一种治疗性蛋白纳米颗粒的高通量制备方法与流程

本发明属于生物医药领域，更具体地，涉及一种蛋白纳米颗粒的高通量制备方法。

背景技术：

生物技术药物主要包括多肽类药物、蛋白质类药物和核酸类药物。但目前为止，生物药物多为蛋白多肽类，在已上市和开发的生物技术药物中，蛋白质类药物占了绝大多数，主要包括细胞因子药物和重组激素类药物等。目前，蛋白多肽类药物因为其高特异性和优秀的疗效在肿瘤、自身免疫缺陷疾病及心血管病等疾病中有着不可替代的作用。

但是，与常规药物相比，蛋白多肽类药物因为分子量大，稳定性差，易变性，在体内的半衰期短，难以穿透肠道黏膜，限制了其广泛应用。近些年来，脂质体、胶束和水凝胶等载体均有被开发用于蛋白多肽类药物的体内输送，但是这些输送体系往往受限于其低的药物包封率和复杂的制备过程，难以规模化生产和临床转化。

快速纳米沉淀是一种可以通过动力学控制分子聚集过程制备药物纳米颗粒的微流控技术。并且该方法可连续大规模化生产，适合工业化生产。它的主要机制是依靠高湍流混合器装置（例如，同轴湍流混合器，四通道涡流混合器等）实现溶剂（含药物）与非溶剂（含稳定剂）的快速交换，通过调控溶质成核与增长速率控制纳米颗粒的粒径及分散性。并且已经有药物纳米颗粒用该方法得以大规模生产制备。但是快速纳米沉淀方法的一个局限性就是其只适用于疏水性的小分子药物，而不适用于蛋白多肽类等生物技术药物。

技术实现要素：

本发明的目的在于针对现有技术中的缺陷和不足，提供一种蛋白纳米颗粒的高通量制备方法。本发明所述方法通过结合疏水离子对技术和快速纳米沉淀方法，先利用疏水离子对方法将亲水的蛋白药物转换成油溶性的蛋白-脂质复合物，然后再快速纳米沉淀方法制备成蛋白纳米颗粒，所述方法对于蛋白药物的作用效果无任何不良影响，可大规模制备得到载药量高，且粒径可控、分散窄、稳定性好、毒副作用小的蛋白纳米颗粒。

本发明的另一目的在于提供一种治疗性蛋白纳米颗粒的冻干制剂。

本发明的上述目的是通过以下方案予以实现的：

一种治疗性蛋白纳米颗粒的高通量制备方法，先利用疏水离子对方法将亲水的蛋白药物转换成蛋白-脂质复合物，然后将蛋白-脂质复合物采用与水互溶的有机溶剂稀释后再通过快速纳米沉淀方法制备得到蛋白纳米颗粒。

优选地，所述疏水离子对方法的过程包括：将蛋白的水溶液和与蛋白带相反电荷的脂质的二氯甲烷或三氯甲烷溶液等体积混合，其中蛋白和正电脂质的质量比为1:1～8，加入与水互溶的有机溶剂形成均相溶液，再加入与蛋白水溶液等体积的水离心、分层，所得下层有机相即为溶有蛋白-脂质复合物的溶液。在配置蛋白水溶液时，为了便于蛋白的溶解，可采用稀酸溶液溶解蛋白，然后用碱将溶液调制中性。

优选地，蛋白的水溶液和脂质溶液混合后，其中蛋白和脂质的质量比为1:4～8。在蛋白和脂质的质量比在比例范围内时，在萃取时，蛋白药物从水相中转移到有机相中的转移率很高，均超过了97%，即在制备过程中，蛋白药物的利用率更高。

优选地，所述与水互溶的有机溶剂为乙醇。

优选地，所述快速纳米沉淀方法的过程包括：将经过疏水离子对方法制得的蛋白-脂质复合物溶液用乙醇按照体积比为1:5～11稀释后和浓度为0.5～10mm的磷酸盐缓冲液按体积比1:3～9分别引入涡流混合器中的不同通道，其中有机相流速为1ml/min～10ml/min，通过高速湍流混合制备得到蛋白纳米颗粒溶液。

在快速纳米沉淀过程中，蛋白-脂质复合物的稀释比例、磷酸盐缓冲液中溶质的浓度，以及蛋白-脂质复合物的乙醇溶液和磷酸盐缓冲液的比例均会影响蛋白纳米颗粒的粒径大小，只有当上述3个条件或参数在上述范围内时，才能制备得到粒径大小合适、粒径均一度高的蛋白纳米颗粒。

优选地，磷酸盐缓冲液中溶质的浓度为0.5～1mm；在涡流混合器中中，有机溶液和水相的体积比分别为1:7，有机相流速为5ml/min。在此条件下时，所制备的蛋白纳米颗粒的重复性和均一性最佳，其粒径大小也更好，平均粒径为35nm。

优选地，所述蛋白纳米颗粒溶液和负电聚合物水溶液分别引入涡流混合器的不同通道，即可制备得到负电聚合物稳定涂覆的蛋白纳米颗粒；其中蛋白纳米颗粒溶液的流速为1ml/min～40ml/min，负电聚合物的流速为0.1mg/ml～0.5mg/ml。

优选地，所述蛋白药物为胰岛素、卵清蛋白或人血清蛋白。

更优选地，所述蛋白药物为胰岛素。

优选地，所述脂质为ddab或dotap。

优选地，所述负电聚合物包括但不限于透明质酸，海藻酸钠或聚谷氨酸。

本发明同时还保护一种包含上述方法制备的蛋白纳米颗粒的冻干制剂。

优选地，所述蛋白纳米颗粒溶液中加入冻干保护剂，经冷冻、干燥即可得到所述冻干制剂。

优选地，所述冻干保护剂为甘露醇、木糖醇、甘氨酸或山梨醇中的一种或多种。

更优选地，所述冻干保护剂为甘露醇和木糖醇的混合物。

优选地，所述甘露醇质量、木糖醇质量和蛋白纳米颗粒溶液体积的比例为0～10g:0～10g:100ml。

更优选地，所述甘露醇质量、木糖醇质量和蛋白纳米颗粒溶液体积的比例为0.5g:1g:100ml。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

与传统的蛋白纳米颗粒制备方法相比，本发明最大优势就是可连续大规模化生产，生产力可达1.2g/h，远高于传统的蛋白颗粒制备方法的生产能力。另外快速纳米沉淀方法可连续化生产，批次间的差异小，适用于工业化生产。

进一步地，本发明所制备的蛋白颗粒的表面包裹的透明质酸可赋予蛋白药物纳米颗粒可长期储存的稳定性和粘液穿透性。本发明所述方法制得的蛋白纳米颗粒在蛋白药物的体内输送方面具有较大的应用前景。

附图说明

图1为胰岛素和ddab之间的比例对胰岛素的相转移率的影响。

图2（a）游离胰岛素在水中和insulin-ddab在有机溶剂中的粒径图，（b）游离胰岛素和insulin-ddab疏水离子对复合物的圆二色谱。

图3为磷酸盐缓冲液盐浓度对胰岛素纳米颗粒粒径的影响。

图4为胰岛素纳米粒制备的批次间差异性。

图5为流速对在胰岛素纳米粒表面涂覆ha的影响。

图6为胰岛素纳米冻干制剂的体内降血糖效果。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。

实施例1

以胰岛素为蛋白药物为例，制备胰岛素纳米颗粒，具体的方法如下：

（1）疏水离子对过程

①称取胰岛素(insulin)溶于0.01m的稀盐酸溶液中，配成5mg/ml的胰岛素溶液，用naoh调节溶液ph至7.4备用；

②称取ddab溶于二氯甲烷，配成一系列的ddab有机溶液(质量浓度为5mg/ml～40mg/ml)；

③等体积的胰岛素溶液和ddab二氯甲烷溶液（均为(5ml)）混合后，加入双倍体积(10ml)的乙醇形成单相溶液，100rpm轻微震荡30分钟后加入5ml纯水重新分相，离心后，下层有机相即为溶有胰岛素-脂质（insulin-ddab）复合物的溶液。

通过检测上清中胰岛素的含量，计算胰岛素从水相到有机相中的相转移率。

测得结果如图1所示，从图中可知，当ddab和insulin的质量比从1:1增大到4：1时，其相转移率为从38.8%逐渐增大至97.2%，继续增大ddab和insulin的质量比，相转移率逐渐接近于100%。

胰岛素水溶液和胰岛素-脂质复合物的溶液的动态光散射测试结果如图2所示。从图2中可知，胰岛素水溶液中的自由胰岛素和有机溶剂中insulin-ddab复合物的粒径分别为2.4和3.2纳米（图2a），证明insulin-ddab复合物仍然是以单分子形式存在于溶剂中。而且从图2b中可知，胰岛素水溶液中的自由胰岛素和insulin-ddab复合物的圆二色谱结果几乎一致，由此可证明insulin-ddab复合物中胰岛素的构象和功能并未发生变化。

（2）纳米沉淀方法过程

①将上述制备的胰岛素-脂质复合物的二氯甲烷溶液用乙醇稀释（体积比1:9），将其引入四通道涡流混合器的第1通道，其它三个通道引入的则是磷酸盐缓冲液，实现快速湍流混合以制备胰岛素纳米颗粒溶液。所述有机溶液和水相的体积比分别为1:3～9，有机相流速为1ml/min～10ml/min。

当改变磷酸盐缓冲液的盐浓度时，可制备得到的粒径不同的胰岛素纳米颗粒，具体的盐浓度和粒径关系如图3所示，从图中可知，当磷酸盐缓冲液的盐浓度越小时，制备得到的胰岛素纳米颗粒的粒径越小。

当磷酸盐缓冲液的盐浓度为0.5～10mm时，制备的胰岛素纳米颗粒的粒径范围在35nm～792nm之间，分散度在0.1～0.2之间，表示所得胰岛素纳米颗粒溶液中胰岛素纳米颗粒的粒径分布很均一。

当有机溶液和水相的体积比分别为1:7，有机相流速为5ml/min，磷酸盐缓冲液的盐浓度为0.5mm时，在这一条件下重复制备胰岛素纳米颗粒三次，颗粒粒径结果如图4所示，平均粒径为35nm，证明这一方法良好的可重复性。

（3）胰岛素纳米颗粒表面涂覆透明质酸

以透明质酸（ha）为例子，作为保护层涂覆在胰岛素纳米颗粒的表面，具体的过程如下：

透明质酸溶液溶于水中，配成0.2mg/ml的水溶液，将步骤（2）中的胰岛素纳米颗粒溶液引入四通道涡流混合器中第1和第2通道，ha水溶液引入第3和第4通道，四个通道流速一致，调节通道流速分别为1ml/min，2ml/min，5ml/min，10ml/min，20ml/min，40ml/min，使两种液体通过四个通道到达涡流混合区域进行混合，得到表面涂敷ha的胰岛素纳米颗粒。

当通道的流速不同时，制备得到的表面涂敷ha的胰岛素纳米颗粒的粒径大小不同，具体的结果见图5所述，其中的np是指未涂覆透明质酸的蛋白纳米颗粒。从图中可知，当流速小于20ml/min时，颗粒粒径随流速降低而增大，当流速位于20～40ml/min之间时，颗粒粒径变化不大。当流速为20ml/min时，得到的颗粒最为均一，并且颗粒电位由+10mv变为-20mv左右。选择流速20ml/min这一优选条件。

（4）表面涂覆ha的胰岛素纳米颗粒冻干制剂的制备

冻干制剂的制备过程为：将甘露醇、木糖醇、甘氨酸、山梨醇或其中多种的组合物加入到表面涂覆ha的胰岛素纳米颗粒水溶液中，经搅拌混合均匀后，利用液氮冷冻10min，然后在-30℃温度，0.37bar真空条件下干燥48小时得到冻干纳米制剂。

经过实验筛选，表面涂覆ha的胰岛素纳米颗粒水溶液的最佳冻干保护剂为甘露醇/木糖醇组合物。其中甘露醇质量/木糖醇质量/载药纳米颗粒水溶液体积的比例为0～10g:0～10g:100ml；最佳比例为0.5g:1g:100ml。

表面涂覆ha的胰岛素纳米颗在冻干前后的各项性能比较结果如表1所示。

表1表面涂覆ha的胰岛素纳米颗在冻干前后的各项性能结果

从表1中可知，冻干后的表面涂覆ha的胰岛素纳米颗粒的各项性能，相比于冻干前载药纳米颗粒，均没有明显变化，复溶时间很短，在5秒钟之内即可完全复溶。证明该复合冻干保护剂可以在冻干的过程中可以很好的保护纳米颗粒。

实施例2实施例1制备的表面涂覆ha的胰岛素纳米颗粒冻干制剂的降血糖效果

将实施例1中制备的表面涂覆ha的胰岛素纳米颗粒透析后，加冻干保护剂冻干得到粉末制剂，装入明胶肠溶胶囊，即为待测样。

测试过程：180～220g的sd大鼠腹腔注射75mg/kg链脲佐菌素诱导成为i型糖尿病模型鼠，待模型鼠血糖稳定后，分为4组，每组6只。实验前，所有实验组禁食过夜，组1灌胃生理盐水，组2灌胃装有胰岛素粉末的胶囊（48iu/kg），组3灌胃装有表面涂覆ha的胰岛素纳米颗粒冻干粉末的胶囊（75iu/kg），组4皮下注射胰岛素溶液（5iu/kg）。每隔1h，尾尖取血，利用血糖仪测量血糖。

测试结如图6所示，从图中可知，皮下注射胰岛素实验鼠血糖迅速下降至较低水平，但是容易产生低血糖的风险，而且降低血糖的持效时间短，注射2h后，血糖浓度就开始上升。而口服胰岛素纳米颗粒制剂血糖则可以平稳的下降，这一良好的效果可归功于该胰岛素纳米颗粒制剂的胰岛素释放机制。胰岛素纳米颗粒进入血液以后，随着颗粒外层涂覆的ha的解离或降解，因为insulin-ddab疏水离子对复合物的疏水性，胰岛素不会在血液中产生暴释，而是缓慢匀速的释放，从而促使血糖平稳的下降。口服胰岛素粉末胶囊作为阴性对照，对血糖基本无影响。

从以上实施例可知，本发明提供的蛋白纳米颗粒的高通量制备方法可连续大规模化生产，远高于传统的蛋白颗粒制备方法的生产能力；而且批次间的差异小，连续化生产，适用于工业化生产；而且制备的蛋白纳米颗粒的性能和功能均未受损。

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，对于本领域的普通技术人员来说，在上述说明及思路的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。