一种环形泰勒虫病疫苗保护剂及制备方法与流程

本发明涉及一种微生物的保护剂，特别涉及一种环形泰勒虫病疫苗保护剂及其制备方法。

背景技术：

牛环形泰勒虫病是一种蜱传性血液原虫病，该病病原寄生于牛的淋巴细胞和红细胞内，临床主要表现为高热、贫血、黄疸和体表淋巴结肿胀等症状，该病发病率和病死率高，给畜牧业生产造成了巨大的经济损失。

环形泰勒虫感染牛淋巴细胞后，在细胞内形成裂殖体，裂殖体感染的宿主细胞在体外培养时，可获得类似肿瘤样细胞的无限增殖能力，而且通过细胞传代培养可使虫体致弱。业已证实，裂殖体阶段的虫体具有很强的抗原性和免疫原性，使用环形泰勒虫裂殖体感染的牛淋巴细胞制备的疫苗，可以诱导宿主产生较强的抗环形泰勒虫感染的能力。现有疫苗采用七十年代研制胶冻疫苗保护剂，由兰州兽医研究所研制，该保护剂通过添加乳白蛋白水解物和蔗糖为主要保护剂成分对细胞进行保护，细胞在保存50天后活力下降至33.5%，不能对细胞起到很好的保护作用。研究表明，虽然选用环形泰勒虫裂殖体阶段虫体制备疫苗能够很好的控制本病的传播与流行，但疫苗须保存在液氮或干冰中，而在4℃条件下保存期短，严重影响了该疫苗的运输和使用，以及疫苗的应用与推广。

技术实现要素：

本发明提供一种可克服现有技术不足的环形泰勒虫病疫苗保护剂，以及这种保护剂的制备方法。

本发明的环形泰勒虫病疫苗保护剂是以质量体积百分含量计算下列组分组成：食用明胶2%，亚硒酸钠0.01%，硫酸锌0.01%，双抗1%（注：青霉素工作浓度为100u/ml，链霉素工作浓度为0.1mg/ml），缓冲体系为0.01mpbs(ph7.2-7.4)和rpmi-1640。

本发明所述的疫苗保护剂各组份的制备方法，首先用pbs缓冲液将食用明胶溶解，调整胶浓度，10磅高压灭菌15分钟后4℃保存备用，其次将亚硒酸钠和硫酸锌溶解于rpmi-1640中，用0.22um滤器过滤除菌后4℃保存备用。该方法通过优化筛选，确定了一种能够对细胞起到很好保护效果的保护剂组分。

本发明的环形泰勒虫病疫苗保护剂的使用方法是：先用前述方法制备出食用明胶溶液和亚硒酸钠和硫酸锌溶液，再进行以下步骤：

a.细胞培养：将连续传代至第20代的环形泰勒虫裂殖体感染的牛淋巴细胞在t75细胞培养瓶中静置培养3天，使细胞生长到旺盛期，细胞密度与活力最佳时用于疫苗制备；

b.保护剂制备：将配置好的亚硒酸钠和硫酸锌添加到食用明胶中，使得明胶的含量在2%，亚硒酸钠含量为0.01%，硫酸锌含量为0.01%，同时添加1%双抗，充分混匀后用于疫苗的制备；

c.疫苗制备：将生长旺盛期的细胞离心，弃上清，沉淀用b配制的保护剂悬浮，调整细胞浓度至2.5×10⁶细胞/ml，使细胞均匀分散到保护剂中制备疫苗，置于4℃保藏。

保护剂中添加的微量元素硒是一种多功能营养素，具有抗氧化作用的细胞保护剂，研究发现添加低浓度硒对细胞具有保护性作用，高浓度的硒可引起细胞的损伤，降低细胞的活性。为获得对细胞的保护性作用，可针对细胞的种类和生长环境选择具体的硒添加浓度。本研究选取亚硒酸钠与明胶保护剂合理的配比，能够很好的保护细胞在存放过程中代谢与存活，提高了产品在保存与使用过程中的稳定性。通过对疫苗保护剂组分的筛选与优化得出的本发明保护剂可以提高疫苗保存效果，降低保存条件，满足本病免疫防控的需求，有助于该疫苗的应用与推广。

本发明方法制备的环形泰勒虫病疫苗保护剂延长了疫苗在4℃冷链环境运输过程中的保存期，由原来的50天提高到90天，通过20、40、60、90天细胞密度、活力及细胞再生长能力的检测，结果分析细胞在保存90天后，细胞活力维持在89%以上，细胞具备再生长的能力。本发明延长了疫苗的保存期，为环形泰勒虫病的免疫防治提供了有力的技术支持。

附图说明

图1为环形泰勒虫病疫苗在不同赋形剂中细胞活力的检测；

图2为环形泰勒虫病疫苗在不同缓冲体系中细胞活力的检测；

图3为环形泰勒虫病疫苗保存20、40、60、90天后保护剂组与对照组细胞活力检测；

图4为4℃条件保存实验结果与对照组的对比表；

图5为环形泰勒虫病疫苗保护剂组与对照组保存90天后显微镜观察结果。

具体实施方式

一、基本方法

1.材料和方法

1.1细胞来源所用细胞为中国农业科学院兰州兽医研究所外寄生虫和虫媒疫病实验室分离培养的环形泰勒虫喀什株裂殖体感染的淋巴细胞，通过体外稳定传代培养至f20。

1.2试剂食用明胶、工业明胶、鱼鳞明胶、亚硒酸钠和硫酸锌为国产试剂；pbs缓冲液、柠檬酸缓冲液、hepes缓冲液为自己配置溶液；去离子水为实验室自己生产；双抗，rpmi-1640购自biologicalindustries公司。

1.3仪器和设备生物洁净工作台（苏净安泰空气技术有限公司）；恒温培养箱（thermo）；细胞分析仪ic1000（countstar）；倒置显微镜（olympusix71）；移液器（eppendorf）。

1.4方法

1.4.1不同赋形剂的确定

实验选取三种赋形剂分别为食用明胶（a）、鱼鳞明胶（b）和工业明胶（c），用去离子水分别将三种赋形剂配制为6%的浓度，在沸水中加热溶化，待明胶冷却凝固后切成1cm²大小的小块，4℃条件下，用去离子水漂洗5天，每天换液2次，漂洗好的明胶，水浴溶化后用去离子水调成等渗的2%明胶溶液，10磅高压灭菌15分钟后备用。

细胞培养到生长旺盛期，将生长良好的细胞1000rpm/min离心10分钟后收集细胞，用2%明胶将细胞稀释到2.5×10⁶细胞/毫升左右，加入1%双抗，分装链霉素瓶中，封口，保存在4℃。每隔10日抽样三瓶做细胞密度、活力检测和细胞再生长培养，观察不同赋形剂在相同时间内细胞存活率和生长繁殖能力。

1.4.2不同缓冲体系确定

确定了细胞保存赋形剂为食用明胶的基础上，实验选取四种缓冲体系对细胞的保存进行进一步的优化，分别选用pbs缓冲液（p），柠檬酸缓冲液（c），hepes缓冲液（h）和去离子水（w）配制6%的食用明胶在沸水中加热溶化，待明胶冷却凝固后切成小块，4℃条件下，用相对应缓冲体系漂洗5天，每天换液2次，漂洗好的明胶调整浓度在2%，10磅高压灭菌15分钟备用。

细胞培养到生长旺盛期，将生长良好的细胞1000rpm/min离心10分钟后收集细胞，用含有2%不同缓冲体系食用明胶将细胞稀释到2.5×10⁶/毫升，加入1%双抗，分装链霉素瓶中，封口，保存在4℃。每隔10日抽样三瓶做细胞密度、活力检测和细胞再生长培养，观察不同缓冲体系在相同时间内细胞存活率和生长繁殖能力。

1.4.3不同保护剂成分确定

在确定赋形剂为食用明胶，缓冲体系为pbs缓冲液的基础上，对保护剂成分进行了筛选。选取两种保护剂成分的不同浓度进行组合实验，用pbs缓冲液配制6%的食用明胶在沸水中加热溶化，待明胶冷却凝固后切成小块，4℃条件下，用pbs缓冲液漂洗5天，每天换液2次，漂洗好的明胶调整浓度在2.5%，10磅高压灭菌15分钟，同时加入过滤灭菌亚硒酸钠（0.01%、0.001%）、硫酸锌（0.01%）使明胶终浓度为2%。

细胞培养到生长旺盛期，将生长良好的细胞1000rpm/min离心10分钟后收集细胞，用含有2%不同组份的保护剂将细胞稀释到2.5×10⁶/毫升，同时设立对照组，加入1%双抗，分装链霉素瓶中，封口，保存在4℃。每隔20日抽样三瓶做细胞密度、活力检测和细胞再生长培养，观察不同保护剂组份与对照组在相同时间内细胞存活率和生长繁殖能力。

2.结果及分析

2.1结果

2.1.1采用本发明的保护剂对细胞保存50天后活力与再生长能力的检测结果显示（图1）：在三种赋形剂保存条件下，细胞活力均有下降。其中食用明胶、鱼鳞明胶、工业明胶保存的细胞活力由最初的85%分别下降到72%、66%、62%，说明食用明胶在细胞保存过程中能够起到较好的保存效果，而鱼鳞明胶与工业明胶在保存50天后细胞活力下降快，细胞再生长能力较差。本实验确定了细胞保存的赋形剂为食用明胶。

2.1.2确定了赋形剂为食用明胶的基础上，进一步对保护剂的缓冲体系进行了筛选，对保存50天后细胞活力与再生长能力的检测结果显示（图2）：通过不同缓冲液的添加使细胞活力有一定提高，但保护效果略有不同。其中在hepes缓冲液、pbs缓冲液、柠檬酸缓冲液、去离子水中细胞保存50天后细胞活力由最初的89%分别下降到71%、77%、75%、72%，从结果分析pbs缓冲液对细胞的保存效果最佳，其次为柠檬酸缓冲液，hepes缓冲液与去离子水对细胞的保存没有起到明显的作用。实验确定了细胞保存的缓冲体系为pbs缓冲液。

2.1.3确定了赋形剂与缓冲体系的基础上进一步对保护剂成分进行筛选。通过添加0.01%亚硒酸钠、0.01%硫酸锌（group1）；0.001%亚硒酸钠、0.01%硫酸锌（group2）和对照组的实验结果分析（图3），细胞在保存90天后group1与group2实验组对细胞都有很好的保护效果，细胞活力从最初的94%下降到89%，而对照组细胞活力下降至71%。从表1细胞密度检测分析，group1较group2细胞密度从最初检测到90天后下降少，结果分析两组实验组对细胞都起到了很好的保护效果，其中group1保存效果稍好，结合微量元素硒对细胞具有保护和修复功能，实验确定group1保护剂组为实验首先组份，同时对照组细胞在活力和再生长能力上均差于实验组。显微镜观察（图4），实验组细胞壁光滑，边缘整齐，具备再生长能力，而对照组细胞基本破碎死亡，无再生长能力。

2.2分析

本实验通过对疫苗保护剂中赋形剂、缓冲体系及保护剂成分的系统优化，最终确定了环形泰勒虫病疫苗保存的有效保护剂。通过低温条件对细胞的保存，使细胞在维持一定代谢活动的基础上，能够维持较长时间的存活，且具备再生长繁殖能力。实验结果显示，细胞在保存90天后存活率仍能保持在89%以上，且再生长能力良好。硒是人和动物体内必须的微量元素，主要的功能在于抗氧化作用，还可以和其它微量元素如锌、铜等相互具有协同作用，临床研究硒均有抗细胞增殖作用，因此我们认为，通过在保护剂中添加微量元硒和锌对活细胞起到较好的保护作用。本研究通过添加保护剂可以实现环形泰勒虫病疫苗在4℃普通冰箱中较长时间地保存，为环形泰勒虫病疫苗的应用提供了便利条件。