异甘草素在治疗急性胰腺炎药物中的应用的制作方法

本发明涉及制药技术领域，具体涉及一种治疗急性胰腺炎的药物以及新途径。

背景技术

急性胰腺炎(acutepancreatitis,ap)是胰酶提前激活造成的胰腺以及周围组织自身消化的一种急性炎症，本病起病急，病情重，并发症多，病死率高，胰腺腺泡细胞内胰蛋白酶原提前激活和炎症反应的级联效应被认为是导致急性胰腺炎发生、发展的关键机制。而ap的发病机制与自噬有关，ap早期胰蛋白酶原的激活发生在胰腺腺泡细胞大空泡中，自噬既可以使胰蛋白酶原与组织蛋白水解“共位置”，又可以提供胰蛋白酶原自我激活所需的适当ph值，这提示自噬与ap的发生发展可能存在某种联系。此外，ap早期腺泡细胞中出现的空泡是双层膜的，且膜上有自噬标志物lc3ⅱ的存在，这些空泡结构后期被证明是自噬泡，而在这些空泡中发现未完全消化的细胞内容物以及胰蛋白酶，更进一步证实胰蛋白酶原的激活可能与自噬有关。另一个与a发病机制有关的是内质网应激(endoplasmicreticulumstress,ers)，内质网是体内一个重要的细胞器,具有调节蛋白质的合成、折叠和聚集的功能。ers在急性胰腺炎(ap)的发生和发展中有着不可替代的作用。胰腺腺泡细胞含有大量的内质网去适应合成消化酶以满足其生理功能，在ap发病过程中内质网结构会产生显著的改变,包括内质网肿胀和空泡形成以及核糖体的损失，这些改变使蛋白折叠处于高负荷状态,引发ers,激活多条下游信号通路引起细胞损伤甚至死亡。综上所述，自噬和内质网应激参与了ap的病理生理过程，调控自噬和内质网应激对于减轻或加重ap具有非常重要的作用。目前对这些方面的研究仍然匮乏，因而很值得进一步明确ap与自噬和内质网应激之间的联系，通过寻找与ap有关的自噬和内质网应激的新靶点，探究其对ap的作用以及机制，有助于为临床提供治疗ap的新观点以及策略。

技术实现要素：

为了解决上述的技术问题，本发明提供了异甘草素在治疗血脑屏障障碍和炎症药物中的应用，其目的在于，提供一种异甘草素的新应用，通过异甘草素制备的药剂治疗急性胰腺炎，可明显延缓病情进展恶化，显著减少病死率和病残率，提高生存质量，治疗的可操作性强，费用低等优点。

本发明保护异甘草素在制备治疗急性胰腺炎药物中的应用。

作为本发明进一步的改进，所述药物，其为以异甘草素为唯一活性成分的制剂。

作为本发明进一步的改进，所述药物，其为将异甘草素和其他药物制成的复方制剂。

作为本发明进一步的改进，所述药物，其为含有从甘草根、红芪、黄芪和/或串果藤中提取得到含有异甘草素的提取物的制剂。

作为本发明进一步的改进，所述药物，其为含有人工合成的异甘草素的制剂。

作为本发明进一步的改进，所述制剂，其为注射液、皮下埋植剂、片剂、粉剂、颗粒剂、胶囊、口服液、缓释剂中的一种。

作为本发明进一步的改进，所述复方制剂，其为注射液、皮下埋植剂、片剂、粉剂、颗粒剂、胶囊、口服液、缓释剂中的一种。

本发明的药物异甘草素的用药剂量可为2.2g/kg体重以下(该剂量为小鼠口服最大耐受剂量(mtd)的换算剂量，小鼠的mtd＞20g/kg，因此其ld50＞20g/kg)。

本发明具有如下有益效果：本发明通过大量试验，从甘草根中提取得到异甘草素,其对治疗急性胰腺炎效果好，且无毒副作用，成本低廉。将有助于延缓病情进展恶化，显著减少病死率和病残率，提高生存质量，还具有可操作性强，能显著降低患者及医疗机构的诊疗费用等优点。

附图说明

图1为异甘草素通过改善急性胰腺炎病理学改变图；

图2为异甘草素通过改善急性胰腺炎病理学改变图；

图3为异甘草素通过改善内质网应激缓解胰腺损伤图；

图4为异甘草素通过改善自噬缓解胰腺损伤图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所述的实施例只是本发明的部分具有代表性的实施例，而不是全部实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的其他所有实施例都属于本发明的保护范围。

其次，此处所称的“一个实施例”或“实施例”是指可包含于本发明至少一个实现方式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的“在一个实施例中”并非均指同一个实施例，也不是单独的或选择性的与其他实施例互相排斥的实施例。

实施例1异甘草素对淀粉酶和脂肪酶的影响

1.急性胰腺炎小鼠模型的建立

6-8周龄雄性c57bl/6n小鼠，清洁级，体重为20-25g，购于上海斯莱克实验动物有限责任公司。采用随机数字表法将30只小鼠将小鼠随机分为假手术组(sham)、模型组(ap)、给药组(ap+异甘草素)。实验前小鼠适应性饲养1周，造模前12h禁食，不禁水。腹腔注射50μg·kg-1·h-1雨蛙肽素，共7次，最后1次腹腔注射雨蛙素后追加1次腹腔注射lps10mg/kg建立小鼠ap模型。

2.实验方法

将异甘草素溶于0.9％氯化钠溶液，给药组小鼠在造模前1h腹腔注射20mg·kg^-1，假手术组和模型组小鼠腹腔注射等体积0.9％氯化钠溶液。每天2次，连续给药7天。

3.淀粉酶和脂肪酶检测

取小鼠眼眶血，离心取上清液检测，ap组淀粉酶和脂肪酶水平较sham组均升高[分别为(189.42±50.66)u/l比(296.77±58.23)u/l和(166.58±39.55)u/l比(502.33±96.56)u/l]，经异甘草素处理后，小鼠血清淀粉酶和脂肪酶水平分别为(223±30.24)u/l和(302±47.25)u/l，均低于ap组，差异均有统计学意义。

结论：异甘草素有助于小鼠血清中淀粉酶和脂肪酶含量的降低，有助于缓解急性胰腺炎的症状。

实施例2异甘草素对胰腺组织损伤的影响

1.急性胰腺炎小鼠模型的建立

6-8周龄雄性c57bl/6n小鼠，清洁级，体重为20-25g，购于上海斯莱克实验动物有限责任公司。采用随机数字表法将30只小鼠将小鼠随机分为假手术组(sham)、模型组(ap)、给药组(ap+异甘草素)。实验前小鼠适应性饲养1周，造模前12h禁食，不禁水。腹腔注射50μg·kg-1·h-1雨蛙肽素，共7次，最后1次腹腔注射雨蛙素后追加1次腹腔注射lps10mg/kg建立小鼠ap模型。

2.实验方法

将异甘草素溶于0.9％氯化钠溶液，给药组小鼠在造模前1h腹腔注射20mg·kg^-1，假手术组和模型组小鼠腹腔注射等体积0.9％氯化钠溶液。每天2次，连续给药7天。

3.组织病理学评分

实验结束后处死小鼠，快速取出胰腺组织，置于多聚甲醛固定液中4℃保存，然后切片，染色，在光学显微镜下观察胰腺组织损伤表现，对胰腺组织进行病理损伤评分。具体结果见图1。(a)采用苏木精-伊红(he)染色法，结果提示异甘草素缓解由ap诱导的胰腺组织水肿，炎性细胞浸润等现象。(b)胰腺组织病理学评分，结果提示异甘草素减低由ap组织病理学评分。

结论：异甘草素能够缓解胰腺炎引起的组织水肿，组织病理学评分降低。

实施例3异甘草素对胰腺组织凋亡相关蛋白表达水平的影响

1.急性胰腺炎小鼠模型的建立

6-8周龄雄性c57bl/6n小鼠，清洁级，体重为20-25g，购于上海斯莱克实验动物有限责任公司。采用随机数字表法将30只小鼠将小鼠随机分为假手术组(sham)、模型组(ap)、给药组(ap+异甘草素)。实验前小鼠适应性饲养1周，造模前12h禁食，不禁水。腹腔注射50μg·kg-1·h-1雨蛙肽素，共7次，最后1次腹腔注射雨蛙素后追加1次腹腔注射lps10mg/kg建立小鼠ap模型。

2.实验方法

将异甘草素溶于0.9％氯化钠溶液，给药组小鼠在造模前1h腹腔注射20mg·kg^-1，假手术组和模型组小鼠腹腔注射等体积0.9％氯化钠溶液。每天2次，连续给药7天。

3.胰腺组织凋亡相关蛋白表达水平检测

选择假手术组、模型组、给药组、对照组各组小鼠，在最后一次给药后24小时麻醉后处死所有小鼠，取胰腺组织匀浆，4℃、12000r/min离心10min取上清，考马斯亮蓝检测蛋白浓度并配平，westernblotting法检测凋亡相关蛋白(c-caspase3)表达水平。具体结果如图2。采用westernblot方法，异甘草素抑制由ap诱导的凋亡相关蛋白(c-caspase3)的表达水平。

结论：异甘草素可以抑制凋亡蛋白(c-caspase3)的表达。

实施例4异甘草素对胰腺组织凋亡相关蛋白表达水平的影响

1.急性胰腺炎小鼠模型的建立

6-8周龄雄性c57bl/6n小鼠，清洁级，体重为20-25g，购于上海斯莱克实验动物有限责任公司。采用随机数字表法将30只小鼠将小鼠随机分为假手术组(sham)、模型组(ap)、给药组(ap+异甘草素)。实验前小鼠适应性饲养1周，造模前12h禁食，不禁水。腹腔注射50μg·kg-1·h-1雨蛙肽素，共7次，最后1次腹腔注射雨蛙素后追加1次腹腔注射lps10mg/kg建立小鼠ap模型。

2.实验方法

将异甘草素溶于0.9％氯化钠溶液，给药组小鼠在造模前1h腹腔注射20mg·kg^-1，假手术组和模型组小鼠腹腔注射等体积0.9％氯化钠溶液。每天2次，连续给药7天。

3.胰腺组织内质网应激相关蛋白表达水平检测

选择模型组、给药组、对照组各组小鼠，给药后24小时麻醉后处死所有小鼠，取胰腺组织匀浆，4℃、12000r/min离心10min取上清，考马斯亮蓝检测蛋白浓度并配平，westernblotting法检测内质网相关蛋白(grp78,atf6，chop)表达水平。具体结果如图3。采用westernblot方法，异甘草素缓解由ap诱导的胰腺组织grp78、atf6、chop蛋白增高。

结论：异甘草素缓解由ap诱导的胰腺组织grp78、atf6、chop蛋白增高，可见，异甘草素可以缓解内质网的应激性反应。

实施例5异甘草素对胰腺组织免疫荧光检测自噬相关蛋白的表达的影响

1.急性胰腺炎小鼠模型的建立

6-8周龄雄性c57bl/6n小鼠，清洁级，体重为20-25g，购于上海斯莱克实验动物有限责任公司。采用随机数字表法将30只小鼠将小鼠随机分为假手术组(sham)、模型组(ap)、给药组(ap+异甘草素)。实验前小鼠适应性饲养1周，造模前12h禁食，不禁水。腹腔注射50μg·kg-1·h-1雨蛙肽素，共7次，最后1次腹腔注射雨蛙素后追加1次腹腔注射lps10mg/kg建立小鼠ap模型。

2.实验方法

将异甘草素溶于0.9％氯化钠溶液，给药组小鼠在造模前1h腹腔注射20mg·kg^-1，假手术组和模型组小鼠腹腔注射等体积0.9％氯化钠溶液。每天2次，连续给药7天。

3.胰腺组织免疫荧光检测自噬相关蛋白的表达情况

选择模型组、给药组和对照组各组小鼠各10只，给药后24小时麻醉后处死所有小鼠，石蜡包埋胰腺组织，通过免疫荧光检测胰腺组织的自噬相关蛋白(lc3ii,beclin-1)表达变化。结果图4。(a)采用免疫荧光染色方法，异甘草素缓解由ap诱导的胰腺组织beclin-1蛋白增高(提示自噬增高)(b)采用免疫荧光染色方法，异甘草素缓解由ap诱导的胰腺组织lc3ii蛋白增高(提示自噬增高)。

结论：异甘草素缓解由ap诱导的胰腺组织beclin-1蛋白和lc3ii蛋白增高，可见，异甘草素可以抑制胰腺组织的自噬。

根据实验得出结论，异甘草素可以有效治疗急性胰腺炎，无毒副作用，其作用机理是通过缓解由ap诱导的胰腺组织内质网应激相关的grp78蛋白、atf6蛋白、chop蛋白增高来缓解内质网的应激性反应，通过缓解由ap诱导的胰腺组织自噬的标志蛋白beclin-1蛋白和lc3ii蛋白增高来抑制胰腺组织的自噬，并且可以抑制抑制凋亡蛋白(c-caspase3)的表达，从而起到治疗急性胰腺炎的作用，具体表现在血清中淀粉酶和脂肪酶含量的降低以及缓解胰腺炎引起的组织水肿，降低组织病理学评分。

本领域的技术人员在不脱离权利要求书确定的本发明的精神和范围的条件下，还可以对以上内容进行各种各样的修改。因此本发明的范围并不仅限于以上的说明，而是由权利要求书的范围来确定的。