低分子果胶在制备脑胶质瘤的辅助治疗药物或试剂中的用途的制作方法

本发明属于生物医学领域，具体涉及糖化合物低分子果胶在抑制脑胶质瘤增殖及自我更新中的应用，及其在制备脑胶质瘤的辅助治疗药物或试剂中的用途。

背景技术：

现有技术公开了在我国，脑胶质瘤不但是中枢神经系统最常见的颅内恶性肿瘤，由于其恶性增殖快，复发率高的特点，也是死亡率极高的恶性肿瘤之一。据文献记载，恶性胶质瘤单纯手术治疗生存期不逾半年，术后辅以放疗、化疗生存期超不过一年。恶性脑胶质瘤造成的高致残率、短生存期和低生活质量仍是威胁中青年群体生命的主要恶性肿瘤之一。目前临床上的治疗手段主要依赖于手术切除、放化疗，其中，手术作为最有效的治疗方法，一般认为肿瘤切除的越彻底越好，但是有时由于肿瘤与脑周围血管的黏连造成肿瘤难以无法切除只能采取保守疗法；放化疗的辅助治疗效果尚不理想，血脑屏障的阻遏，以及化疗对身体的副作用，均不能完全的治疗，只能杀死部分癌细胞，残余的癌细胞容易再次死灰复燃形成新的病灶。由于胶质瘤细胞的多样性，生长无明显边界，难以完全切除，对放疗化疗不甚敏感，且容易复发，因此，寻找性价比高的治疗药物已是当今本领域的研究热点。

研究显示，正常细胞间的识别和联系由于细胞膜上糖蛋白糖链的异常改变而发生障碍，肿瘤细胞的无限制增殖能力，强大的转移侵袭能力，破坏周围正常细胞和组织能力以及癌症病人的预后均与细胞表面的糖链结构密切相关。因此，研究者推测当细胞癌变时胶质瘤细胞膜上糖蛋白的寡糖链可能发生了改变,糖蛋白糖基的异常变化影响到了细胞正常的识别和黏附功能，从而导致了细胞的恶性转化，甚至引起癌细胞侵袭、迁移等行为的改变。有报道表明某些糖基转移酶作为肿瘤的有效标志物在肿瘤的发生发展过程中发挥重要作用；糖基转移酶家族涉及多种寡糖和多糖的生物学合成，由于表达的异常，导致酶活性及对底物特异性发生改变，进而产生肿瘤相关抗原；因此，相对于传统的治疗脑胶质瘤的亚硝脲类药物、烷化剂药物，靶向糖链合成的化合物有望成为肿瘤治疗药物的新靶点。

研究显示，胶质瘤组织中存在少数具有自我更新、多向分化、较强增殖潜能的细胞，即胶质瘤起始细胞(glioma-initiatingcells,gics)或称为胶质瘤干细胞(gliomastemcells,gscs)，该学说认为gics是胶质瘤的种子和源泉。众多研究亦证明胶质瘤起始细胞对放射的抵抗是胶质瘤放射治疗失败的主要原因，胶质瘤起始细胞已被认为是胶质瘤发生、增殖、转移和放化疗抵抗的始动因素。

基于现有技术的基础与现状，本申请的发明人拟提供糖化合物低分子果胶糖在抑制脑胶质瘤增殖及自我更新中的应用，及其在制备脑胶质瘤的辅助治疗药物或试剂中的用途。

技术实现要素：

本发明的目的在于基于现有技术的基础与现状，提供糖化合物低分子果胶新的药用用途，尤其是糖化合物低分子果胶在用于制备抑制脑胶质瘤增殖及自我更新的脑胶质瘤的辅助治疗药物或试剂中的用途。

本发明所述的低分子果胶(low-molecular-weightcitruspectin)，是从新鲜柑橘橘络中提取得到的一种以半乳糖为主要成份的多糖，对心血管类疾病、前列腺疾病、胃肠道类疾病、脂肪肝、癌症等具有显著的效果。

本发明通过对脑胶质瘤原代细胞的分离和培养以及脑胶质瘤细胞成球实验显示，所述的糖化合物低分子果胶可有效抑制脑胶质瘤细胞增殖和自我更新，临床研究结果显示，lcp能鳌合粘连癌细胞表面的半乳糖凝集素(galectin-3)，围歼癌细胞，阻止肿瘤的形成和转移，所述糖化合物低分子果胶可进一步制备用于脑胶质瘤的辅助治疗药物或试剂。

本发明中，通过细胞原代培养获得人脑胶质瘤组织中分离得到的原代脑胶质瘤细胞系t698968和t19002，利用这两个原代脑胶质瘤细胞系和人正常神经干细胞系通过细胞成球实验，分析所述两个胶质瘤细胞系的成球能力，以人正常神经干细胞(nsc)作为对照，经软件分析细胞球直径和数目，统计分析显示所述t698968和t19002的自我更新和增殖能力强。

本发明通过成球实验及细胞免疫荧光表明，所述的t698968和t19002细胞具备胶质瘤干细胞特性，能呈神经球悬浮生长，表达神经干细胞和肿瘤干细胞标志物cd133和nestin，并且，通过肿瘤形成实验，少至500个细胞即能够在裸鼠体内形成肿块。

进一步，本发明通过体外细胞成球实验，分别向t698968和t19002细胞中加入糖化合物低分子果胶，结果显示，所述糖化合物低分子果胶明显抑制脑胶质瘤细胞的自我更新和增殖能力。

基于脑胶质瘤恶性增殖快，具有极强的成瘤和自我更新能力，本发明的实验结果表明，所述的糖化合物低分子果胶可用于制备靶向靶向抑制脑胶质瘤细胞增殖的治疗试剂，作为脑胶质瘤病人的治疗辅助手段。

本发明的再一目的是，提供糖化合物低分子果胶作为有效化合物在制备治疗脑胶质瘤的靶向药物中的用途，进一步抑制脑胶质瘤细胞增殖和自我更新。

本发明的再一目的是，提供糖化合物低分子果胶在制备肿瘤治疗的临床试剂的用途；所述的肿瘤优选为脑胶质瘤；所述临床试剂是以能够靶向抑制脑胶质瘤原代细胞成球数量和大小的抑制脑胶质瘤细胞增殖目的的治疗试剂；

本发明所述的治疗试剂可制成一种治疗脑胶质瘤的药物，主要活性成分为糖化合物，糖化合物处理引起的糖基转移酶或者其他糖链合成酶表达的异常，导致酶活性及对底物特异性发生改变，进而产生肿瘤相关抗原。

本发明通过研究靶向糖链合成的化合物，提供了糖化合物低分子果胶在抑制脑胶质瘤增殖及自我更新中的应用，及其在制备脑胶质瘤的辅助治疗药物或试剂中的用途。本发明通过细胞成球实验证实所述细胞系具有很强的成球能力，然后在糖化合物低分子果胶处理条件下，比较细胞球的大小和数量，证实了糖化合物低分子果胶可显著抑制脑胶质瘤细胞的增殖和自我更新能力。本发明为脑胶质瘤治疗提供了新的靶点，为制备脑胶质瘤的辅助治疗药物提供了新的研究方向；为脑胶质瘤病人的相对个性化的治疗选择和降低脑胶质瘤死亡率具有重要的意义。

附图说明

图1为细胞成球实验，对照组nsc和实验组t698968及t19002细胞在不同种植数量下的成球能力对比，其中，a图为形成的细胞球的示意图，b图为细胞球数量统计结果(***p<0.001)。

图2为细胞培养形态图及细胞免疫荧光图，其中，a图表示t698968及t19002细胞能够呈神经球悬浮生长，b图为共染肿瘤干细胞标志物cd133与nestin的细胞免疫荧光激光共聚焦结果。

图3为肿瘤形成实验，t698968和t19002两组脑胶质瘤细胞500个种植于裸鼠皮下的成瘤情况，a图为肿瘤形成统计图。

图4为细胞成球实验，对照组(h2o)和实验组(低分子果胶low-molecular-weightcitruspectin(lcp):800μg/ml)在t698968和t19002两组脑胶质瘤细胞系中增殖及自我更新能力对比，其中，a图为t698968形成的细胞球的示意图，b图为t698968细胞球数量统计结果(*p<0.05)，c图为t19002形成的细胞球的示意图，d图为t19002细胞球数量统计结果(*p<0.05)。

具体实施方式

本发明提供的具体实施方式作详细说明，但本发明的实施并不仅限于此。

本实施例中未注明的具体条件和实验方法，通常按照《分子克隆实验指南》中所述常规条件，或者参照试剂生产商提供的条件实施。

实施例1细胞原代培养的方法在人脑胶质瘤组织中分离得到原代脑胶质瘤细胞系t698968和t19002

本实施例中，利用上述两个原代脑胶质瘤细胞系和人正常神经干细胞系通过细胞成球实验，分析两个胶质瘤细胞系的成球能力：

一)人脑胶质瘤组织中分离得到原代脑胶质瘤细胞系，通过细胞成球实验，分析两个胶质瘤细胞系的成球能力，

1.人脑胶质瘤细胞系的分离与培养

本实验采用的脑胶质瘤组织标本是在获得知情同意后，根据世界卫生组织(who)标准分类为胶质母细胞瘤(gbm)的肿瘤样品是从中山医院道德委员会批准的复旦大学附属中山医院接受手术治疗的患者获得的。在手术切除后1小时内，洗涤肿瘤标本并酶促分解成单细胞；

细胞培养采用含有缺乏维生素a的b27(gibco)、7.5％nahco3、100μg/ml青霉素及50μg/ml链霉素(gibco)、2μg/ml肝素(sigma)、20ng/mlegf(chemicon)和20ng/mlb-fgf(chemicon)的dmem/f12培养基(gibco)，在5％co2-95％空气、饱和湿度以及37℃的培养条件下培养；

具体操作如下：

1)准备配制酶解试剂

2)将肿瘤组织置于60mm培养皿在3ml预冷的hbss平衡液中去除软脑瘤和血管；

3)3ml预冷的hbss平衡液体中洗涤2次，去除血迹；

4)将指甲盖大小的肿瘤组织置于新的60mm培养皿中，在3ml预冷的hbss平衡液体中，用眼科剪刀和显微镜，用外科手术剪，剪碎成1mm³大小的碎块；

5)将上述组织碎块转移至15ml离心管中，2000rpm离心5分钟；

6)弃上清，转移至60mmdish或100mmdish,加入5-10ml的消化液体，37度培养箱30-120分钟(如果很粘稠，加入dnaasei)用1ml的巴氏吸管或剪过头的大枪头反复吹打；

7)重复5，1-3遍，直到酶解效果好结束；

8)2000rpm离心10分钟，加入预冷的nh4c缓冲液l约5ml于冰上裂解红细胞10min；

9)2000rpm离心10分钟，去上清。加入5ml的hbss缓冲液，2000rpm离心10分钟；

10)弃上清，加入1ml的hbss缓冲液，用70目的筛网过滤，2000rpm离心10分钟，弃上清，用培液重悬，即可；

11)将得到的c细胞⁺计数，转入37℃、5％co2(v/v)恒温培养箱培养。

2、脑胶质瘤细胞系t698968和t19002不同密度种植，检测细胞成球能力，

1)将上述原代分离培养的细胞与人正常神经干细胞作为对照组细胞2000rpm离心5分钟，吸去上清。用干细胞胰酶消化8分钟左右，2000rpm离心5分钟，弃上清；

2)用含有20ng/mlegf(chemicon)、20ng/mlfgf-2(chemicon)、2μg/mlheparin(sigma)、1:50的比例加入不含维生素a的b27(gibco)、100μg/ml青霉素及50μg/ml链霉素的dmem/f12培养基(gibco)洗涤细胞，2000rpm离心5分钟，吸去上清，用dmem/f12培养基重复洗涤细胞2次，用细胞计数仪计算细胞数量；

3)按照1、100、1000和1万的密度，将对照组和实验组的细胞等量分到低吸附的96孔板(corning)，每孔细胞悬浮于100μldmem/f12培养基中，每组9个重复孔，共10个孔；

4)每3天补充30μldmem/f12培养基，培养2周后，在显微镜下拍照，统计形成细胞球的数量和直径，以直径大于100μm的细胞球作为有效的结果；

结果如图1所示，实验组t698968和t19002细胞形成的细胞球直径明显比对照组大，细胞球数量也显著多于对照组，说明t698968和t19002细胞系具有很强的增殖和自我更新能力，a图是形成的细胞球示意图，b图是细胞球数量统计结果(***p<0.001)。

实施例2脑胶质瘤细胞系t698968和t19002通过免疫荧光激光共聚焦技术检测胶质瘤干细胞干性。

1、检测脑胶质瘤细胞系t698968和t19002细胞干性的实验过程和结果分析

1)准备4％多聚甲醛：

4％多聚甲醛溶于1xpbs，调节ph7.2，过滤后4℃保存；

2)悬浮生长的细胞，先将细胞离心，pbs漂洗，取细胞悬液滴在多聚赖氨酸包被的载玻片上，用200μl吸头将悬液推平，适度风干，在细胞悬液四周用阻水笔画圈，4％多聚甲醛室温固定30-40min。固定后pbs漂洗3次，每次5min；

3)封闭

封闭液、抗体稀释液：含5％荧光二抗来源的血清，0.3％tritonx-100的pbs。漂洗后的标本使用封闭液室温封闭90min；

4)抗体孵育

封闭结束后甩去封闭液，按照抗体说明书稀释一抗，4℃孵育过夜；

5)一抗漂洗

pbs漂洗3次，每次10min；

6)二抗孵育

按照抗体说明书稀释荧光二抗，室温孵育90min，注意此后的操作避光；

7)二抗漂洗

二抗孵育后，用pbs漂洗3次，每次10min；

8)细胞核染色

0.5μg/mlhoechst33258染料于pbs中染核10min。pbs漂洗3次，每次10min；

9)封片

在盖玻片和载玻片间低价dako抗荧光猝灭封片剂，封片；

10)在荧光显微镜或者激光共聚焦显微镜下相应通道观察获取图像

结果如图2所示，脑胶质瘤细胞系t698968和t19002具有胶质瘤干细胞干性；其中a图是t698968和t19002细胞在培养液中生长形态图，细胞能够呈神经球悬浮生长，b图是细胞贴片免疫荧光激光共聚焦拍摄结果，这些神经球表达神经干细胞和肿瘤干细胞标志物cd133(红色)与nestin(绿色)。

实施例3脑胶质瘤细胞系t698968和t19002通过肿瘤形成实验检测胶质瘤干细胞自我更新，肿瘤起始能力

1、检测胶质瘤细胞系t698968和t19002肿瘤形成能力实验过程和结果分析

1)将脑胶质瘤细胞消化成单细胞悬液，使用细胞计数仪技术；

2)按实验需求用100-200μlpbs重悬相应数量的细胞，使用1ml注射器注射于裸鼠或nod-scid小鼠背部皮下；

3)每天观察小鼠皮下成瘤情况，统计成瘤数量；

结果如图3所示，脑胶质瘤细胞系t698968和t19002具有胶质瘤干细胞的自我更新及肿瘤起始能力。a图是t698968和t19002细胞肿瘤形成能力统计图。

实施例4糖化合物低分子果胶处理脑胶质瘤细胞系t698968和t19002，通过细胞成球实验检测细胞的增殖和自我更新能力

1、检测糖化合物低分子果胶处理后细胞成球能力实验过程和结果分析

1)将脑胶质瘤细胞系t698968和t19002，2000rpm离心5分钟，吸去上清。用干细胞胰酶消化8分钟左右，2000rpm离心5分钟，弃上清；

2)用含有20ng/mlegf(chemicon)、20ng/mlb-fgf(chemicon)、2μg/mlheparin(sigma)、1:50的比例加入不含维生素a的b27(gibco)、100μg/ml青霉素及50μg/ml链霉素的dmem/f12培养基(gibco)洗涤细胞，2000rpm离心5分钟，吸去上清，用dmem/f12培养基重复洗涤细胞2次，用细胞计数仪计算细胞数量；

3)按照以下化合物浓度配制细胞处理液

低分子果胶low-molecular-weightcitruspectin(lcp):800μg/ml

以水作为对照，将对照组和实验组的细胞等量分到低吸附的96孔板(corning)，每孔500个细胞悬浮于100μldmem/f12培养基中，每组9个重复孔，共10个孔；

4)按照不同的培养液条件，每3天补充30μldmem/f12培养基，培养2周后，在显微镜下拍照，统计形成细胞球的数量和直径，以直径大于100μm的细胞球作为有效的结果；

结果如图2所示，实验组t698968和t19002细胞形成的细胞球直径明显比对照组小，细胞球数量也显著少于对照组，说明糖化合物低分子果胶可显著抑制脑胶质瘤细胞系t698968和t19002的增殖和自我更新能力，ac图是形成的细胞球示意图，bd图是细胞球数量统计结果(***p<0.001)。

综上所述，糖化合物低分子果胶作为治疗脑胶质瘤的靶向药物，可以显著抑制你脑胶质瘤细胞的增殖及自我更新能力。因此，有望为临床抗脑胶质瘤药物的研发提供新的思路，为脑胶质瘤患者治疗提供新的治疗方向。