步交联4小时，随后用甘氨酸溶液与双蒸水交替冲洗，冻干，即得到具严格等级结构的三维矿化胶原支架。

作为本发明进一步的方案：步骤(3)中所述的edc溶液的配置方法为：将1g的edc加入到99ml80％乙醇中，使其质量百分数为1％。

作为本发明进一步的方案：步骤(3)中所述的甘氨酸溶液的质量百分浓度为1％。

作为本发明进一步的方案：所述的制备具有多级结构的三维矿化胶原支架材料在制备骨组织修复材料中的应用。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

1、本发明制备过程中添加paa，paa的存在可以有效抑制纤维外矿化胶原的产生，通过对paa分子量的调节实现具严格等级结构的纤维内矿化胶原支架是螯合剂三维胶原支架；paa含有多重钙离子结合位点，与磷酸根相竞争、通过静电作用来络合钙离子。分子量是衡量一条paa分子上结合位点数目的指标。调节paa的分子量可以调节中间体的能级并进一步调节矿化胶原纤维的纳米拓补形貌。paa分子量越高，其结合钙离子的能力越强，可以消耗最少的自由能形成稳定的paa-ca中间体，这也意味着其无法传递钙离子并由此导致纤维外矿化胶原(emc)的产生，小分子量的paa具有较弱的钙离子结合能力，将会产生高能活性paa-ca中间体，活跃的钙离子传递使其在胶原纤维的间隙区和重叠区无差异性沉积，最终导致非等级结构的矿化胶原支架(nimc)；

2、还通过对paa的浓度调节实现具严格等级结构的纤维内矿化胶原支架是螯合剂三维胶原支架；产生纤维内矿化的适宜浓度窗口非常窄，低浓度的paa不足以与磷酸根竞争导致羟基磷灰石(ha)大量生成从而导致纤维外矿化；然而过量的paa虽然避免了纤维外矿化，但是由于消耗了大量的钙离子抑制了ha成核，无法在纤维内矿化；

3、使用paa的分子量及浓度调节活性中间体paa-ca的自由能，在理论计算的辅导下，成功完成体外himc的制备；制备过程简便易行，绿色环保，有利于实现工业化大规模生产；

4、本发明中，采用的体外himc的制备是在热力学的控制下，在纤维的空隙部分进行选择性的矿化从而得到周期性沉积的纳米ha晶体；一条i型胶原分子含有数百个功能区和活性结合位点，胶原通常被认为是富含带电氨基酸的大分子，如谷氨酸、天冬氨酸可直接与paa竞争从而与钙离子结合。带有正电荷的氨基酸如赖氨酸和精氨酸可以与磷酸阴离子通过静电作用结合从而促进ha的成核。一旦中间体paa-ca与胶原分子发生共组装，paa-ca就会扩散进胶原纤维内部将钙离子从paa分子上运送到胶原分子上。

附图说明

图1为himc的结构示意图及扫描(sem)和透射(tem)电镜图的与天然骨相同的纳米拓补结构图。

图2为himc的扫描透射显微镜元素分布图(stem-edx)中纳米羟基磷灰石选择性分布在胶原纤维的间隙区域图。

图3为nimc的结构示意图及sem和tem电镜图。

图4为emc的结构示意图及sem和tem电镜图。

图5为不同分子量的paa(paa2000、paa72、paa5000)与间隙区(gap)和重叠区(overlap)同钙离子发生结合的吉布斯自由能三维分布图。

图6为由中间体自由能计算结果得出适宜himc生产的paa分子量窗口图。

图7为胶原分子式图

图8为三种不可溶磷酸钙产物的吉布斯自由能分布图。

图9为硅酸盐水门汀与paa2000作用时释放钙离子的浓度-时间曲线图。

图10为ha与paa2000-ca的吉布斯自由能三维分布图。

图11为不同paa2000浓度下制备的胶原纤维的tem图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

一种制备具有多级结构的三维矿化胶原支架材料，包括以下原料及采购来源：鼠尾i型原胶原溶液(bdbio-sciences)、透析袋(3500da,invitrogen,paisly,uk)、paa(m.w.72，2000，5000)(sigma-aldrich,usa)、磷酸缓冲液(gibco,invitrogen,paisly,uk)及甘氨酸(sigma-aldrich，usa)。

所述制备具有多级结构的三维矿化胶原支架材料的方法；具体步骤如下：

(1)磷酸缓冲液的配置：分别称取8g的nacl、0.2g的kcl、3g的na2hpo4、0.29g的ka2hpo4·3h2o及0.2g的na3n溶于1l去离子水中，用naoh和hcl调节溶液ph在7.4；

(2)胶原矿化：将盛有10.6ml9.46mg/ml的鼠尾i型原胶原溶液的透析袋(截留分子量3500)浸入到30ml的磷酸缓冲液中。向上述溶液中加入200mgi型白色硅酸盐水门汀；

(3)羟基磷灰石的有序结晶沉积：在(2)中溶液加入0.5g分子量为2000的聚丙烯酸(paa2000)，使其浓度在矿化液中保持为0.25mm；在湿润的环境中于25℃下透析一周，每三天换一次矿化液；

(4)三维多孔框架的合成：将步骤(3)中得到的矿化胶原离心、搅拌形成一种可铸形的悬浮液，注入到圆柱形或长方形的模具中冷冻干燥得到三维海绵状的胶原支架；为确保稳定的微环境，再使用重量比1％的1-乙基(3-二甲基氨丙基)碳化二亚胺(edc)在80％的乙醇中进一步交联4小时，随后用甘氨酸溶液与双蒸水交替冲洗，冻干，即得到具严格等级结构的三维矿化胶原支架。

实施例2

一种制备具有多级结构的三维矿化胶原支架材料，包括以下原料及采购来源：鼠尾i型原胶原溶液(bdbio-sciences)、透析袋(3500da,invitrogen,paisly,uk)、paa(m.w.72，2000，5000)(sigma-aldrich,usa)、磷酸缓冲液(gibco,invitrogen,paisly,uk)及甘氨酸(sigma-aldrich，usa)。

所述制备具有多级结构的三维矿化胶原支架材料的方法；具体步骤如下：

(1)磷酸缓冲液的配置：分别称取8g的nacl、0.2g的kcl、3g的na2hpo4、0.29g的ka2hpo4·3h2o及0.2g的na3n溶于1l去离子水中，用naoh和hcl调节溶液ph在7.4；

(2)胶原矿化：将盛有10.6ml9.46mg/ml的鼠尾i型原胶原溶液的透析袋(截留分子量3500)浸入到30ml的磷酸缓冲液中。向上述溶液中加入200mgi型白色硅酸盐水门汀；

(3)羟基磷灰石的有序结晶沉积：在(2)中溶液加入0.5g分子量为72的聚丙烯酸(paa72)，使其浓度在矿化液中保持为0.25mm；在湿润的环境中于25℃下透析一周，每三天换一次矿化液；

(4)三维多孔框架的合成：将步骤(3)中得到的矿化胶原离心、搅拌形成一种可铸形的悬浮液，注入到圆柱形或长方形的模具中冷冻干燥得到三维海绵状的胶原支架；为确保稳定的微环境，再使用重量比1％的1-乙基(3-二甲基氨丙基)碳化二亚胺(edc)在80％的乙醇中进一步交联4小时，随后用甘氨酸溶液与双蒸水交替冲洗，冻干，即得到具严格等级结构的三维矿化胶原支架。

实施例3

一种制备具有多级结构的三维矿化胶原支架材料，包括以下原料及采购来源：鼠尾i型原胶原溶液(bdbio-sciences)、透析袋(3500da,invitrogen,paisly,uk)、paa(m.w.72，2000，5000)(sigma-aldrich,usa)、磷酸缓冲液(gibco,invitrogen,paisly,uk)及甘氨酸(sigma-aldrich，usa)。

所述制备具有多级结构的三维矿化胶原支架材料的方法；具体步骤如下：

(1)磷酸缓冲液的配置：分别称取8g的nacl、0.2g的kcl、3g的na2hpo4、0.29g的ka2hpo4·3h2o、0.2g的na3n溶于1l去离子水中，用naoh和hcl调节溶液ph在7.4；

(2)胶原矿化：将盛有10.6ml9.46mg/ml的鼠尾i型原胶原溶液的透析袋(截留分子量3500)浸入到30ml的磷酸缓冲液中。向上述溶液中加入200mgi型白色硅酸盐水门汀；

(3)羟基磷灰石的有序结晶沉积：在(2)中溶液加入0.5g分子量为5000的聚丙烯酸(paa5000)，使其浓度在矿化液中保持为0.25mm；在湿润的环境中于25℃下透析一周，每三天换一次矿化液；

(4)三维多孔框架的合成：将步骤(3)中得到的矿化胶原离心、搅拌形成一种可铸形的悬浮液，注入到圆柱形或长方形的模具中冷冻干燥得到三维海绵状的胶原支架；为确保稳定的微环境，再使用重量比1％的1-乙基(3-二甲基氨丙基)碳化二亚胺(edc)在80％的乙醇中进一步交联4小时，随后用甘氨酸溶液与双蒸水交替冲洗，冻干，即得到具严格等级结构的三维矿化胶原支架。

实施例1中，具有特定分子量的paa2000与钙离子形成的中间体paa2000-ca可以引导himc的生成。如图1所示，所形成的himc直径为136.8±36.9nm，拥有明暗区对比的周期性纳米结构间距为63.9±3.3nm。如图2所示，himc的明场和暗场图显示高电子密度的纳米级羟基磷灰石(nha)优先沉积在胶原纤维束的间隙区，形成类似天然骨的等级性错列结构。元素分布图显示胶原纤维束具有明显的条带状区域，间隙区和重叠区交错排列。间隙区具有较高含量的ca、p、o元素，c元素含量较低。而重叠区刚好相反，ca、p、o元素含量较低，c元素含量较高；实施例2中，不同分子量的paa会导致形成完全不同纳米结构的胶原支架。图3为使用paa72-ca为中间体得到的nimc纤维由短的细丝集结而成，直径为162.2±39.2nm。tem图显示nimc纤维内部的矿化物质破坏了胶原支架的等级性拓补纳米结构；实施例3中，paa5000-ca为中间体制备的胶原支架为纤维外矿化产物emc，图4显示大小为83.9±7.7nm的nha杂乱地堆积在胶原纤维周围。

实施例1中paa分子量对于中间体paa-ca的吉布斯自由能影响：图5a显示了中间体paa2000-ca及间隙区与钙离子(gap-ca)、重叠区与钙离子(overlap-ca)这三种物质的结合自由能的数据比对结果。paa2000-ca的自由能位于overlap-ca和gap-ca的自由能之间。而gap-ca的自由能是三者中最低的，这也意味着paa2000-ca将是运送钙离子进入到自由能最低的间隙区域矿化成核的关键中间体，降低了体系的能量。paa的分子量能通过调节与钙离子的结合数目从而影响paa-ca的自由能。当使用较低分子量的paa时，以paa72为例，paa72-ca的自由能较高。如图5b所示，一旦能量超过了overlap-ca和gap-ca的自由能，钙离子就会无差别的分布在胶原纤维的overlap区和gap区，导致nimc的生成。而具有更大络合能力的高分子量paa则会抑制钙离子的释放。以paa5000为例，如图5c所示，由于paa5000-ca具有最低的自由能将会导致钙离子在胶原纤维外矿化成核形成ha晶，最终形成emc。而具有合适分子量的paa与钙离子结合，paa-ca的自由能处于overlap-ca和gap-ca的自由能之间，则会形成稳定的himc结构。可以通过以下计算过程得出利于himc形成的适宜paa分子量区间：

计算结果可由图6表明，适宜himc形成的paa分子量区间为1720～2265。增大paa的分子量，中间体paa-ca的自由能将进一步减小。一旦paa的分子量超过2265，paa-ca的自由能将低于gap-ca，这也意味着paa-ca不会将钙离子传递给结合能量高的间隙区最终导致纤维外矿化。而paa的分子量小于1720的话，paa-ca的自由能会高于overlap-ca。钙离子将无差别的沉积在间隙区和重叠区，最终导致产品无等级性错列结构。三者间的自由能关系可由下式表达：

一旦钙离子在胶原纤维的间隙区或重叠区沉积，nha将在此处速成核生长。如图7所示，胶原分子中带正电的氨基酸和带负电的氨基酸由于静电作用彼此靠近，导致了钙离子吸附区和磷酸根吸附区的重叠，最终形成nha。

在实施例2中，钙离子释放及nha成核晶化的影响：在仿生矿化的过程中，胶原纤维暴露在含有大量钙离子及磷酸根的弱碱性溶液中。溶液中大量的po43-、hpo42-、h2po4-可促进不可溶的磷酸如羟基磷灰石(ha)、磷酸八钙(ocp)、磷酸二钙(dcpd)的成核和晶化。反应的方程式如下所示：

形成这些磷酸钙化合物的吉布斯自由能可由下式计算得出，

图8记录了理论计算的结果，与ocp和dcpd相比，ha的形成可以有效降低系统系统自由能。这也说明ha更容易在胶原纤维上成核。如果没有paa这种带有多重负电荷的聚合物存在下，大量的大可数百纳米直径的ha将会在溶液中生产。如此大的粒径使得ha不能进入到纤维内部从而只能在外部矿化且进一步阻碍了ha扩散进纤维内部。而且，ha的结晶会耗尽矿化液中的钙离子和磷酸根。因此，不溶的磷酸钙产物将会抑制胶原的纤维内矿化。

实施例3中paa浓度对中间体paa-ca的吉布斯自由能影响：在矿化过程中，钙离子逐渐从硅酸盐水门汀中释放出来。图9记录了不同时间点的下钙离子浓度。理论计算结果表明在低浓度的钙离子和磷酸根离子存在下，热力学优先生产ha晶体。竞争产物ha与paa-ca的自由能三维模式图如图10所示，显示在反应物浓度增大时paa-ca的自由能以指数形式快速下降。paa的浓度决定了产物是纤维内矿化还是纤维外矿化。在矿化进行到4h时，钙离子的浓度达到0.9m，这是形成ha与paa-ca产物的分界点。由计算结果表明，paa-ca只能在其浓度高于0.2mm的情况下为能量优先的产物。低浓度的paa会导致ha晶体不可逆的相变。在反应进行至72h时，钙离子的浓度增至1.95m，paa-ca成为热力学优先的产物。这将不利于中间体paa-ca向ha的过渡，抑制ha的成核晶化，最终导致纤维内矿化的失败。

因此，在低浓度的paa2000存在下(0～1mm)，中间体paa2000-ca的自由能低于阈值，只能产生纯粹的paa2000-ca中间体。根据热力学能量降低的理论，趋向于形成纤维内矿化的胶原。这些paa2000-ca中间体很小，可以与胶原纤维共组装。具体地，参照实施例1中himc的制备，其中paa2000的浓度上限为1mm，如图11a所示，所制得的胶原纤维内部有尺寸极小的ha纳米颗粒。当paa2000的浓度过高时，如图11b所示，当paa2000的浓度超过1mm时，过量的paa2000虽然避免了纤维外矿化，但是也消耗了过多的自由钙离子改变了无机相晶化动力学条件，延迟了ha的成核。

综上所述，本发明所提出的以控制中间体自由能方式制备具严格等级结构的三维矿化胶原支架材料，可通过调控聚合物paa的分子量、浓度方式得到不同胶原支架材料。只有处于合适窗口的paa分子量和浓度才是热力学适宜的、制备himc的有效窗口。该制备方法是在理论指导下的具有导向性、可预见性的材料制备手段。本发明所提出的himc材料，具有与天然骨类似的化学成分和表面等级结构，可以应用于人工骨修复领域。

对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。

此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。