本发明属于黄精提取方法技术领域，具体涉及一种黄精非多糖成分的提取分离方法及应用。
背景技术
黄精(polygonatumsibiricum)，又名：鸡头黄精、黄鸡菜、笔管菜、爪子参、老虎姜、鸡爪参。为黄精属植物，根茎横走，圆柱状，结节膨大，叶轮生，无柄。黄精性味甘甜，食用爽口，是中国传统的药食同源性中草药，其肉质根状茎肥厚，含有大量淀粉、糖分、脂肪、蛋白质、胡萝卜素、维生素和多种其他营养成分，生食、炖服既能充饥，又有健身之用，可令人气力倍增、肌肉充盈、骨髓坚强，对身体十分有益。黄精主要成分黄精多糖药用价值极高，具有抗肿瘤、抗氧化、免疫调节、抑菌抗炎、降糖降脂等活性。黄精多糖的含量是鉴定黄精质量的一项十分重要的指标。在保健食品，治疗性药品，日常护肤品等方面的应用的巨大发展潜力有着十分广阔的市场前景；但是目前中国药典对黄精的质量控制指标仅有黄精多糖含量一个指标，特征成分不明确，不够系统，不能全面鉴别黄精品质，阐明其物质基础。目前对黄精活性成分的提取方法有很多，主要是采用醇沉淀法。
如专利申请号cn201410306492.7中公开了黄精提取物及其制备方法与应用，所述黄精提取物是由下述方法制备得到的：黄精乙醇热提后，将提取液减压回流得到总浸膏；加蒸馏水混悬，依次用等体积石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，减压回收溶剂，得乙酸乙酯萃取部位；所述黄精提取物具有ages抑制作用，可进一步将其应用于抗糖尿病及其并发症药物的制备，具有重要的临床应用价值。此申请中黄精用乙醇多次提取，每次加入乙醇的浓度都是恒定的，并且萃取过程中萃取剂的加入顺序是石油醚、乙酸乙酯和正丁醇，萃取剂极性由小到大，采用此提取方法会使得黄精中的有效成分提取率较低，并且各成分之间分离不彻底，尤其是多糖成分和非多糖成分，限制了黄精的应用。
技术实现要素：
本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种黄精非多糖成分的提取分离方法及应用。
本发明提供了一种黄精非多糖成分的提取分离方法，其特征在于，步骤如下：
1)将干燥的黄精块茎切片，加入体积浓度95％的乙醇水溶液，进行第一次回流提取，第一次过滤得到的滤渣中加入体积浓度80％的乙醇水溶液，进行第二次回流提取，过滤，合并两次提取的滤液，浓缩得到黄精粗浸膏；
2)将黄精粗浸膏加蒸馏水分散，然后依次用石油醚、正丁醇、乙酸乙酯和二氯甲烷萃取，分别得到石油醚相、正丁醇相、乙酸乙酯相、二氯甲烷相，将二氯甲烷相和乙酸乙酯相合并得到二氯甲烷/乙酸乙酯相，对其中的有机溶剂进行回收，得到3种有机相的浓缩浸膏，60℃下干燥，即得黄精非多糖成分。
优选的，所述步骤1)中第一次提取加入体积浓度95％的乙醇水溶液和黄精块茎的质量比为5-6:1。
优选的，所述步骤1)中第一次回流提取的时间为2-3h。
优选的，所述步骤1)中第二次提取加入体积浓度80％的乙醇水溶液和第一次过滤的滤渣的质量比为4-5:1。
优选的，所述步骤1)中第二次回流提取的时间为1-2h。
优选的，所述步骤1)中浓缩的条件为：温度为50-60℃，真空度为-0.09mpa，浓缩液比重为1-1.1。
优选的，所述步骤1)中两次回流提取的温度为80-90℃。
本发明还提供了依据上述提取分离方法得到的黄精非多糖成分在抗肿瘤方面的应用。
本发明所述步骤2)中得到的3种有机相，即石油醚相、正丁醇相、乙酸乙酯/二氯甲烷相，对其中的有机溶剂进行回收，浓缩液60℃干燥，可用于制备抗肿瘤药品或保健品。
目前常用于黄精活性成分的提取方法是醇提取法，利用黄精活性成分易于溶解在乙醇中，将其提取出来。黄精用乙醇多次提取，每次加入乙醇的浓度都是恒定的，得到的提取液加入萃取剂萃取，萃取剂的加入顺序是根据极性由小到大(专利申请号cn201410306492.7)，采用此提取方法会使得黄精中的有效成分提取率较低，并且各成分之间分离不彻底，尤其是多糖成分和非多糖成分，限制了黄精的应用。
本发明将黄精块茎分别用体积浓度95％的乙醇水溶液和体积浓度80％的乙醇水溶液循环进行两次回流提取，本发明人通过研究发现，控制两次回流提取加入乙醇的浓度不一样，并且只有两次加入乙醇的体积浓度分别为95％和80％，才能够最大程度的将黄精中的非多糖成分提取出来，实现黄精的有效利用。另外，本发明将提取得到的提取液加入萃取剂进行萃取，首先加入石油醚对黄精成分进行脱脂处理，然后再依次用正丁醇、乙酸乙酯和二氯甲烷进一步萃取，得到四个有机相和水相；本发明打破了目前常规萃取剂的加入顺序(即按极性由小到大)，发现按照本发明萃取剂的加入顺序，结合回流提取时乙醇的浓度，能够将黄精中的有效成分充分的分离，尤其是非多糖成分，实现了黄精在多种药物方面的高效利用，扩大了其应用范围。
本发明最终萃取得到的石油醚相、正丁醇相、乙酸乙酯/二氯甲烷相和水相，进行抗肿瘤研究，发现乙酸乙酯/二氯甲烷相的抗肿瘤效果最好。
将乙酸乙酯/二氯甲烷相分别经过反复的柱色谱、制备型高效液相色谱和葡萄糖凝胶色谱进行分离纯化，最后分离得到10个化合物，包括4个黄酮、2个生物碱、1个甾体皂苷、1个胡萝卜苷和2个脂肪酸。
本发明的有益效果是：
1、本发明将黄精块茎分别用体积浓度95％的乙醇水溶液和体积浓度80％的乙醇水溶液循环进行两次回流提取，本发明人通过研究发现，控制两次回流提取加入乙醇的浓度不一样，并且只有两次加入乙醇的浓度分别为95％和80％，才能够最大程度的将黄精中的非多糖成分提取出来，实现黄精的有效利用。
2、本发明打破了目前常规萃取剂的加入顺序(即按极性由小到大)，发现按照本发明萃取剂的加入顺序，结合回流提取时乙醇的浓度，能够将黄精中的有效成分充分的分离，尤其是多糖成分和非多糖成分，实现了黄精在多种药物方面的高效利用，扩大了其应用范围。
3、本发明其制备方法简单、易操作，黄精非多糖成分的得率高，充分利用了黄精资源，提高了原材料的使用价值，而且本技术在提取非多糖的同时，并不影响多糖的提取，回收率高，低污染(所有有机溶剂均可重新回收)。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本发明进一步详细说明。
实施例1
1)将干燥的黄精块茎切片，加入体积浓度95％的乙醇水溶液，乙醇水溶液和黄精块茎的质量比为5:1，在80℃下进行第一次回流提取，2h后，第一次过滤得到的滤渣中加入体积浓度80％的乙醇水溶液，80％的乙醇水溶液和第一次过滤的滤渣的质量比为5:1，在80℃下进行第二次回流提取，1h后过滤，合并两次提取的滤液，浓缩得到黄精粗浸膏，浓缩的条件为：温度为50℃，真空度为-0.09mpa，浓缩液比重为1；
2)将黄精粗浸膏加2倍质量的蒸馏水分散，然后依次用石油醚、正丁醇、乙酸乙酯和二氯甲烷萃取，萃取完成后得到石油醚相、正丁醇相、乙酸乙酯相、二氯甲烷相和水相，将二氯甲烷相和乙酸乙酯相合并得到二氯甲烷/乙酸乙酯相，最终黄精中的非多糖成分被提取到3种有机相中，即石油醚相、正丁醇相、乙酸乙酯/二氯甲烷相，对其中的有机溶剂进行回收，得到3种有机相的浓缩浸膏，浓缩浸膏在60℃下干燥，即得黄精非多糖成分，最终黄精非多糖的提取率为90.54％。
实施例2
1)将干燥的黄精块茎切片，加入体积浓度95％的乙醇水溶液，95％的乙醇水溶液和黄精块茎的质量比为6:1，在88℃下进行第一次回流提取，3h后，第一次过滤得到的滤渣中加入体积浓度80％的乙醇水溶液，80％的乙醇水溶液和第一次过滤的滤渣的质量比为5:1，在88℃下进行第二次回流提取，2h后过滤，合并两次提取的滤液，浓缩得到黄精粗浸膏，浓缩的条件为：温度为55℃，真空度为-0.09mpa，浓缩液比重为1.06；
2)将黄精粗浸膏加2倍质量的蒸馏水分散，然后依次用石油醚、正丁醇、乙酸乙酯和二氯甲烷萃取，萃取完成后得到石油醚相、正丁醇相、乙酸乙酯相、二氯甲烷相和水相，将二氯甲烷相和乙酸乙酯相合并得到二氯甲烷/乙酸乙酯相，最终黄精中的非多糖成分被提取到3种有机相中，即石油醚相、正丁醇相、乙酸乙酯/二氯甲烷相，对其中的有机溶剂进行回收，得到3种有机相的浓缩浸膏，浓缩浸膏在60℃下干燥，即得黄精非多糖成分，最终黄精非多糖的提取率为93.68％。
实施例3
1)将干燥的黄精块茎切片，加入体积浓度95％的乙醇水溶液，乙醇水溶液和黄精块茎的质量比为5.5:1，在90℃下进行第一次回流提取，2.5h后，第一次过滤得到的滤渣中加入体积浓度80％的乙醇水溶液，80％的乙醇水溶液和第一次过滤的滤渣的质量比为4:1，在90℃下进行第二次回流提取，1.5h后过滤，合并两次提取的滤液，浓缩得到黄精粗浸膏，浓缩的条件为：温度为60℃，真空度为-0.09mpa，浓缩液比重为1.1；
2)将黄精粗浸膏加2倍质量的蒸馏水分散，然后依次用石油醚、正丁醇、乙酸乙酯和二氯甲烷萃取，萃取完成后得到石油醚相、正丁醇相、乙酸乙酯相、二氯甲烷相和水相，将二氯甲烷相和乙酸乙酯相合并得到二氯甲烷/乙酸乙酯相，最终黄精中的非多糖成分被提取到3种有机相中，即石油醚相、正丁醇相、乙酸乙酯/二氯甲烷相，对其中的有机溶剂进行回收，得到3种有机相的浓缩浸膏，浓缩浸膏在60℃下干燥，即得黄精非多糖成分，最终黄精非多糖的提取率为91.22％。
对比例1
1)将干燥的黄精块茎切片，加入体积浓度80％的乙醇水溶液，80％的乙醇水溶液和黄精块茎的质量比为6:1，在88℃下进行第一次回流提取，3h后，第一次过滤得到的滤渣中加入体积浓度80％的乙醇水溶液，80％的乙醇水溶液和第一次过滤的滤渣的质量比为5:1，在88℃下进行第二次回流提取，2h后过滤，合并两次提取的滤液，浓缩得到黄精粗浸膏，浓缩的条件为：温度为55℃，真空度为-0.09mpa，浓缩液比重为1.06；
2)将黄精粗浸膏加2倍质量的蒸馏水分散，然后依次用石油醚、正丁醇、乙酸乙酯和二氯甲烷萃取，萃取完成后得到石油醚相、正丁醇相、乙酸乙酯相、二氯甲烷相和水相，将二氯甲烷相和乙酸乙酯相合并得到二氯甲烷/乙酸乙酯相，最终黄精中的非多糖成分被提取到3种有机相中，即石油醚相、正丁醇相、乙酸乙酯/二氯甲烷相，对其中的有机溶剂进行回收，得到3种有机相的浓缩浸膏，浓缩浸膏在60℃下干燥，即得黄精非多糖成分，最终黄精非多糖的提取率为78.31％。
对比例2
1)将干燥的黄精块茎切片，加入体积浓度95％的乙醇水溶液，95％的乙醇水溶液和黄精块茎的质量比为6:1，在88℃下进行第一次回流提取，3h后，第一次过滤得到的滤渣中加入体积浓度80％的乙醇水溶液，80％的乙醇水溶液和第一次过滤的滤渣的质量比为5:1，在88℃下进行第二次回流提取，2h后过滤，合并两次提取的滤液，浓缩得到黄精粗浸膏，浓缩的条件为：温度为55℃，真空度为-0.09mpa，浓缩液比重为1.06；
2)将黄精粗浸膏加2倍质量的蒸馏水分散，然后依次用石油醚、正丁醇、乙酸乙酯和二氯甲烷萃取，萃取完成后得到石油醚相、二氯甲烷相、乙酸乙酯相、正丁醇相和水相，将二氯甲烷相和乙酸乙酯相合并得到二氯甲烷/乙酸乙酯相，最终黄精中的非多糖成分被提取到3种有机相中，即石油醚相、乙酸乙酯/二氯甲烷相、正丁醇相，对其中的有机溶剂进行回收，得到3种有机相的浓缩浸膏，浓缩浸膏在60℃下干燥，即得黄精非多糖成分，最终黄精非多糖的提取率为85.41％。
本发明实施例1-3中黄精非多糖的提取率均达到了90％以上，高于对比例1-2，说明采用本发明的提取方法，能够将黄精中的非多糖成分充分分离出来，实现了黄精在多种药物方面的高效利用，扩大了其应用范围。
黄精各萃取相的抗肿瘤活性研究
1、体外抗肿瘤实验
将实施例2中得到的石油醚相、二氯甲烷/乙酸乙酯相、正丁醇相和水相，回收试剂，分别60℃干燥，干燥样品进行体外抗肿瘤实验。
1.1构建细胞培养及相关细胞库平台
表1实验所用细胞系
1.2实验部分
1.2.1mtt法分析不同萃取相对肿瘤细胞增殖的影响
实验原理：活细胞的线粒体内膜上存在琥珀酸脱氢酶，该酶可将黄绿色的噻唑蓝(简称为mtt，为一种接受氢离子的染料)降解成蓝紫色的甲臜，活细胞越多，生成的蓝紫色的甲臜就越多，而死细胞因其线粒体内膜上的琥珀酸脱氢酶活性消失，无此功能。使用二甲基亚砜溶解蓝紫色的甲臜，并用酶标仪在490nm波长处测定吸光度值，可以定量反应出活细胞数量。
1.2.2不同萃取相抑制hepg-2及mcf-7细胞增殖实验
(1)实验分组：实验分为水相，正丁醇相，二氯甲烷/乙酸乙酯相，石油醚相和对照组。以环磷酰胺为阳性对照组；以上每组均设3个复孔。
(2)细胞培养：取对数生长期的hepg-2及mcf-7细胞，吸出原培养液，无菌pbs洗涤两次后加入适量的胰酶进行消化，并离心收集细胞，制成细胞悬液；对细胞进行计数，并稀释细胞浓度为7x104/ml，准备无菌的96孔细胞培养板并进行相应的标记，然后每孔加入100μl细胞悬液，置37℃，5％co2培养箱内培养。待细胞贴壁生长至80％左右时，实验组每孔加入相应的药物，置37℃，5％co2培养箱内培养48h。吸出原培养液，无菌pbs洗涤两次后每孔加入含0.5mg/mlmtt的培养基继续培养4h。4h后小心吸出孔内培养基，每孔加入150μl二甲基亚砜，置摇床上匀速摇10min，使结晶充分溶解。再用酶标仪在490nm波长处测定各组吸光度值，计算细胞增殖抑制率。
1.3结果与分析
1.3.1mtt实验检测结果
运用不同萃取相作用于hepg-2及mcf-7细胞24h后，酶标仪测定各个孔吸光度，并计算细胞增殖抑制率，结果见表2，其中ic50为半抑制率。
表2不同萃取相对肿瘤细胞系的抑制作用
从表2中的数据可知，本发明的不同萃取相对乳腺癌和肝癌多种肿瘤细胞均具有较强的抑制作用，表现出非常好的抗肿瘤功效，其中二氯甲烷/乙酸乙酯相的抗肿瘤效果最好，要优于水相，取得了意想不到的技术效果。
2、体内抗肿瘤实验
将实施例2中得到的石油醚相、二氯甲烷/乙酸乙酯相、正丁醇相和水相，回收试剂，分别60℃干燥，干燥样品分别进行体内抗肿瘤实验。
2.1实验原料
实验分为水相，正丁醇相，二氯甲烷/乙酸乙酯相，石油醚相和对照组，以环磷酰胺为阳性对照组。
2.2实验方法
实验动物：取昆明种小鼠，体重18～22g，雌雄兼用。取接种10天的肺癌lewis瘤块，制成lewis细胞悬液(细胞数1×107/ml)，除健康对照组外，其余小鼠上肢右腋皮下接种肺癌lewis细胞悬液0.2ml，接种24小时后，随机分为为生理盐水组20ml/kg，石油醚相、二氯甲烷/乙酸乙酯相、正丁醇相和水相分别的干燥样品实验组3g/kg，环磷酰胺(ctx)对照组60mg/kg腹腔注射。各组均连续给药14天，与第15天处死全部小鼠，取瘤块称重，计算抑瘤率。具体实验结果如表3所示。
表3不同萃取相对小鼠肺癌lewis的抑制作用
注：与生理盐水组比较，*p<0.05；**p<0.01。
由表3体内抗肿瘤的数据可知，本发明得到的石油醚相、二氯甲烷/乙酸乙酯相、正丁醇相和水相均能有效的抑制小鼠lewis肺癌的生长，其中二氯甲烷/乙酸乙酯相的抗肿瘤效果最好，要优于水相，取得了意想不到的技术效果。