改善皮肤的组合物、其制备工艺及应用的制作方法

本发明属于化妆品领域，更具体地，本发明涉及一种改善皮肤的组合物(增液能量元)，其制备工艺及应用。
背景技术：
皮肤分布于人体表层，一般由外至内分为表皮、真皮和皮下组织三大部分，而表皮又分为角质层、透明层、颗粒层、棘层及基底层。皮肤最外层的角质层，于皮肤屏障功能的完整起着很重要的作用。角质层上面有一层皮脂膜，是由皮脂、汗液和表皮细胞分泌物乳化而形成的半透明乳状薄膜，皮脂膜中的游离脂肪酸、乳酸盐、尿素和尿酸为天然的保湿因子，对皮肤起保湿作用。角质层和皮脂膜可以防止皮肤水分的丢失。正常情况下，角质层的含水量应该在10％左右，低于这个水平，就是缺水肌肤。皮肤状态欠佳、肤质干燥，是现代人，特别是现代女性经常遇到的问题。导致皮肤出现问题的原因是多方面的：包括年龄因素、气候变化、睡眠不足、疲劳、过度减肥及偏食、使用刺激性产品等等。随着年龄的增长，体内雌激素水平的降低，皮脂分泌减少，皮肤保存水分的能力会下降，从而使皮肤变得越来越干。外界气候的变化，空气质量变差，会导致皮脂腺和汗腺分泌异常，皮肤的表面就变得更粗糙，抵抗力也会减弱，时间长了，就可能习惯性干燥。此外，睡眠不足、疲劳、过度减肥及偏食，会使身体受到相当大的伤害，血液循环也会变差，当健康失去平衡时，肌肤就会没有活力，容易产生干燥及粗糙的现象。因此，如何护理好皮肤，恢复皮肤的润泽弹性，是本领域的热点。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种改善皮肤的混合物(增液能量元)的制备工艺及其应用。在本发明的第一方面，提供一种混合物，所述的混合物包括以下组分：在一个优选例中，所述的混合物包括以下组分：在另一优选例中，所述的石斛为金钗石斛。在本发明的另一方面，提供一种用于改善皮肤的组合物，该组合物含有水提取物，该水提取物由前面所述的混合物经由水提取获得。在一个优选例中，所述水提取物的制备方法为：对所述混合物的组分进行炮制，粉碎经炮制的组分，混匀，在70～90℃提取2～6小时；冷却，过滤，收集滤液；更佳地，还进行真空精滤，条件为：过滤纸板平均孔径为1.0±0.2μm(较佳地1.0±0.1μm)，真空度为-0.095±0.02mpa(较佳地-0.095±0.01mpa)。在另一优选例中，所述的组合物还包括：化妆品学上、化学上或生物学上可接受的载体；较佳地，所述组合物中水提取物占组合物总重量的1～99％(如2％，3％，5％，10％，15％，20％，30％，50％，60％，80％，85％，90％，95％，98％)。在另一优选例中，所述的组合物的剂型包括(但不限于)：凝胶剂、乳剂、溶液、气雾剂、粉末剂、颗粒剂、胶囊剂、或悬浮液。在本发明的另一方面，提供所述的混合物的用途，用于制备改善皮肤的组合物，较佳地，所述的改善皮肤包括：润泽皮肤、减少肌肤鳞屑；或用于制备提高角质形成细胞水通道蛋白aqp3的表达的组合物；或用于制备提高角质形成细胞丝聚蛋白flg的表达的组合物；或用于制备提高紧密连接蛋白cldn-1的表达的组合物；或用于制备有效清除abts自由基，具有抗氧化活性的组合物。在本发明的另一方面，提供所述的用于改善皮肤的组合物的制备方法，所述方法包括：(1)提供以下组分：(2)炮制、粉碎(1)的组分，混匀，进行水提取；较佳地，在70～90℃提取2～6小时；冷却，过滤，收集滤液。在一个优选例中，所述方法还包括：进行真空精滤，条件为：过滤纸板平均孔径为1.0±0.2μm，较佳地1.0±0.1μm；真空度为-0.095±0.02mpa，较佳地-0.095±0.01mpa。在另一优选例中，所述的石斛为金钗石斛。在本发明的另一方面，提供所述的混合物的用途，一种试剂盒(包括：包装盒、包装袋、化妆品盒)，所述的试剂盒中包括以下组分，其提取物，或含有其提取物的组合物：在一个优选例中，所述的试剂盒中包括以下组分或其提取物：在另一优选例中，所述的石斛为金钗石斛。在另一优选例中，所述的含有其提取物的组合物为前面任一所述的组合物。在另一优选例中，所述的试剂盒中，各组分分别被独立包装，或被粉碎混合于容器中，或以提取物的形式存在于容器中。本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。附图说明图1、增液能量元可提高角质形成细胞中水通道蛋白aqp3的表达。图2、增液能量元可有效提高角质形成细胞丝聚蛋白flgmrna的表达。*表示采用dunnett-t检验分析，样品组与空白对照组相比具有显著差异，即p＜0.05。图3、增液能量元可有效提高角质形成细胞紧密连接蛋白cldn-1mrna的表达。*表示采用dunnett-t检验分析，样品组与空白对照组相比具有显著差异，即p＜0.05。图4、增液能量元可即时抚平肌肤因干燥引起的鳞屑。图5、增液能量元可有效清除abts自由基，发挥抗氧化活性。具体实施方式本发明人经过深入的研究，揭示了一种对于改善皮肤有效的混合物或药材组合，其主要由石斛、芦荟、苦参、土茯苓、紫松果菊、燕麦、麦冬、银耳组成，将其经合适的制备方法制备可获得用于改善皮肤的组合物，本发明人也将之称为“增液能量元”。该组合物对于皮肤的改善作用非常理想，且原材料成本低廉、易于获得，制备方法简单。如本文所用，所述的“增液能量元”与“本发明的组合物”可替换使用。如本文所用，“改善皮肤”包括：缓解皮肤干燥症状、润泽肌肤、促进皮肤平滑、减少皮肤鳞屑、提高角质形成细胞的活力等。如本文所用，所述的“包括”或“含有”包括了“包含”、“主要由……构成”、“基本上由……构成”、和“由……构成”；“主要由……构成”、“基本上由……构成”和“由……构成”属于“含有”、“具有”或“包括”的下位概念。如本文所用，术语“有效量”是指可对人和/或动物产生功能或活性的且可被人和/或动物所接受的量。如本文所用，术语“化妆品学上、化学上或生物学上可接受的”的成分是适用于人和/或动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)的，即有合理的效益/风险比的物质。如本文所用，术语“化妆品学上、化学上或生物学上可接受的载体”包括各种赋形剂、增稠剂或稀释剂。该术语指这样一些载体：它们本身并不是必要的活性成分，且施用后没有过分的毒性。合适的载体是本领域普通技术人员所熟知的。在该载体可含有液体，如水、盐水、甘油和乙醇。另外，这些载体中还可能存在辅助性的物质，如填充剂、润滑剂、助流剂、润湿剂或乳化剂、矫味剂、ph缓冲物质等。如本文所用，“重量份”或“重量份数”可互换使用，所述的重量份可以是任何一个固定的以毫克、克数或千克数表示重量(如1mg、1g、2g、5g、或1kg等)。例如，一个由1重量份组分a和9重量份组分b构成的组合物，可以是1克组分a+9克组分b，也可以是10克组分a+90克组分b等构成的组合物。在所述组合物，某一组分的百分比含量＝(该组分的重量份数/所有组分的重量份数之和)×100％。因此，由1重量份组分a和9重量份组分b构成的组合物中，组分a的含量为10％，组分b为90％。本发明中，术语“混合物”含有石斛、芦荟、苦参、土茯苓、紫松果菊、燕麦、麦冬、银耳。所述的石斛较佳地为金钗石斛。所述的芦荟较佳地为库拉索芦荟。本发明中，术语“组合物”包括但不限于：化妆品组合物、护肤品组合物、药物组合物，只要它们含有石斛、芦荟、苦参、土茯苓、紫松果菊、燕麦、麦冬、银耳的提取物，较佳地为水提取物。作为本发明的优选方式，用于配制本发明的混合物的各原料的用量如表1所示。表1、混合物中组分的用量含量较佳含量石斛2～4重量份2.5～3.5重量份芦荟1～3重量份1.5～2.5重量份苦参1～3重量份1.5～2.5重量份土茯苓1～3重量份1.5～2.5重量份紫松果菊0.5～2.5重量份1～2重量份燕麦0.5～2.5重量份1～2重量份麦冬0.5～2.5重量份1～2重量份银耳0.5～2.5重量份1～2重量份所述的各原料可在炮制、粉碎、混合后，利用适当的方法提取有效成分，制成本发明的提取物；此外，也可分别提取(如分别采用相同的或不同的提取或加工方法)有效成分后，合并制成本发明的组合物。作为本发明的优选方式，所述提取物为水提取物；较佳地，所述水提取物的制备方法为：粉碎各组分，混匀，在70～90℃提取2～6小时；冷却，过滤，收集滤液；更佳地，还进行真空精滤。应理解，与该方法有不同的一些替代方法也应被包含在本发明中。本发明的组合物，采集了石斛、芦荟、土茯苓、苦参、燕麦、紫松果菊、麦冬及银耳多种植物的天然成分，有效组合，达到了改善皮肤的效果，包括：缓解皮肤干燥症状、润泽肌肤、促进皮肤平滑、减少皮肤鳞屑、提高角质形成细胞的活力等。本发明的组合物还能提高角质形成细胞水通道蛋白aqp3的表达。aqp3是一种细胞膜上的跨膜转运蛋白，是人类皮肤中最主要的一种水通道蛋白亚型，它属于水-甘油通道蛋白亚家族。在皮肤的生理过程中，aqp3可以转运水、甘油到达表皮，对表皮的屏障作用及保水作用有重要意义。在本发明的实施例中，采用免疫荧光法，评估增液能量元对角质形成细胞合成aqp3能力的影响。免疫荧光法是利用抗原和抗体结合的原理，对角质形成细胞aqp3进行荧光标记，生成的荧光强度与目标蛋白的合成量成正比，结果呈现本发明的组合物有效提高了aqp3的表达。本发明的组合物还能提高角质形成细胞丝聚蛋白flg(filaggrin)的表达。角质层中存在着天然保湿因子(naturalmoisturizingfactor，nmf)，具有吸水特性，能够有效吸收并锁住水分，配合防护角质细胞结构，强化锁水屏障。天然保湿因子nmf是由表皮中丝聚蛋白(filaggrin)分解形成。filaggrin存在于角质层内，其前体丝聚蛋白原(profilaggrin)存在于颗粒层，当细胞从颗粒层到达角质层后，profilaggrin被caspase-14迅速去磷酸化成为filaggrin，进而水解成各种天然保湿因子。由此可见，filaggrin对角质层中天然保湿因子的形成具有关键作用。本发明的组合物还能提高紧密连接蛋白cldn-1的表达。颗粒层中的紧密连接蛋白具有维持屏障的作用，其中水闸蛋白(claudin-1)是其重要组成，像铆钉一样将细胞紧密连接。研究表明，水闸蛋白的表达下降，会导致肌肤水分散失增加。通过提高丝聚蛋白和水闸蛋白的表达，可起到修复肌肤屏障功能，减少水分散失的功效。对于本发明所述的组合物，可以被制备成多种任何适用于外用的剂型例如，所述的剂型可选自：凝胶剂、乳剂、溶液、气雾剂、粉末剂、颗粒剂、胶囊剂、或悬浮液。本发明的组合物中可以加入制备不同剂型时所需要的各种常规载体或辅料，如填充剂、矫味剂、抗氧化剂、或包衣材料等。基于本发明人的新发现，还提供了一种组合，该组合包括石斛2～4重量份；芦荟1～3重量份；苦参1～3重量份；土茯苓1～3重量份；紫松果菊0.5～2.5重量份；燕麦0.5～2.5重量份；麦冬0.5～2.5重量份；和银耳0.5～2.5重量份。作为本发明的优选方式，所述组合中，各组分被独立地包装于袋、盒或其它各种容器中。所述的组合可以是一种试剂盒、包装盒、包装袋、化妆品盒等。本发明的试剂盒、包装盒、包装袋或化妆品盒中，也可直接装入上述各原料的提取物，以便于使用。本发明的试剂盒、包装盒、包装袋或化妆品盒中，也可直接装入本发明的组合物。所述的试剂盒、包装盒、包装袋或化妆品盒中，还可包括说明书，其中说明了各组分的使用方法，例如包括提取方法，提取时间等。下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如j.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例1、增液能量元的配制用于制备增液能量元的原材料组成比例如表2。表2增液能量元的制备方法如下：(1)根据表2的配方获取原料药，将各原料药粉碎，过6目筛，按上述重量份配比称取，混匀。(2)加水提取：原料药与水的质量比为1:40，80℃提取4小时得提取液。(3)将步骤(2)得到的提取液冷却至60℃以下，20目滤布过滤，收集滤液。(4)将步骤(3)得到的滤液进行真空精滤，收集滤液，即得。真空抽滤条件可以为：在布氏漏斗里铺过滤纸板，纸板平均孔径为1.0μm，真空度为-0.095mpa。根据配方1～3，所获得的滤液即为增液能量元1～3。实施例2、增液能量元对于角质形成细胞水通道蛋白aqp3表达的影响本实施例中，首先采用以表1中的配方1制备的增液能量元1进行功效的评估。(1)基于角质形成细胞的mtt检测样品设置8个浓度梯度，每个浓度梯度设置8个复孔，实验设置溶剂对照孔和调零孔(空白对照)，采用mtt细胞活性检测方法，筛选样品在角质形成细胞中的最大安全剂量。细胞接种：取对数生长期细胞消化后接种至96孔板。样品配制：配制不同给药剂量的样品：2000ppm、1000ppm、500ppm、250ppm、125ppm、62.5ppm、31.3ppm、15.6ppm。给药：待细胞铺板率达到40％时，开始给药。培养：给药完成后，将培养板放置在37℃、5％的co2培养箱中培养。检测：细胞孵育培养24h后，弃掉上清，加入事先配好的mtt，37℃避光孵育。4h后弃掉上清，每孔加150μl二甲基亚砜，酶标仪490nm读取od值。计算公式如下：不同给药剂量下，测试得出500ppm的给药剂量较为理想。(2)基于角质形成细胞的免疫荧光检测接种：以3×104个/孔的细胞接种密度接种至含有盖玻片的24孔板中，37℃，5％co2培养箱孵育过夜。配液：配制受试物浓度500ppm(根据mtt检测试验所得)。给药：待24孔板中细胞铺板率达到30％时，进行给药。收样：孵育培养结束后，弃掉培养液pbs清洗3次，4％多聚甲醛室温固定30min，4℃冰箱保存。免疫荧光检测：对细胞进行通透、封闭等操作后，抗aqp3抗体按照1:500的工作浓度进行孵育，进行免疫荧光染色。拍照：激光共聚焦显微镜40倍镜下拍照。实验结果：试验采用荧光显微镜拍照，其中绿色荧光部分显示的是aqp3蛋白表达情况，试验结果见图1，图中可见阴性对照基本上观察不到绿色荧光部分，而增液能量元则存在显著的绿色荧光分布。结果表明，增液能量元可以有效地提高角质形成细胞水通道蛋白aqp3的表达。采用同样的方法，不同处在于以增液能量元3替换增液能量元1，结果，实验组增液能量元处理后，荧光显微可见明显的绿色荧光分布，可以有效地提高角质形成细胞水通道蛋白aqp3的表达。实施例3、增液能量元对丝聚蛋白flg及紧密连接蛋白cldn-1mrna表达的影响本实施例中，采用以表1中的配方1制备的增液能量元1进行功效的评估。通过构建角质形成细胞模型，采用qrt-pcr方法分析增液能量元对角质形成细胞丝聚蛋白flg及紧密连接蛋白cldn-1mrna表达的影响。(1)基于角质形成细胞的mtt检测样品设置8个浓度梯度，每个浓度梯度设置8个复孔，实验设置溶剂对照孔和调零孔，采用mtt细胞活性检测方法，筛选样品在角质形成细胞中的最大安全剂量。细胞接种：取对数生长期细胞消化后接种至96孔板。样品配制：配制不同给药剂量的样品：2000ppm、1000ppm、500ppm、250ppm、125ppm、62.5ppm、31.3ppm、15.6ppm。给药：待细胞铺板率达到40％时，开始给药。培养：给药完成后，将培养板放置在37℃、5％的co2培养箱中培养。检测：细胞孵育培养24h后，弃掉上清，加入事先配好的mtt，37℃避光孵育。4h后弃掉上清，每孔加150μl二甲基亚砜，酶标仪490nm读取od值。计算公式：不同给药剂量下，测试得出500ppm的给药剂量较为理想。(2)基于角质形成细胞的荧光定量pcr检测接种：以1.8×105个/孔的细胞接种密度接种6孔板中，37℃，5％co2培养箱孵育过夜。配液：配制受试物浓度500ppm(根据mtt检测试验所得)。给药：待6孔板中细胞铺板率达到40％时，进行给药。培养：给药完成后，将培养板放置在37℃、5％的co2培养箱中培养。收样：孵育培养结束后，弃掉培养液每孔加入1mltrizol，吹打裂解细胞后，收样。pcr检测：提取rna，反转录成cdna后，进行荧光定量pcr检测。pcr引物序列为：针对角质形成细胞丝聚蛋白flgmrna：f端：ggaatttcggcaaatcctga(seqidno:1)；r端：tgcttgagccaacttgaatacca(seqidno:2)；针对紧密连接蛋白cldn-1mrna：f端：gcatgaagtgtatgaagtgcttgga(seqidno:3)；r端：ccataccatgctgtggcaactaa(seqidno:4)。结果分析：采用2-△△ct方法进行结果计算，t-test(双尾等方差，方差齐性通过f检验已验证)方法进行统计分析。实验结果：构建以上角质形成细胞模型，采用qrt-pcr方法分析增液能量元对角质形成细胞丝聚蛋白flg及紧密连接蛋白cldn-1mrna表达的影响。结果如图2～图3，表明增液能量元可有效提高角质形成细胞丝聚蛋白flg及紧密连接蛋白cldn-1mrna的表达。实施例4、增液能量元对于皮肤的影响vc98，全称是皮肤显微表面活性分析系统，德国ck公司生产。它是依据光学原理设计的，用测试探头拍摄在uva光源照射下皮肤表面的纹理图像，将黑白视频信号输入到测试系统的数字化仪中进行处理，再输入到计算机中，用专用的活性皮肤表面评价软件对图像进行分析，就可得出与皮肤皱纹有关的相关参数值。同时，它也可用于对皮肤角质脱落细胞和检查分析。首先，对增液能量元进行功效的评估。实验分为两组，实验组为添加5％(质量比)增液能量元1的啫喱；对照组为空白啫喱基质。该啫喱基质为常规基质。测试环境温湿度：温度20～22℃，相对湿度40～60％。将啫喱涂于受试者小腿外侧。使用皮肤显微表面活性分析系统(vc98，德国ck公司生产)作为皮肤测试仪，测试受试者使用实验组与对照组啫喱后肌肤鳞屑(角质脱落)情况。实验结果：使用皮肤测试仪(vc98)，评估受试者使用增液能量元前后肌肤鳞屑的改善情况，图像中白色代表剥落的角质，试验结果见图4。结果表明，实验组测试区域涂抹含5％(质量比)增液能量元的啫喱4h后，肌肤的鳞屑状态相对于涂抹前有显著改善(图4上)；而空白组测试区域在涂抹空白啫喱基质4h后，肌肤因啫喱基质中的水分蒸发起屑状态相对于涂抹前更加严重(图4下)。说明增液能量元可即时抚平肌肤因干燥引起的鳞屑，润泽肌肤。采用同样的方法，不同处在于以增液能量元2替换增液能量元1，结果显示，实验组测试区域涂抹含8％(质量比)增液能量元的啫喱4h后，肌肤的鳞屑状态相对于涂抹前也呈现显著改善。实施例5、增液能量元清除abts自由基，抗氧化的作用实验原理：abts法测定总抗氧化能力的原理是：abts在适当的氧化剂作用下氧化成绿色的abts·+，在抗氧化物存在时abts·+的产生会被抑制，在732nm或405nm测定abts的吸光度即可测定并计算出样品的总抗氧化能力。实验方法：1)准备评价试样0.01ml，在室温下孵育10分钟。接着，添加abts的乙醇溶液(0.1mm)1ml，在室温下孵育20分钟后，利用分光光度计测定732nm下的吸光度a；2)准备50％乙醇(体积分数，下同)0.01ml，在室温下孵育10分钟。接着，添加abts的50％乙醇溶液(0.1mm)1ml，在室温下孵育20分钟后，利用分光光度计测定732nm下的吸光度b；3)准备评价试样0.01ml，在室温下孵育10分钟。接着，添加50％乙醇1ml，在室温下孵育20分钟后，利用分光光度计测定732nm下的吸光度c。abts自由基清除率计算公式如下：式中：a为试样溶液与abts溶液混合后od值；b为50％乙醇与abts溶液混合后od值；c为50％乙醇与试样溶液混合后od值。实验结果：结果如图5，表明增液能量元具有清除abts自由基活性，在一定的浓度范围内，随着受试浓度的增加，对abts自由基的清除率越大。该结果说明，增液能量元在生化水平具有显著的抗氧化活性。在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。当前第1页12