一种用于口服的载减脂药物白藜芦醇的控释纳米载体及其制备方法与流程

发明属于化学药物技术领域，涉及一种用于口服的载减脂药物白藜芦醇的控释纳米载体及其制备方法。

技术背景

随着社会的进步和人民生活水平的提高，肥胖的人越来越多，肥胖症已成为日益严重的全球性流行病。世界卫生组织将肥胖定义为一种危及人体健康的体内堆积脂肪过多或分布异常的疾病。肥胖是一种慢性的持续状态,以身体脂肪过多为特点,用体重指数(bmi)〔weight(kg)/height(m²)〕来定义,bmi≥30是肥胖,bmi=25～29.9为超重。肥胖是现代人类多种慢性疾病的危险因素,包括2型糖尿病、胆道疾病、异常脂质血症、抗胰岛素作用、睡眠窒息、呼吸困难、无休止的焦虑、冠心病、高血压、骨关节炎、各种癌症、生殖激素异常、多囊卵巢综合征等。由于肥胖与许多疾病有密切关系,在世界范围内的发病率很高,又在不断增加,对肥胖的治疗,有助于对与肥胖相关疾病的防预和治疗。

在这个以瘦为美的审美新时代，人们减肥不仅是对个人健康体质的要求，更是对自身美好形体的一种追求，越来越多的人开始服用各种减肥产品，这些产品往往疗效不佳或者对身体会产生很大的毒副作用，所以急需一种天然无毒的减脂药物。

白藜芦醇(resveratrol，res)是一种天然非黄酮类多酚化合物，是植物在紫外线照射、外来病菌入侵等不利条件下产生的一种植物抗毒素，主要存在于虎杖、葡萄、花生、决明、藜芦等植物中，具有抗癌、抗炎、抗氧化、保护心血管、减脂等药理作用。白藜芦醇在自然界中有顺式白藜芦醇（cis-resveratrol,c-res）、反式白藜芦醇（trans-resveratrol,t-res），其中反式异构体的生理活性大于顺式异构体，在紫外光照射下，反式构象能转化为顺式构象，具有光不稳定性。大量研究表明，res对肥胖具有防治作用，其主要与几种受体和信号分子结合，通过关键受体、酶类抑制前脂肪细胞分化、诱导细胞凋亡、调控生热作用、促进脂肪分解和脂肪酸氧化发挥抑制肥胖功能。白藜芦醇是一种天然药物，对人无毒副作用，但由于t-res化学性质不稳定，口服具有肝首过效应，半衰期很短，生物利用度低等导致其应用受到限制。寻找有效途径提高t-res的生物利用度至关重要。

聚（乳酸-羟基乙酸共聚物）（plga）是由美国食品和药物管理局（fda）批准用于临床应用的聚乳酸（pla）和聚乙醇酸（pga）的共聚物。plga在生理环境中具有优异的生物相容性和降解性，并且生物降解产物（乳酸和乙醇酸）天然存在代谢物。凭借这些优势，plga已被用作食品和药物递送的有效载体。

由于t-res白藜芦醇水溶性差、半衰期短，导致其生物利用度低。近年来，随着材料科学和生物医学的发展，使得纳米材料作为药物载体如微乳、脂质体、固体脂质纳米粒等引起。将药物负载纳米微球中可增强药物的靶向性和控释性，提高其溶解度和生物利用度，降低其毒性。为此，利用可生物降解的纳米材料plga，并将其作为白藜芦醇的载体，利用乳化溶剂挥发法将其制作为结构为固体/油/水（s/o/w）的纳米载体，从而提高口服药物的生物利用度。

技术实现要素：

本发明的目的之一是提供一种用于口服的载减脂药物白藜芦醇的控释纳米载体。目的之二是提供这种纳米载体的制作方法。

本发明通过以下方法实现：用一种具有良好的生物相容性、可降解的功能高分子有机化合物plga为载体，利用乳化溶剂挥发法包载减脂药物t-res，制成结构为固体/油/水（s/o/w）纳米载体。

本发明技术方案如下。

一种用于口服的载减脂药物白藜芦醇的控释纳米载体，以减脂药物t-res与生物相容性好，可降解的功能高分子化合物为原料制备成载药高分子的方法。

进一步地，用乳化溶剂挥发法，通过plga的自组装将减脂药物t-res包载进去。

一种用于口服的载减脂药物白藜芦醇的控释纳米载体，具体包括如下步骤：

（1）将50-100mgplga溶解于5-10ml二氯甲烷和丙酮的混合溶剂中，形成均匀的plga溶液；所述混合溶剂中二氯甲烷与丙酮体积比为1-3:1

（2）再向步骤（1）中所得的plga溶液加入2-18mg游离的t-res，调节超声功率为100-400w，超声时间为1-5min，进行冰浴超声，得到s/o初级乳液，此为油相；

（3）将bsa（牛血清白蛋白）溶解于去离子水中，得到质量百分比浓度为1%-5%均匀bsa溶液，此为水相，将步骤（2）中得到的油相，滴加入水相之中，再进行冰浴超声，超声功率为100-400w，超声时间为1-5min，以产生最终的s/o/w乳液；

（4）为了分散最终的s/o/w乳液，加入30-40ml去离子水，用磁力搅拌5-8h以去除残留的有机溶剂，得到纳米载体溶液；

（5）把步骤（4）得到纳米载体溶液在10000-15000r/min转速下离心30-50min后去除上清液，然后用去离子水洗，以真正洗净有机溶剂，然后冷冻干燥，放4℃备用，得到用于口服的载减脂药物白藜芦醇的控释纳米载体。

一种用于口服的载减脂药物白藜芦醇的控释纳米载体，所述纳米载体结构为固体/油/水（s/o/w）。

本发明通过固体/油/水（s/o/w）自乳化技术在plga中加载不溶于水的脂药物t-res，可以提高t-res的溶解度和生物利用度，能克服口服生物利用度差的特点，具有减脂的功效。本发明中被负载的药物是一种生物性很强的天然多酚类物质--白藜芦醇，又称为芪三酚，它有很多药理功效。其特点是用plga包载的白藜芦醇大大提高了它的溶解度和在体内的生物利用度，克服口服生物利用度低的问题，而且载体具有控释作用，能够实现长循环，白藜芦醇不仅可以预防甘油三酯的积累，还能促进脂肪的分解，达到预防和治疗双重功效。

与现有技术相比，本发明的优势在于：

1.本发明能够有效的克服口服给药方式所带来的肝首过效应，药物半衰期短，生物利用度低，破坏药物活性等缺点，本发明将活性药物分子用可生物降解，生物相容性好的plga作为外壳包裹起来，能够缓解胃肠液对药物分子的降解作用，肝脏的首过作用等，从而提高药物分子的生物利用度和体内的半衰期，利于口服给药。

2.白藜芦醇是一种天然药物，前期研究发现它具有良好的减脂效果，但是化学性质不稳定，具有光敏感性，水不溶性，这些限制了白藜芦醇的实际应用，本发明用plga作为载体在体内递送白藜芦醇，可充分保护药物的生物活性，发挥其减脂功效。

3.本发明所制备的药物载体，不仅可以有效的减少体内甘油三酯的积累，还能够促进脂肪的分解，达到预防和治疗双重功效。而且所载的白藜芦醇是天然存在的药物分子，对人体无毒副作用。

4.本发明制备的载体，具有控释的效果，可以通过plga在体内的降解速度控制药物的释放速率，可以起到长效治疗的效果，使作用更加持久。

附图说明

图1为plga包载白藜芦醇的纳米载体（res-plga-nps）的amf电镜图。

图2为plga包载白藜芦醇的纳米载体（res-plga-nps）的sem电镜图。

图3为res-plga-nps的粒径分布图；

图4为res-plga-nps的zeta电位分布图；

图5为白藜芦醇（res），plga和res-plga-nps的红外光谱图；

图6为res-plga-nps中res在不同ph环境下的体外释放曲线；

图7为不同浓度res-plga-nps对诱导为脂肪肝细胞的hepg2细胞的油红o染色图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步地具体详细描述，但本发明的实施方式不限于此，对于未特别注明的工艺参数，可参照常规技术进行。

实施例1

一、纳米载体的制备

1、将50mgplga溶解于5ml二氯甲烷和丙酮的混合溶剂（体积比二氯甲烷：丙酮=1：3）中，形成均匀的plga溶液。

2、再向步骤1所得plga溶液中加入10mg游离的t-res，超声功率为100w，超声时间为2min，进行冰浴超声，得到s/o初级乳液，此为油相。

3、将bsa溶解于适量去离子水中，得到浓度为1%均匀bsa溶液，此为水相，将步骤2中得到的油相，滴加入水相之中，再进行冰浴超声，超声功率为200w，超声时间为5min，以产生最终的s/o/w乳液。

4、为了分散最终的s/o/w乳液，加入30ml去离子水，用磁力搅拌5h以去除残留的有机溶剂，得到纳米载体溶液。

5、把步骤4得到的溶液在15000r/min转速下离心30min后去除上清液，然后加去离子水，重复洗3遍，以真正洗净有机溶剂，然后放进冷冻干燥机，进行冷冻干燥，制好后放4℃备用。

二、测试方法

1、纳米粒的表征

1.1电镜

使用scanningelectronmicroscopy(sem)和atomicforcemicroscope(afm)测量干燥的res-plga-nps的形态和大小。将一滴res-plga-nps的悬浮液滴置于酒精处理过的干净硅片上并在室温（rt）下干燥。

1.2粒径和zeta电位

使用zetasizernano-zs90（malverninstrument，worcestershire，uk）通过动态光散射（dls）测定nuc-plga-nps的粒径和zeta电位。

1.3红外光谱

采用ftir方法通过红外吸收光谱鉴定化合物的结构和组成相关的官能团。用atr附件在波长为4000-400cm-1下检测res，plga，res-plga-nps的红外光谱。

2、体外释放

将10mg的res-plga-nps溶解在去5ml离子水中，然后吸取4ml于透析袋中，将其放置于ph分别为7.4，6.8，1.2的pbs溶液中。在37℃，100rpm的摇床中连续摇动进行体外释放，并在预定的时间间隔后取样，每次抽取1ml，再补充1ml相应ph的pbs溶液。用res的pbs溶液（含有1.5%sds的pbs溶液）的标曲来测定相应释放液中res的含量。

3、油红o染色

为了直观的表现res-plga-nps对hepg2细胞脂肪变性后的脂肪沉积的影响（oa诱导24h后，再与res-plga-nps共同孵育24h，选择未处理的细胞作为对照），采用油红o染色的方法来检测。用磷酸盐缓冲盐水（pbs）轻轻洗涤细胞三次，并用4％多聚甲醛溶液在室温固定15min。随后，用pbs洗涤细胞三次以除去的剩余多聚甲醛溶液，用新鲜制备的油红o染料（在体积比为3：2的双蒸水中稀释）工作溶液在rt下染色30min，最后用60%异丙醇洗2遍以去除浮色，pbs洗3遍后用pbs浸润。在显微镜下拍照观察。

三、结果

图1和图2为res-plga-nps的sem和amf的电镜图。由图可以清晰的看出，该纳米载体呈球形，而且平均粒径在200多纳米左右。

图3为res-plga-nps的粒径分布图。由图可知，res-plga-nps的平均粒径为215.1nm，其pdi为0.174，说明制备的该纳米载体粒径小，而且分散度和稳定性都很好。

图4为res-plga-nps的zeta电位分布图。由图可知，res-plga-nps的zeta电位为-20.3mv，显示为负电荷，而且zeta电位的绝对值数值越大，说明该体系越稳定，越不容易团聚。所以，-20.9mv可以说明该纳米粒溶液体系较稳定。

图5为白藜芦醇（res），plga和res-plga-nps的红外光谱图。其中a为plga，b为res-plga-nps，c为res；由图可以看出plga的特征峰在1757cm-1处，它代表的是c=o键的收缩振动。白藜芦醇（res）由于醇基而在3290cm-1处显示出其特征吸收带代表o-h的伸缩，964.7cm-1的吸收峰代表反式烯烃键，对于c=c伸缩芳环其吸收峰为1583cm-1，对于c-o伸缩其吸收峰为1144cm-1。在res-plga-nps的红外光谱中，可以看到在1757cm-1处和964.7cm-1，1583cm-1，1144cm-1处都有明显的吸收峰，说明plga成功的包载了白藜芦醇（res）。

图6为res-plga-nps中res在不同ph环境下的体外释放曲线。res-plga-nps的res体外释放分别通过模拟胃，肠和静脉里面汁液中的消化条件来检测。如图6所示，rsv在模拟胃液(ph=1.2)和肠液(ph=6.8)的前24小时内快速释放，这可能归因于rsv从纳米粒表面或纳米粒表面附近释放。在第一次快速释放24小时后，释放非常缓慢，在此期间累积释放的比例在人工胃液中上升至37.87％，在人工肠液中上升至50.6％直至216小时。在模拟静脉(ph=7.4)环境下，res在前48小时内迅速释放，达到55.89％，然后在216小时缓慢释放至68％。众所周知，停留在胃和肠道的食物不会超过10小时。该研究的结果表明在此期间药物释放不会超过25％。根据结果，我们得出结论，当口服给药时，胃和肠中的res-plga-nps可以释放出最小量的res。残留物可以在保持有效药物浓度的同时实现持续释放。

图7为不同浓度res-plga-nps对诱导为脂肪肝细胞的hepg2细胞的油红o染色图（图中比例尺均为5µm）。先将hepg2细胞用油酸诱导脂肪变性，然后加入不同浓度res-plga-nps共同孵育，再进行油红o染色。如图7可看出，res-plga-nps对脂肪的抑制作用成浓度依赖性，而且具有显著性。

实施例2

1、将100mgplga溶解于10ml二氯甲烷和丙酮的混合溶剂（体积比二氯甲烷：丙酮=2:3）中，形成均匀的plga溶液。

2、再向步骤1所得plga溶液中加入18mg游离的t-res，超声功率为200w，超声时间为4min，进行冰浴超声，得到s/o初级乳液，此为油相。

3、将bsa溶解于适量去离子水中，得到浓度为1%均匀bsa溶液，此为水相，将步骤2中得到的油相，滴加入水相之中，再进行冰浴超声，超声功率为400w，超声时间为5min，以产生最终的s/o/w乳液。

4、为了分散最终的s/o/w乳液，加入30ml去离子水，用磁力搅拌8h以去除残留的有机溶剂，得到纳米载体溶液。

5、把步骤4得到的溶液在15000r/min转速下离心30min后去除上清液，然后加去离子水，重复洗3遍，以真正洗净有机溶剂，然后放进冷冻干燥机，进行冷冻干燥，制好后放4℃备用。

实施例3

1、将80mgplga溶解于8ml二氯甲烷和丙酮的混合溶剂（体积二氯甲烷：丙酮=1:1）中，形成均匀的plga溶液。

2、再向步骤1所得plga溶液中加入15mg游离的t-res，超声功率为200w，超声时间为3min，进行冰浴超声，得到s/o初级乳液，此为油相。

3、将bsa溶解于适量去离子水中，得到浓度为1%均匀bsa溶液，此为水相，将步骤2中得到的油相，滴加入水相之中，再进行冰浴超声，超声功率为400w，超声时间为5min，以产生最终的s/o/w乳液。

4、为了分散最终的s/o/w乳液，加入30ml去离子水，用磁力搅拌6h以去除残留的有机溶剂，得到纳米载体溶液。

5、把步骤4得到的溶液在15000r/min转速下离心30min后去除上清液，然后加去离子水，重复洗3遍，以真正洗净有机溶剂，然后放进冷冻干燥机，进行冷冻干燥，制好后放4℃备用。

本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。