一种特异性核酸适配体键合的PEG-PLGA纳米粒及其制备方法与流程

本发明属于化学药物技术领域，涉及一种使生物分子核酸适配体成功键合在高分子材料上的方法，使高分子纳米粒具有主动靶向性的制备方法。

背景技术：

适配体是一些寡核酸或肽，其对几种类型的靶分子，包括蛋白质，核苷酸，肽，抗生素，小分子和细胞有高度的敏感性和良好的选择性。小核酸适配体在严苛的条件下表现出良好的稳定性，肽适配体具有与靶分子相互作用的合适结构。所有类型的适配体含有结合到靶分子的特定袋的可变环和茎区。适配体与抗体具有不同的优点，包括较小的尺寸，易于修饰和在苛刻的物理和化学环境中的高稳定性，以及快速和经济的生产，无批次间变化，低免疫原性和高度可变性。因此，适配体在医学目标和成像期间被认为是抗体的极好替代物，并且用于各种领域。核酸适配体的筛选技术被称为指数富集的配体系统进化技术(selex)技术，原理是首先构建容量巨大的随机寡核苷酸序列库，然后经过多轮结合和洗脱，从中获得能够和靶标物质高度亲和的寡核苷酸。selex是四个主要步骤的重复：与编码随机序列的适配体文库，通常为30-50mer，和引物结合位点；结合文库的洗脱；用聚合酶链反应扩增；和单链寡核苷酸分离。该过程通常重复10-15次，然后使用克隆技术分析所选择的适配体候选物。

许多纳米材料的开发加速了诊断和治疗的进展。各种纳米材料，如水凝胶，金属纳米颗粒，二氧化硅纳米颗粒和碳材料，具有理想的特性，包括可控的物理和化学性质，较大的表面积，强大的生物相容性并具有突出的稳定性。尽管纳米材料本身可用作诊断和治疗剂，但它们缺乏选择性靶向能力。因此，适配体-纳米材料复合物的设计与产生已应用在多个区域。

技术实现要素：

本发明的目的是通过特定的方法使核酸适配体能够成功与peg-plga纳米粒结合在一起，使peg-plga纳米粒具有主动靶向性，同时提高核酸适配体在体内的生物活性。

本发明技术方案如下。

该发明中使用的物质是复乳法制备的peg-plga纳米粒(plga(50/50)分子量为17k,peg的分子量为3.4k)表面具有羧基，而靶向cd30的核酸适配体通过已知序列合成后在3’端修饰氨基，由31个碱基组成，分子量为10315.09。

一种特异性核酸适配体键合的peg-plga纳米粒的制备方法，先将纳米粒上的羧基与交联剂edc/nhs反应后形成活化的羧基，再与核酸适配体上的氨基反应形成酰胺键，则能使核酸适配体成功键合在纳米粒上。

上述方法中，采用的活化体系为edc和nhs，所用的溶剂为ph＝5-6之间的mes，反应时间为8-14h。

上述方法中，所述纳米粒与核酸适配体的反应摩尔比为1:1.2～1:1.5，而使用的交联剂edc与nhs之间的摩尔比2:1～1.5:1。

一种特异性核酸适配体键合的peg-plga纳米粒的制备方法，包括如下步骤：

(1)取0.1g-0.4g的peg-plga溶于4-5ml的二氯甲烷中，溶解后加入100-400μl的10mg/ml的dox溶液，120w-160w超声30s-1分钟后，逐滴加入到15-25ml的0.5％-1.2％胆酸钠溶液中，150w-250w冰浴下超声5-7分钟后，获得粉红色乳液，即载dox的peg-plga纳米粒；

(2)将步骤(1)中的乳液加入到旋转蒸发仪中，除去二氯甲烷，去离子水清洗3遍后，用ph＝5.5的mes重悬；

(3)将步骤(2)中的溶液中加入350mm-450mm的edc(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)，常温下磁力搅拌10-15分钟，其中纳米粒表面的羧基与edc发生交联，形成中间产物；

(4)在步骤(3)中加入200mm的sulfo-nhs(n-羟基硫代琥珀酰亚胺)，nhs中羟基会与纳米粒上的-cooh偶合形成一个o-异酰基脲结构，该结构为一种活化的中间产物，磁力搅拌下充分反应30-60分钟；

(5)加入10-20μl的β-巯基乙醇灭活未反应的edc与nhs，使用无酶水清洗纳米粒，由于edc、nhs均为水溶性物质，所以很容易被水冲洗除去；

(6)使用无酶水溶解合成的c2np核酸适配体，配置成0.5-1mg/ml的适配体溶液，放入85-95℃的水浴中加热10-15分钟后，迅速取出，放置冰浴水中10-15分钟迅速冷却，致使核酸适配体变性，恢复其本身的特异型结构；

(7)使用ph＝7.4的pbs缓冲液重悬5中得到的产物，使反应条件稳定在ph＝7.4的环境下，加入1-2ml的步骤(6)所得的核酸适配体，搅拌反应8-12h，其中核酸适配体上的氨基(-nh2)基团将会进攻活化的中间产物部分，形成酰胺交联，而活化的中间物将会被消除；

(8)反应后使用超滤装置过滤掉未反应的核酸适配体，无酶水清洗后，重悬于无酶水，4℃下储存备用，得到特异性核酸适配体键合的peg-plga纳米粒。收集滤液和清洗液，用于间接测量核酸适配体与纳米粒的键合率；

(9)取部分步骤(8)所得的纳米粒离心干燥成粉末，用于检测核磁、红外、x射线电子能谱。检测是否键合成功。

一种将cd30核酸适配体——c2np通过edc/nhs交联剂的作用下，c2np上的氨基成功键合在peg-plga纳米粒的羧基上的特殊方法，其特性在于能使得更多的核酸适配体结合在纳米粒上，不被体液轻易分解，生物相容性好，并且使纳米粒具有主动靶向特性。

本发明中靶向恶性淋巴瘤上的特征物质cd30的核酸适配体c2np的结构为：

c2np5'-actgggcgaaacaagtctattgactatgagc-3'

5’-actgggcgaaacaagtctattgactatgag

c-nh2-3’；在3’端修饰上氨基之后，并不会对核酸适配体的结构产生影响，但是却可以将核酸适配体通过共价结合与其他物质结合发挥其特性。

一种表面具有羧基peg-plga纳米粒，纳米粒具有与核酸适配体相结合的必备条件。

本发明中需要设计正交试验，将edc/nhs的摩尔比、纳米粒与核酸适配体的摩尔比、溶剂条件、edc与核酸适配体的摩尔比等因素作为反应条件的最优化。可通过将目标产物干燥后，经过核磁、红外、x射线电子能谱表征，验证核酸适配体成功键合在peg-plga纳米粒上，并且计算出核酸适配体与纳米粒的键合率。

与现有技术相比，本发明的优势在于：

这是一种特殊的方法使得特异型核酸适配体与纳米粒上的-nh2能充分结合在一起，结合效率高并且结合之后效果稳定，并且在将核酸适配体活化的过程中，不会将其灭活失去效应。

附图说明

图1核酸适配体与纳米粒反应过程流程图；

图2不同纳米粒与细胞结合率的示意图；

图3核酸适配体-纳米粒复合物与细胞结合图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步地具体详细描述，但本发明的实施方式不限于此，对于未特别注明的工艺参数，可参照常规技术进行。

实施例1

一、合成具有主动靶向性的peg-plga纳米粒分子

(1)0.2g的peg-plga溶于4ml的二氯甲烷中，溶解后加入400μl的10mg/ml的dox溶液(多柔比星溶液)，150w超声1分钟后，逐滴加入到20ml的1％胆酸钠溶液中，200w冰浴下超声5分钟后，获得粉红色乳液，即载dox的peg-plga纳米粒。

(2)将步骤(1)中的乳液加入到旋转蒸发仪中，除去二氯甲烷。去离子水清洗3遍后，用ph＝5.5的mes重悬。

(3)将步骤(2)中的溶液中加入过量的400mm的edc(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)，常温下磁力搅拌10分钟，其中纳米粒表面的羧基与edc发生交联，形成中间产物。

(4)在步骤(3)中加入200mm的sulfo-nhs(n-羟基硫代琥珀酰亚胺)，nhs中羟基会与纳米粒上的-cooh偶合形成一个o-异酰基脲结构，该结构为一种活化的中间产物，磁力搅拌下充分反应30分钟。

(5)加入10μl的β-巯基乙醇灭活未反应的edc与nhs，防止edc与nhs自身反应，影响后续实验。使用无酶水清洗纳米粒三遍，由于edc、nhs均为水溶性物质，所以很容易被水冲洗除去。

(6)使用无酶水溶解合成的c2np核酸适配体，配置成0.5mg/ml的适配体溶液，放入85℃的水浴中加热10分钟后，迅速取出，放置冰浴水中10分钟迅速冷却。致使核酸适配体变性，恢复其本身的特异型结构。

(7)使用ph＝7.4的pbs缓冲液重悬步骤(5)中得到的产物，使反应条件稳定在ph＝7.4的环境下，加入1ml的步骤(6)所得的核酸适配体，搅拌反应12h，其中核酸适配体上的氨基(-nh2)基团将会进攻活化的中间产物部分，形成酰胺交联，而活化的中间物将会被消除。

(8)反应后使用超滤装置过滤掉未反应的核酸适配体，无酶水清洗3遍后，重悬于无酶水，4℃下储存备用。收集滤液和清洗液，可用于间接测量核酸适配体与纳米粒的键合率。

(9)取部分步骤(8)所得的纳米粒离心干燥成粉末，用于检测核磁、红外、x射线电子能谱。检测是否键合成功。

实施例2

(1)0.2g的peg-plga溶于4ml的二氯甲烷中，溶解后加入400μl的10mg/ml的dox溶液(多柔比星溶液)，150w超声1分钟后，逐滴加入到20ml的1％胆酸钠溶液中，200w冰浴下超声5分钟后，获得粉红色乳液，即载dox(多柔比星)的peg-plga纳米粒。

(2)将步骤(1)中的乳液加入到旋转蒸发仪中，除去二氯甲烷。去离子水清洗3遍后，用ph＝7.4的pbs重悬。

(3)将步骤(2)中的溶液中加入过量的400mm的edc(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)，常温下磁力搅拌10分钟，其中纳米粒表面的羧基与edc发生交联，形成中间产物。

(4)在步骤(3)中加入200mm的sulfo-nhs(n-羟基硫代琥珀酰亚胺)，nhs中羟基会与纳米粒上的-cooh偶合形成一个o-异酰基脲结构，该结构为一种活化的中间产物，磁力搅拌下充分反应30分钟。

(5)加入10μl的β-巯基乙醇灭活未反应的edc与nhs，防止edc与nhs自身反应，影响后续实验。使用无酶水清洗纳米粒三遍，由于edc、nhs均为水溶性物质，所以很容易被水冲洗除去。

(6)使用无酶水溶解合成的c2np核酸适配体，配置成0.5mg/ml的适配体溶液，放入85℃的水浴中加热10分钟后，迅速取出，放置冰浴水中10分钟迅速冷却。致使核酸适配体变性，恢复其本身的特异型结构。

(7)使用ph＝7.4的pbs缓冲液重悬步骤(5)中得到的产物，使反应条件稳定在ph＝7.4的环境下，加入1ml的步骤(6)所得的核酸适配体，搅拌反应12h，其中核酸适配体上的氨基(-nh2)基团将会进攻活化的中间产物部分，形成酰胺交联，而活化的中间物将会被消除。

(8)反应后使用超滤装置过滤掉未反应的核酸适配体，无酶水清洗3遍后，重悬于无酶水，4℃下储存备用。收集滤液和清洗液，可用于间接测量核酸适配体与纳米粒的键合率。

(9)取部分步骤(8)所得的纳米粒离心干燥成粉末，用于检测核磁、红外、x射线电子能谱。检测是否键合成功。

实施例3

(1)0.2g的peg-plga溶于4ml的二氯甲烷中，溶解后加入400μl的10mg/ml的dox溶液(多柔比星溶液)，150w超声1分钟后，逐滴加入到20ml的1％胆酸钠溶液中，200w冰浴下超声5分钟后，获得粉红色乳液，即载dox(多柔比星)的peg-plga纳米粒。

(2)将步骤(1)中的乳液加入到旋转蒸发仪中，除去二氯甲烷。去离子水清洗3遍后，用无酶水重悬。

(3)将步骤(2)中的溶液中加入过量的400mm的edc(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)，常温下磁力搅拌10分钟，其中纳米粒表面的羧基与edc发生交联，形成中间产物。

(4)在步骤(3)中加入200mm的sulfo-nhs(n-羟基硫代琥珀酰亚胺)，nhs中羟基会与纳米粒上的-cooh偶合形成一个o-异酰基脲结构，该结构为一种活化的中间产物，磁力搅拌下充分反应30分钟。

(5)加入10μl的β-巯基乙醇灭活未反应的edc与nhs，防止edc与nhs自身反应，影响后续实验。使用无酶水清洗纳米粒三遍，由于edc、nhs均为水溶性物质，所以很容易被水冲洗除去。

(6)使用无酶水溶解合成的c2np核酸适配体，配置成0.5mg/ml的适配体溶液，放入85℃的水浴中加热10分钟后，迅速取出，放置冰浴水中10分钟迅速冷却。致使核酸适配体变性，恢复其本身的特异型结构。

(7)使用ph＝7.4的pbs缓冲液重悬步骤(5)中得到的产物，使反应条件稳定在ph＝7.4的环境下，加入1ml的步骤(6)所得的核酸适配体，搅拌反应12h，其中核酸适配体上的氨基(-nh2)基团将会进攻活化的中间产物部分，形成酰胺交联，而活化的中间物将会被消除。

(8)反应后使用超滤装置过滤掉未反应的核酸适配体，无酶水清洗3遍后，重悬于无酶水，4℃下储存备用。收集滤液和清洗液，可用于间接测量核酸适配体与纳米粒的键合率。

(9)取部分步骤(8)所得的纳米粒离心干燥成粉末，用于检测核磁、红外、x射线电子能谱。检测是否键合成功。

实施例4

不同溶液中反应后与细胞的结合率对比

在实施例1、例2、例3中分别使用不同ph的溶液重悬纳米粒，分别为ph＝5.5的mse溶液、ph＝7.4的pbs溶液、无酶水。取得不同形式的载核酸适配体的纳米粒后，与细胞培育30分钟后，收集细胞做流式检测细胞与纳米粒的结合率。不同形式的纳米粒与细胞的结合效率如下图(图2)所示。由图2可知，实例1中使用ph＝5.5的mes溶液与细胞的结合率最高，说明本方法效果最佳。

实施例5

纳米粒的表征检测

根据实施例4中，在ph＝5.5的mes溶液中纳米粒与特异型核酸适配体反应后，与细胞结合效率最佳。图3中是实施例1中载核酸适配体纳米粒与细胞的结合效果图，能明显发现结合效率良好。

采用实施例1中的纳米粒粉末，使用xps(x射线光电子能谱)检测纳米粒的表面元素，根据表面元素检测特异型核酸适配体能否成功与纳米粒相结合。如表1所示，在载核酸适配体纳米粒(apt-dox-np)中检测到了属于核酸适配体中独有的氮元素(n)与磷元素(p)，说明核酸适配体成功与纳米粒键合。

表1xps结果分析dox-np与apt-dox-np

本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。

序列表

<110>华南理工大学

<120>一种特异性核酸适配体键合的peg-plga纳米粒及其制备方法

<160>1

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>31

<212>prt

<213>cd30核酸适配体(cd30aptamer)

<400>1

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