一种支载核苷类抗肿瘤药物的靶向纳米载体及其制备方法和应用与流程
本发明涉及医药学技术领域，具体涉及一种支载核苷类抗肿瘤药物的靶向纳米载体及其制备方法和应用。
背景技术：
核苷类似物是临床上非常重要的抗肿瘤药物，包括多种嘌呤和嘧啶核苷衍生物，主要用于血液恶性肿瘤和部分实体瘤的治疗。它们属于抗代谢物类药物，与生理性核苷竞争，通过干扰肿瘤细胞的dna合成，或者影响核酸的转录过程，抑制蛋白质的合成，从而达到治疗肿瘤的效果。
迄今为止，至少有15种fda批准的核苷类似物用于治疗各种癌症，占目前癌症化疗药物的近20％，如5-氟尿嘧啶、阿胞糖苷、吉西他滨和地西他滨等。5-氟尿嘧啶作为典型的核苷类似物药物，自1957年首次引入临床以来，已广泛用于治疗各种恶性肿瘤，包括结肠癌、直肠癌、胃癌、乳腺癌、卵巢癌、绒毛膜上皮癌、恶性葡萄胎、头颈部鳞癌、皮肤癌、肝癌、膀胱癌等。作为尿嘧啶抗代谢物，5-氟尿嘧啶或脱氧氟尿苷通过掺入dna或rna来抑制细胞分裂，并通过竞争性结合胸腺嘧啶核苷酸合成酶，阻断脱氧嘧啶核苷酸转换成胸腺嘧啶核苷核来发挥其活性。然而，使用5-氟尿嘧啶或脱氧氟尿苷进行癌症治疗时，其在人体内循环的半衰期短，只有8-20min，而且会出现严重的副作用，如严重的胃肠道毒性反应，食欲减退、恶心、呕吐、口腔炎、胃炎、腹泻等；严重的骨髓抑制毒性，可致白细胞及血小板减少。因此，为了减小药物的毒副作用、克服口服吸收不稳定以及半衰期短等缺点，研究者们对其做了大量的工作，主要包括对5-氟尿嘧啶本身的化学结构修饰工作和纳米材料的载药研究工作。
在化学结构修饰改造方面，研究者为了克服持续静脉输注给患者带来的静脉炎、静脉插管相关并发症等问题，对5-氟尿嘧啶的结构进行了不断的改造，开发出便捷、等效、安全性高的口服5-氟尿嘧啶衍生抗肿瘤药，如替加氟、脱氧氟尿苷、氟尿苷、卡莫氟和卡培他滨等。为了维持血浆和肿瘤组织中稳定的血药浓度，研究者通过加入二氢嘧啶脱氢酶抑制剂组成复方抗肿瘤药物应用于临床治疗，如替吉奥、优氟啶等。尽管这些5-氟尿嘧啶衍生物已经应用于临床治疗，且毒性均比5-氟尿嘧啶低，但对肿瘤细胞无选择性，故都不能避免对正常组织的损害；为了增强5-氟尿嘧啶与肿瘤细胞的亲和性，氨基酸、短肽、吡啶或多糖等被研究者通过化学合成手段与5-氟尿嘧啶连接起来，实现了药物的缓释和较低的毒副作用，提高了药物的生物利用度，目前仍处于实验阶段，尚未能够应用于临床。
化疗药物的纳米材料装载、运输、释放已经成为抗肿瘤药物的前沿和热点研究领域之一，以生物医用大分子作为载体，将5-氟尿嘧啶连接于其上，制成前药送入体内，再通过大分子材料的断裂和体内生物酶的降解，使药物在体内缓慢的释放出来，从而减少给药次数和用量，有效的提高5-氟尿嘧啶药效，降低副作用。这些被研究的纳米材料包括如碳纳米管、微孔沸石、水凝胶、壳聚糖、脂质体和聚合物等。然而，对于无机纳米材料来说，它们通常含有有毒元素或残留物，并且难以降解。这些有毒元素或残留物在某些组织中长期积累后，存在安全问题风险或潜在的副作用；而对于有机纳米材料来说，由它们所构建的纳米载药颗粒在大小、组成和表面化学修饰方面都是不均匀的，这导致了其药物包覆性能不理想，缺乏组织特异性和潜在毒性的问题。因此，如何改善纳米材料的生物相容性和降解性以及减少纳米材料的毒性是目前关于药物输送系统研究的热点问题。
近年来，针对肿瘤细胞的靶向治疗正在成为抗肿瘤药物研制的重要方向，这类药物主要作用于肿瘤细胞上的特异性受体，一方面提高对肿瘤细胞的杀伤力，另一方面减少对正常组织和细胞的不良反应。靶向治疗主要包括抗原-抗体介导的靶向肿瘤治疗和配体-受体介导的靶向肿瘤治疗。靶向抗体药物在癌症治疗上已经取得了较大的成功，有13个抗体靶向药物被fda批准用于抗肿瘤的临床治疗，如用于结直肠癌治疗的西妥昔单抗和帕尼单抗，用于乳腺癌治疗的曲妥珠单抗和帕妥珠单抗等。但在临床应用过程中存在杀伤力差、易产生耐药性等不足，常需要与化疗药物联合使用。因此，抗体偶联药物(antibodydrugconjugate，adc)的开发越来越受到研究者的追捧，该药物是将特异性靶向肿瘤细胞的抗体与细胞毒性药物通过linker进行连接的一类治疗药物，实现了小分子化疗与抗体靶向治疗的联合用药，为肿瘤的精准治疗提供了一种新的途径。但adc药物的开发难度很大，主要受阻于靶向抗体的人源化改造、小分子药物的筛选和linker的偶联效率等，目前仅有2种adc药物在欧美发达国家上市，包括以cd30和her2为靶标的adcetris(sgn-35)和kadcyla(t-dm1)。另外，adc药物中的单克隆抗体分子量很大(150kda)，通过毛细血管内皮层和穿过肿瘤细胞外间隙均受到限制，影响其发挥药效；且大多数adc药物所偶联的药物分子与抗体分子的摩尔比例平均保持在3-4之间，载药水平较低。
配体-受体结合是体内一种特殊的识别机制，具有高特异性、高选择性和高亲和性的特点，将化疗药物标记到配体上，使之成为靶向药物，与高密度表达的肿瘤细胞上的受体结合，再通过受体介导的胞吞作用，使化疗药物进入肿瘤细胞发挥其治疗作用，这大大减轻了药物对正常组织的毒副作用。人表皮生长因子受体-2(her-2)是近年来乳腺癌靶向治疗的一个极有吸引力的靶标。所有乳腺癌患者中大约有25％-30％的患者表现为her-2过度表达，而这经常与细胞增殖、细胞生存、侵袭性和转移性、抗原活性增加等密切相关。her-2特异性的亲和配体—affibody是一种功能类似于抗体的小分子骨架蛋白，由58个氨基酸残基组成，相对分子质量约为6.5×103，结构中含有3个α-螺旋。与单克隆抗体相比，affibody分子具有更小的尺寸、更快的肿瘤靶向能力和更高的细胞、组织穿透能力，因此，它已被应用于各种载体，包括脂质体，纳米颗粒，生物聚合物和腺病毒载体等。
阿霉素是一种广谱抗肿瘤药，目前文献中报道了一种dna-affibody-阿霉素靶向纳米药物，且表现出了比阿霉素对her2高表达的乳腺癌细胞更强的选择性和抑制作用。然而，在实验过程中，我们发现通过将阿霉素插入dna纳米结构的载药方式，难以精确控制载药数量。而且，dna-affibody与阿霉素之间的非共价键很弱，在操作过程中很容易被破坏。因此，研究一种具有精确载药量和生物相容性的靶向纳米抗肿瘤药物具有重要意义。
技术实现要素：
本发明的目的之一在于提供一种支载核苷类抗肿瘤药物的靶向纳米载体，以解决现有抗肿瘤药物载体系统载药量难以控制、生物相容性和降解性差、副反应严重以及药效发挥不理想的问题。
本发明的目的之二在于提供一种支载核苷类抗肿瘤药物的靶向纳米载体的制备方法和应用。
本发明的目的之一是通过以下技术方案实现的：一种支载核苷类抗肿瘤药物的靶向纳米载体，包括：
dna四面体，为由四条dna单链以碱基互补配对原则自组装形成；
affibody分子，为与her2受体特异性结合的小分子蛋白配体，其通过linker连接于dna单链的3’端；以及
核苷类抗肿瘤药物，其通过dna固相合成技术整合到形成dna四面体的四条dna单链中，每条dna单链中插入的核苷类抗肿瘤药物的数目为1-100。
所述四条dna单链的核苷酸序列分别如seqidno.1、seqidno.2、seqidno.3、seqidno.4所示。
所述linker为6-(马来酰亚胺基)己酸琥珀酰亚胺酯，所述affibody分子的偶联个数为1-4个。
所述核苷类抗肿瘤药物为脱氧氟尿苷、5-氟尿嘧啶核苷、阿糖胞苷、吉西他滨、氯法拉滨、氟达拉滨、奈拉滨、地西他滨、阿扎胞苷和阿卡地新中的一种。
所述靶向纳米载体的粒径小于20nm。
本发明提供了上述支载核苷类抗肿瘤药物的靶向纳米载体的制备方法，包括以下步骤：
a、将核苷类抗肿瘤药物进行亚磷酰胺修饰，从而转换成相应的核苷类抗肿瘤药物亚磷酰胺中间体用于dna固相合成技术；所述的核苷类抗肿瘤药物亚磷酰胺中间体的结构式为：
其中，式ⅰ中r1为f或h，r2为f或h；式ⅰ、式ⅱ和式ⅲ中base的结构为如下结构的一种：
针对不同的核苷类抗肿瘤药物亚磷酰胺中间体，选择如下所示的合成路线进行合成：
合成路线1：
合成路线2：
b、利用dna固相合成技术合成四种dna单链，并将所述的核苷类抗肿瘤药物整合到四种dna单链的5’端，在其中一种dna单链的3’端修饰nh2，其余dna单链不做修饰，产物经纯化后得到含有核苷类抗肿瘤药物的四种dna单链；
所述dna固相合成过程如下：
第一步，将预先连接在固相载体(通常是cpg)上的活性基团被保护的核苷酸与三氯乙酸反应，脱去其5′-羟基的保护基团dmt，获得游离的5′-羟基；
第二步，合成dna的原料(亚磷酰胺保护的核苷酸单体)，并与活化剂四氮唑混合，得到核苷亚磷酸活化中间体，它的3′端被活化，5′-羟基仍然被dmt保护，将其第一步中游离的5′-羟基发生缩合反应；
第三步，在氧化剂碘的作用下，亚磷酰形式转变为更稳定的磷酸三酯；
第四步，带帽反应，缩合反应中可能有极少数5′-羟基没有参加反应(少于2％)，用乙酸酐和1-甲基咪唑终止其后续反应，这种短片段可以在后续纯化环节中被分离掉；
经过以上四个步骤，一个脱氧核苷酸被连接到固相载体的核苷酸上。再以三氯乙酸脱去它的5′-羟基上的保护基团dmt，重复以上步骤，直到dna单链所有核苷酸以及所需支载的核苷类抗肿瘤药物都被连接上。合成过程中可以观察tca处理阶段的颜色判定合成效率。通过氨水高温处理，连接在cpg上的片段被切下来，通过opc、page等手段纯化片段，成品片段用c18浓缩，脱盐，沉淀。沉淀后的片段用水悬浮，测定od260定量，并根据要求分装。
通过dna固相合成技术合成的含有核苷类抗肿瘤药物的dna序列如下：
a13f-nh2:’-nnacactacgtcagaacagcttgcatcactggtcaccagagta-nh2-3’；
b13f:5’-nnacgagcgagttgatgtgatgcaagctgaatgcgagggtcct-3’；
c13f:5’-nntcaactcgctcgtaactacactgtgcaatactctggtgacc-3’；
d13f:5’-nntctgacgtagtgtatgcacagtgtagtaaggaccctcgcat-3’。
注：n表示核苷类抗肿瘤药物；n为核苷类抗肿瘤药物的连接个数，其中1<n<100。
经dna固相合成得到四种dna单链的冻干粉，保存于-20℃备用。
c、将affibody分子通过linker连接于上述nh2修饰的dna单链的3’端，产物经离子交换层析、镍柱亲和层析和脱盐柱纯化后得到dna-affibody嵌合体；
affibody分子的氨基酸序列如下：
mihhhhhhlqvdnkfnkemrnayweiallpnlnnqqkrafirslyddpsqsanllaeakklndaqapkvdc.。
affibody分子在大肠杆菌bl21(de3)细胞中进行表达生产，iptg诱导浓度为1mm，诱导时间为16h，诱导温度为30℃。诱导表达完成后，6000rpm离心收获细胞，高压破碎、离心获得含有affibody的破碎上清液，利用亲和层析一步纯化获得affibody分子。
将3’端修饰nh2的dna单链溶解于磷酸盐缓冲液(pbs)，并加入含有6-(马来酰亚胺基)己酸琥珀酰亚胺酯(emcs)的二甲基亚砜溶液，反应完毕后，加入预冷乙醇低温沉淀dna，离心，弃上清，pbs重新溶解。加入靶向配体affibody分子溶液进行偶联反应，反应完毕后，使用离子交换层析、镍柱亲和层析和脱盐柱进行dna-affibody嵌合体的纯化，其反应路线如下所示：
注：f代表核苷类抗肿瘤药物；p代表它们之间通过磷脂键连接。
d、将所述dna-affibody嵌合体和其他三种dna单链以摩尔比1:1:1:1混合，然后置于pcr仪中，按75℃加热10min、4℃冷却20min、10℃保持10min的温控程序运行，运行完毕后取出，得到支载核苷类抗肿瘤药物的dna四面体-affibody靶向纳米载体，其自组装过程如下所示：
步骤c中，所述linker为6-(马来酰亚胺基)己酸琥珀酰亚胺酯，所述affibody分子的偶联个数为1-4个。
步骤c中，在所述affibody分子的c端引入半胱氨酸，利用半胱氨酸的巯基与6-(马来酰亚胺基)己酸琥珀酰亚胺酯的活性基团连接；在所述affibody分子的n端引入组氨酸标签，以使其可以通过镍柱亲和层析进行分离纯化。
所述四种dna单链的核苷酸序列分别如seqidno.1、seqidno.2、seqidno.3、seqidno.4所示；所述核苷类抗肿瘤药物为脱氧氟尿苷、5-氟尿嘧啶核苷、阿糖胞苷、吉西他滨、氯法拉滨、氟达拉滨、奈拉滨、地西他滨、阿扎胞苷和阿卡地新中的一种；所述靶向纳米载体的粒径小于20nm。所述核苷类抗肿瘤药物的结构如下所示：
尿嘧啶核苷类似物：
胞嘧啶核苷类似物：
鸟嘌呤核苷类似物：
腺嘌呤核苷类似物：
本发明还提供了上述支载核苷类抗肿瘤药物的靶向纳米载体在制备针对her2高表达肿瘤细胞的抗肿瘤药物中的应用。
与现有技术相比，本发明有以下有益效果：
1、本发明的靶向纳米载体以dna四面体作为载体材料，避免了其他有机材料或无机材
料所带来的毒副作用，且具有高度的生物相容性和可降解性。
2、本发明的靶向纳米载体是将核苷类抗肿瘤药物利用dna固相合成技术，使药物分子与dna四面体-affibody之间通过磷脂键共价连接，这种制备方法可以精确控制药物的结合数量和稳定的载药结构。
3、本发明的靶向纳米载体通过affibody分子与肿瘤细胞上的her2受体结合，利用配体-受体介导的胞吞作用将药物纳入细胞发挥作用，减少对正常细胞的毒副作用。
4、本发明的靶向纳米载体粒径小，具有更快的肿瘤靶向能力和更高的细胞、组织穿透能力，药效好。
5、本发明制备方法简单，利用dna固相合成技术实现自动合成，合成产物便于纯化分离，适宜推广应用。
6、本发明的靶向纳米载体是一种主动靶向的纳米药物，能够进一步负载和递送其他高效抗肿瘤药物对癌症进行多药联合治疗。
附图说明
图1.affibody亲和层析纯化后的sds-page分析，其中，1为亲和层析的穿透峰；2为亲和层析的洗脱峰。
图2.dna-affibody嵌合体captodeae柱层析纯化后的电泳分析，其中，1为穿透峰；2为500mmnacl洗脱峰1；3为500mmnacl洗脱峰2；4为1000mmnacl洗脱峰。
图3.dna-affibody嵌合体histraptmhp柱亲和层析纯化后的电泳分析，其中，1为穿透峰；2为洗脱峰1；3为洗脱峰2。
图4.纯化的dna-affibody嵌合体的电泳分析，其中，1为纯化后的dna-affibody嵌合体；2为dna单链a13f；3为affibody分子。
图5.支载寡聚氟尿苷的dna四面体-affibody纳米载体的电泳分析结果，其中，m为dnamarker-b；1为dna单链a13f；2为a13fdna-affibody嵌合体；3为dna四面体；4为支载寡聚氟尿苷的dna四面体；5为支载寡聚氟尿苷的dna四面体-affibody纳米颗粒。
图6.支载寡聚氟尿苷的dna四面体-affibody纳米载体的原子力显微镜鉴定结果图。
图7.支载寡聚氟尿苷的dna四面体-affibody纳米载体的稳定性分析图。
图8.支载寡聚氟尿苷的dna四面体-affibody纳米载体的细胞摄入分析图。
图9.支载寡聚氟尿苷的dna四面体-affibody纳米载体的细胞毒性分析结果图。
具体实施方式
下面通过实施例详细说明本发明，下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1核苷类抗肿瘤药物亚磷酰胺中间体的合成
为了将核苷类抗肿瘤药物整合到dna单链中，核苷类抗肿瘤药物首先要通过化学合成，转换成相应的亚磷酰胺中间体的形式。下面以脱氧氟尿苷为例，按下面合成路线进行亚磷酰胺中间体的合成。
首先，称取4,4-双甲氧基三苯甲基氯(dmt-cl)(1.860g，5.5mmol)和脱氧氟尿苷(1.231g，5mmol)，加入50ml无水吡啶，搅拌均匀，室温搅拌反应4h。然后加入5ml甲醇，继续搅拌反应30min。减压旋蒸除去溶剂，柱层析分离产物，得到白色粉末(化合物2)，产率80％。1hnmr(400mhz,dmso-d6)δ(ppm):11.86(1h,brs,nh),7.88(1h,d,j＝6.8hz,ch),7.39(2h,m,aromh),7.27(7h,m,aromh),6.89(4h,m,aromh),6.14(1h,dd,j＝6.6,5.2hz,ch),5.33(1h,brs,oh),4.27(1h,m,ch),3.89(1h,m,ch),3.74(6h,s,-och3),3.29-3.10(2h,m,ch2),2.29-2.12(2h,m,ch2).13cnmr(100mhz,dmso-d6)δ(ppm):158.57(overlap,2c),1c(157.61,157.35),149.39,145.23,1c(141.59,139.29),135.90,135.75,10c(130.17,128.33,128.08,127.19,125.15,124.82),113.69(overlap,4c),86.26,86.03,84.96,70.50,64.11,55.47,55.38,solventc&1c(40.60,40.39,40.19,39.98,39.77,39.56,39.35).hrms:(esi)[m+na]+calcd.forc30h29fn2o7,571.1856,found571.1852.
其次，称取化合物2(1.0g，1.824mmol)溶于无水二氯甲烷(dcm)(20ml)，并加入含有2-氰乙基n,n,n′,n′-四异丙基亚磷酰二胺(0.587ml，2.360mmol)和1h-四唑(165.3mg，2.360mmol)的乙腈溶液，氩气保护，室温下搅拌反应1h。反应混合物减压旋蒸除去溶剂，柱层析分离产物，得到白色粉末(化合物3)，产率60％。1hnmr(400mhz,dmso-d6)δ(ppm):11.89(1h,brs,nh),8.00-7.90(1h,m,ch),7.45-7.38(2h,m,aromh),7.35-7.19(7h,m,aromh),6.93-6.84(4h,m,aromh),6.22-6.09(1h,m,ch),4.70-4.34(1h,m,ch),4.10-3.97(1h,m,ch),3.74(6h,d,j＝2.3hz,-och3),3.68-3.58(2h,m,ch2),3.59-3.42(2h,m,ch),3.39-3.17(2h,m,ch2),2.80-2.61(2h,m,ch2),2.48-2.24(2h,m,ch2),1.19-0.93(12h,m,ch3).13cnmr(100mhz,dmso-d6)δ(ppm):158.63(overlap,2c),1c(157.63,157.37),149.38,145.14,1c(141.66,139.36),135.79,135.69,135.66,10c(130.19,130.17,128.31,128.11,128.07,127.22,125.39,125.20,125.05,124.86),1c(119.41,119.22),113.66(overlap,4c),3c(86.43,86.35,85.09,85.05,84.67),1c(73.10,72.92,72.67,72.52),1c(63.66,63.45),1c(58.91,58.86,58.72,58.68),55.47(overlap,2c),43.12,43.00,solventc(40.61,40.40,40.19,39.98,39.77,39.56,39.36),1c(38.77,38.62),4c(24.83,24.76,24.72,24.65,24.58),1c(20.33,20.28,20.21).hrms:(esi)[m+h]+calcd.forc39h46fn4o8p,749.3116,found749.3456.
以吉西他滨为例，按下面合成路线进行亚磷酰胺单体的合成。首先，称取4,4-双甲氧基三苯甲基氯(dmt-cl)(3.38g，10mmol)和吉西他滨(2.63g，10mmol)，加入50ml无水吡啶，搅拌均匀，室温搅拌反应4h。然后加入5ml甲醇，继续搅拌反应30min。减压旋蒸除去溶剂，柱层析分离产物，得到白色粉末(化合物2)，产率80％。1hnmr(600mhz,cdcl3):3.42(dd,1h,j＝12hz),3.49(dd,1h,j＝8.4hz),3.69(s,6hz),4.04(dd,1h,j＝5.4hz),4.41(dd,1h,j＝8.4hz),5.51(dd,1h,j＝7.2hz),6.31(s,1h)6.78(d,4h,j＝14.4hz)7.14(t,1h,j＝7.2hz),7.22(t,2h,j＝7.8hz),7.28(d,4h,j＝9hz),7.38(d,2h,j＝7.8hz),7.63.42(d,1h,j＝6.6hz).13cnmr:162.81,158.46,155.86,144.50,143.09,136.02,130.33,129.17,128.48,127.24,113.38,95.70,91.07,87.18,79.96,71.96,66.51.
其次，称取化合物2(2.83g，5mmol)溶于无水二氯甲烷(dcm)(20ml)，diepa(0.78g,6mmol)溶于30ml无水dcm中；向反应液中滴加2-氰乙基n,n-二异丙基氯代亚磷酰胺(1.21g,5.1mmol)的无水dcm溶液10ml，于氩气保护下，室温搅拌，tlc监测反应直至反应完成。用50mldcm稀释，用饱和食盐水洗涤(100ml×3)，有机相用无水na2so4干燥，减压旋蒸去除溶剂，用柱层析分离产物，得到白色粉末(化合物3)，产率60％。1hnmr(600mhz,dmso-d6):1.14(s,12h),2.57(t,2h,j＝6hz),3.26(q,1h),3.54(q,1h),3.63(m,2h),3.88(s,6h),4.05(q,2h),4.39(m,1h),4.77(m,1h),6.09(d,1h,j＝13.2hz),6.39(t,1h,j＝25.2hz),6.53(s,2h),6.94(d,4h,9hz),7.27(m,3h),7.348(m,2h),7.40(d,4h,j＝9hz),8.25(d,1h,j＝13.2hz).13cnmr(600mhz,dmso-d6):162.81,158.46,155.86,144.55,143.09,136.02,129.17,127.24,118.94,113.38,95.70,90.93,87.18,77.52,77.15,65.91,59.03,56.04.
再次，在三颈瓶中加入化合物3(24.32g，100mmol)和dmf200ml,搅拌得白色悬浮液,滴加苯甲酸酐10.4ml(110mmol),于室温反应18h得澄清液，tlc监测反应直至反应完成。用50mldcm稀释，用饱和食盐水洗涤(100ml×3)，有机相用无水na2so4干燥，减压旋蒸去除溶剂，用柱层析分离产物，得到白色粉末(化合物4)，产率70％。1hnmr(600mhz,dmso-d6):1.17(s,12h),1.98(s,3h),2.61(t,2h,j＝4.8hz),3.28(q,1h),3.53(q,1h),3.78(m,2h),3.87(s,6h),4.13(m,2h),4.39(m,1h),4.84(m,1h),6.39(m,2h),6.62(s,1h),6.93(d,4h,9hz),7.29(m,3h),7.36(d,1h,3.6hz),7.38(d,6h,j＝9hz),8.32(d,1h,j＝13.2hz).13cnmr(600mhz,dmso-d6):174.09,158.46,155.58,143.37,129.17,127.24,118.94,113.38,96.17,90.93,87.18,77.15,65.9150.04,44.20,23.31,22.93,22.89.
实施例2支载寡聚核苷类抗肿瘤药物的dna单链的合成
将寡聚脱氧氟尿苷(n＝10)序列通过dna固相合成技术连接于dna四面体的四种dna单链的5’端(f代表脱氧氟尿苷)，在其中一种dna单链3’端修饰nh2。各dna单链的核苷酸序列如下：
a13f-nh2:
5’-ffffffffffacactacgtcagaacagcttgcatcactggtcaccagagta-nh2-3’；
b13f:5’-ffffffffffacgagcgagttgatgtgatgcaagctgaatgcgagggtcct-3’；
c13f:5’-fffffffffftcaactcgctcgtaactacactgtgcaatactctggtgacc-3’；
d13f:5’-fffffffffftctgacgtagtgtatgcacagtgtagtaaggaccctcgcat-3’。
经dna合成得到四种dna单链的冻干粉，保存于-20℃备用。
将寡聚吉西他滨(n＝16)序列通过dna固相合成技术连接于dna四面体的四种dna单链的5’端(f代表脱氧氟尿苷)，在其中一种dna单链3’端修饰nh2。各dna单链的核苷酸序列如下：
a13gem-nh2:
5’-gemgemgemgemgemggemgemgemgemgemggemgemgemgemgemgemacactacgtcagaacagcttgcatcactggtcaccagagta-nh2-3’；
b13gem:
5’-gemgemgemgemgemggemgemgemgemgemggemgemgemgemgemgemacgagcgagttgatgtgatgcaagctgaatgcgagggtcct-3’；
c13gem:
5’-gemgemgemgemgemggemgemgemgemgemggemgemgemgemgemgemtcaactcgctcgtaactacactgtgcaatactctggtgacc-3’；
d13gem:
5’-gemgemgemgemgemggemgemgemgemgemggemgemgemgemgemgemtctgacgtagtgtatgcacagtgtagtaaggaccctcgcat-3’。
经dna合成得到四种dna单链的冻干粉，保存于-20℃备用。
实施例3affibody分子的发酵生产和纯化
用于此实施例的affibody分子的序列为：
mihhhhhhlqvdnkfnkemrnayweiallpnlnnqqkrafirslyddpsqsanllaeakklndaqapkvdc.
affibody在大肠杆菌bl21(de3)细胞中进行表达生产。种子液培养条件为：37℃，200rpm振荡，80mllb培养基(100μg/ml氨苄青霉素)中培养液10小时。5l发酵罐培养条件为：10％(v/v)接种量，接种到装有2.0llb培养基(100μg/ml氨苄青霉素)的5l发酵罐中。同时，向培养基中加入0.5mm终浓度的iptg并将温度降至30℃。在整个发酵培养过程中，通过自动加入氨水溶液将培养液ph保持在7.0。发酵完毕后，离心获得含有affibody的大肠杆菌，将含有affibody的大肠杆菌悬浮在含有300mmnacl和10mm咪唑的50mmtris-hcl(ph8.0)中，随后用超高压细胞破碎机进行细胞破碎。细胞破碎液在15000g的转速下离心30分钟，上清液用0.45μm滤膜过滤去除细胞碎片。采用
实施例4支载寡聚脱氧氟尿苷的dna-affibody嵌合体的合成
将dna单链a13f-nh2(261.6μg，16.8nmol)溶于200μl磷酸盐缓冲液(pbs,10mmpo43-、137mmnacl、2.7mmkcl)中，向其中加入20μl含有50mmemcs的dmso。37℃反应3h，加入22μl(3m)醋酸钠，停止反应。在加入600μl预冷乙醇并在-20℃下放置30分钟后，15000g，30min离心。沉淀用70％的乙醇洗涤。洗涤后将dna溶于200μl的pbs溶液中，再向其中加入含有1500μg(180nmol)affibody的1500μlpbs溶液，室温反应1-5h，得到反应混合物。
反应混合物在captodeae柱(1ml，gehealthcare)上纯化，并用含有500mm和1000mmnacl的tris-hcl(10mm，ph8.0)缓冲液洗脱。采用10％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析纯化的dna-affibody嵌合体。纯化结果由图2可以看出，dna-affibody嵌合体主要集中在500mmnacl的tris-hcl(10mm，ph8.0)洗脱液中，收集该部分洗脱液用于下一步分离。
将上一步骤分离的含有dna-affibody嵌合体的洗脱液通过ni-亲和色谱柱继续纯化。将上步洗脱液加样到histraptmhp柱(1ml，gehealthcare)上，然后用含有300mmnacl和10mm咪唑的50mmtris·hcl(ph8.0)缓冲液将柱子洗涤5倍柱体积。最后，histraptmhp柱用含有300mmnacl和150mm咪唑的50mmtris-hcl(ph8.0)缓冲液洗脱。采用10％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析纯化的dna-affibody嵌合体。纯化结果由图3可以看出，dna-affibody嵌合体主要集中在150mm咪唑的50mmtris-hcl(ph8.0)洗脱液中，收集该部分洗脱液用于下一步分离。
使用超滤离心过滤器(相对分子质量截止10kda)获得浓缩的纯化后的dna-affibody嵌合体，采用12％sds-page凝胶电泳检测浓缩后的dna-affibody嵌合体，并分别用考马斯亮蓝和gelred染色，从图4结果可以看出，dna-affibody嵌合体既可以被考马斯亮蓝染色，也可以被gelred染色，且纯度>90％，表明dna-affibody嵌合体偶联成功。该浓缩后的嵌合体在4℃下保存用于下一步试验。
实施例5支载寡聚脱氧氟尿苷的dna-affibody四面体的合成
将上步纯化得到的a13fdna-affibody嵌合体(10.0nmol)，b13f(10.0nmol)，c13f(10.0nmol)，d13f(10.0nmol)加入8ml、10mmtris·hcl，ph8.0，含12mmmgcl2，70℃反应10min，立即置于冰上，放置10min。反应完毕后，将dna混合液置于室温放置10min，即得到载有寡聚脱氧氟尿苷的dna-affibody四面体。将获得的dna-affibody四面体用10％非变性聚丙烯酰胺电泳进行分析，结果如图5所示，非变性聚丙烯酰胺凝胶显示所形成的每个dna纳米结构均有一条明显的条带，并且它们的迁移率随着dna链的修饰和affibody分子的偶联而显着降低。寡聚脱氧氟尿苷的dna-affibody四面体的分子量最大，迁移率最慢，与预期结果一致。
实施例6支载寡聚脱氧氟尿苷的dna-affibody四面体的原子力显微镜鉴定
对载有寡聚脱氧氟尿苷的dna-affibody四面体进行原子力显微镜成像。将10μl样品(10nm)沉积在新鲜剥离的云母表面5分钟。接下来，在云母中加入40mltae/mg2+缓冲液(50mmtris-hcl，20mm乙酸，2mmedta，12mmmgcl2，ph8.0)，然后在室温下自然干燥。样品用原子力显微镜(agilenttechnologies，5500afm/spmsystem，usa)成像。原子力显微镜图像(图6)显示，载有寡聚脱氧氟尿苷的dna-affibody四面体之间具有高度一致性，表明寡聚的脱氧氟尿苷和affibody不妨碍dna四面体的形成，且该dna-affibody纳米结构约为12-20nm之间。
实施例7支载寡聚脱氧氟尿苷的dna-affibody四面体的稳定性分析
将载有寡聚脱氧氟尿苷的dna-affibody四面体和单链dna(各100μg/ml)的溶液分别与等体积的未热灭活的胎牛血清(fbs)混合并在37℃孵育。孵育时间为0、1、2、4和8h。孵育后将混合物用10％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析。由图7的结果可以看出，当在37℃下孵育4小时时，通过凝胶电泳观察，载有寡聚脱氧氟尿苷的dna-affibody四面体的条带强度几乎没有变化，表明该纳米结构在fbs中保持了完整；孵育8小时后，条带开始弥散，表明该纳米结构部分降解。相反，在孵育2小时内，单链dna几乎完全被fbs中的核酸酶降解。因此，这些结果表明，dna-affibody四面体可以作为药物载体，将药物转运至癌细胞胞内。
实施例8支载寡聚脱氧氟尿苷的dna四面体-affibody靶向纳米药物的细胞摄入评估
bt474细胞使用含有10％胎牛血清的rmpi-1640培养基，mcf-7细胞使用含有10％胎牛血清的dmem培养基进行培养。所有细胞的培养条件为37℃，5％浓度的co2。采用对数生长期的细胞，在37℃下分别将bt474细胞和mcf-7细胞(1×105个细胞/ml)铺到玻璃底培养皿中。孵育24h后，移除培养基，加入500μl含有5μm羧基荧光素(fam)的dna-affibody四面体的培养基，继续培养1小时。再次移除培养液，用pbs洗涤细胞3次。之后，用4％的多聚甲醛在室温下固定20分钟，再次用pbs洗涤3次。最后，用2.5μg/mldapi溶液在37℃染色30min，然后用pbs冲洗2次。使用zeiss激光扫描共焦显微镜(zeisslsm880)获得荧光图像。由图8中细胞内的荧光强度可知，her2高表达细胞bt474细胞摄入dna-affibody四面体的量是her2低表达细胞mcf-7的3倍，说明本发明dna-affibody四面体具有很强的靶向性。
实施例9支载寡聚脱氧氟尿苷的dna四面体-affibody靶向纳米药物的细胞毒性评估
我们使用mtt法来定量评估支载寡聚脱氧氟尿苷的dna四面体-affibody靶向纳米药物的细胞毒性。bt474细胞使用含有10％胎牛血清的rmpi-1640培养基，mcf-7细胞使用含有10％胎牛血清的dmem培养基进行培养。所有细胞的培养条件为37℃，5％浓度的co2。收获指数生长期的bt474细胞和mcf-7细胞，并以8×103个细胞/孔的浓度，将对数期的bt474细胞和mcf-7细胞铺在96孔板上，每孔100μl。在37℃条件下，将培养板放在培养箱内预培养24h，向培养板中加入不同浓度的支载寡聚脱氧氟尿苷的dna-affibody四面体，分别处理细胞48h，72h，然后向每孔中加入10μlmtt(5mg/ml)，注意不要有气泡出现，并将96孔板在37℃继续培养4小时。弃去上清液，向各孔中加入100μl的dmso，15min后在570nm处吸光度。数据为三次平行实验的平均值。
计算公式为：
细胞存活率＝[(as-ab)/ac-ab)]x100％
抑制率＝[(ac-as)/ac-ab)]x100％
as：药物孔吸光值；
ac：对照孔吸光值；
ab：空白孔吸光值。
由实验结果(图9)可知，与pbs处理的阴性对照相比，游离的脱氧氟尿苷分别在48和72小时后使bt474细胞的活力降低约25％和31％(10μm浓度)。然而，通过磷脂键支载寡聚脱氧氟尿苷后，在不同的处理时间(48小时和72小时)，不同的药物浓度(2μm，5μm和10μm)时，载药的dna四面体本身表现出比游离的脱氧氟尿苷对bt474细胞和mcf-7细胞更高的细胞毒性。在250nm浓度(含10μm脱氧氟尿苷)的bt474细胞中显示比游离脱氧氟尿苷高出0.3-0.9倍的细胞毒性，48和72小时孵育后其细胞活力分别降低约42％和约58％的活力。值得注意的是，由于affibody的主动靶向性作用，支载寡聚脱氧氟尿苷的dna四面体-affibody靶向纳米药物对her2过表达细胞系引起了更显着的细胞毒性。该靶向纳米药物在250nm(脱氧氟尿苷10μm)的浓度下处理bt474细胞48小时和72小时后，其细胞毒性是游离药物的2.6倍，分别只有约37％和19％的细胞存活率，表明支载寡聚脱氧氟尿苷的dna四面体-affibody靶向纳米药物对her2过表达细胞系呈现出更高的细胞特异性。对于her2低表达mcf-7细胞，支载寡聚脱氧氟尿苷的dna四面体和支载寡聚脱氧氟尿苷的dna四面体-affibody靶向纳米药物处理72小时后，在250nm(含10μm脱氧氟尿苷)浓度下比游离脱氧氟尿苷具有更高的抑制率。然而，两种载有脱氧氟尿苷的dna纳米药物在mcf-7细胞中的抑制率相当，分别为55％和53％，说明affibody靶向作用在her2低表达mcf-7细胞中不会增强其自身的细胞杀伤能力。因此，结果表明支载寡聚脱氧氟尿苷的dna四面体-affibody靶向纳米药物对her2受体具有高度特异性，表现出对her2过表达细胞系的靶向脱氧氟尿苷递送能力，这对于癌症靶向治疗和应用是非常重要的。
sequencelisting
<110>河北大学
<120>一种支载核苷类抗肿瘤药物的靶向纳米载体及其制备方法和应用
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