丝素蛋白-多巴胺-E7短肽复合支架及其制备方法和应用与流程

本发明涉及组织工程领域，具体涉及一种丝素蛋白-多巴胺-e7短肽复合支架及其制备方法和应用。

背景技术：

细胞在体内生存的微环境大多是由胶原纤维及其他细胞表面构成的纳米支架结构，除蛋白质是调节细胞生命活动的重要因素外，纳米级的支架结构界面是另一重要因素。

静电纺丝制备的纳米纤维有利于细胞的植入、贴附、营养物质的渗入及代谢废物的排出,为细胞的生长、增殖提供了良好的微环境,从而可以增强细胞的黏附、迁移、增殖及分化功能。

丝蛋白是天然高分子材料，无毒副作用，但是丝蛋白本身的成骨诱导性能较弱，本领域尚需对丝蛋白静电纺丝支架进行深入研究，以便其有利于在骨组织再生领域应用。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种丝素蛋白-多巴胺-e7短肽复合支架及其制备和应用。

本发明第一方面，提供一种丝素蛋白-多巴胺-e7短肽复合支架，所述复合支架包含丝素蛋白多孔支架，e7短肽通过多巴胺接枝于所述丝素蛋白多孔支架上。

在另一优选例中，所述复合支架的孔隙率为80％-90％，较佳为82％-85％。

在另一优选例中，所述复合支架的平均孔径为5-20μm，较佳为15μm。

在另一优选例中，制备所述复合支架需要的所述丝素蛋白、多巴胺、e7短肽的投料质量比为100:0.5-1.5:5-10，较佳为100:1:9。

在另一优选例中，所述复合支架的所述复合支架的接触角为25-35°，较佳为31.1±1.8°。

在另一优选例中，所述复合支架的所述复合支架由直径为200-500nm的纤维构成。

本发明第二方面，提供第一方面所述的复合支架的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：

(i)通过静电纺丝制备丝素蛋白多孔支架；

(ii)将所述丝素蛋白多孔支架浸渍于多巴胺溶液中，获得丝素蛋白-多巴胺支架；

(iii)将所述丝素蛋白-多巴胺支架浸渍于e7短肽溶液中，形成丝素蛋白-多巴胺-e7短肽复合支架。

在另一优选例中，所述静电纺丝包括以下步骤：

(a)配制丝素蛋白溶液，将所述丝素蛋白溶液装于注射泵；

(b)在电场作用下，所述丝素蛋白溶液经注射泵针头出口喷出，采用滚筒接收器接收丝素蛋白丝；

(c)收集所述丝素蛋白丝并干燥获得所述丝素蛋白多孔支架。

在另一优选例中，丝素蛋白溶液的浓度为5-25w/v％；溶剂选自下组：六氟异丙醇、甲酸、水、或其组合。

在另一优选例中，注射泵推进速率为1.5-2ml/h。

在另一优选例中，注射泵针头出口的直径为0.6-1.0mm。

在另一优选例中，电场电压为10-30kv，较佳为15-25kv。

在另一优选例中，注射针头出口至滚筒接收器的距离为15-20cm。

在另一优选例中，滚筒接收器的转速为300-500转/分钟。

在另一优选例中，所述多巴胺溶液浓度为2-6mg/ml；溶剂选自下组：tris-buffer、去离子水、乙醇、或其组合。

在另一优选例中，丝素蛋白与多巴胺投料质量比为100：0.5到100：1.5。

在另一优选例中，丝素蛋白多孔支架浸渍于多巴胺溶液的时间为6-12小时。

在另一优选例中，所述e7短肽溶液浓度为40-80mg/ml；溶剂选自下组：pbs、tris-buffer或其组合。

在另一优选例中，丝素蛋白与e7短肽投料质量比例为100：5到100：10。

在另一优选例中，丝素蛋白-多巴胺支架浸渍于e7短肽溶液的时间为12-24小时。

本发明第三方面，提供一种药物组合物，所述药物组合物包含：

第一方面所述的复合支架；和

用于促进骨修复和/或生长的药物和/或生长因子。

本发明第四方面，提供一种组织工程骨修复材料，所述组织工程骨修复材料包含：

第一方面所述的复合支架；和

用于促进骨修复和/或生长的细胞。

本发明第五方面，提供第一方面所述的复合支架或第三方面所述的药物组合物的用途，用于制备骨组织修复材料、用作组织工程支架材料或用作药物载体材料。

本发明人的丝素蛋白-多巴胺-e7短肽复合支架，不仅改善了亲水性，促进了细胞粘附和增殖，还能够通过pda和e7的共同作用加快了bmscs的成骨分化，而且支架在体外和体内对bmscs都具有很高募集的效率。此外，功能化的静电纺丝支架在大鼠的临界骨缺损模型中促进了骨再生。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。说明书中所揭示的各个特征，可以被任何提供相同、均等或相似目的的替代性特征取代。限于篇幅，在此不再一一赘述。

附图说明

图1为形貌图。

图2为支架亲水性检测结果图。

图3为细胞粘附实验结果图。

图4为细胞募集实验细胞形态图。

图5为细胞募集实验细胞数量图。

图6为体内外成骨结果图。

图7为对比例1支架扫描电镜图。

图8为对比例2支架扫描电镜图。

图9为对比例3支架对骨髓间充质干细胞的体外募集效果图。

具体实施方式

本发明人基于长期而深入的研究，制备出一种丝素蛋白-多巴胺-e7短肽复合支架，不仅改善了亲水性，促进了细胞粘附和增殖，还能够通过pda和e7的协同效应加快了bmscs的成骨分化，而且支架在体外和体内对bmscs都具有很高募集的效率。此外，功能化的静电纺丝支架在大鼠的临界骨缺损模型中促进了骨再生。在此基础上，完成了本发明。

术语说明

e7短肽

e7短肽，也称为e7多肽、e7肽，对骨髓间充质干细胞具有特异亲和性，其氨基酸排列顺序为eplqlkm。

静电纺丝

静电纺丝是一种特殊的纤维制造工艺，聚合物溶液或熔体在电场中进行喷射纺丝。在电场作用下，针头处的液滴会由球形变为圆锥形，并从圆锥尖端延展得到纤维细丝。

静电纺丝作为一种可制备纳米高分子支架简便高效的技术，已引起人们越来越多的关注。纤维孔径适宜足以细胞浸润生长，生物相容性良好而且在体内能够充分降解。

实施例1

支架的制备

首先将8g丝蛋白(sf)溶解于80ml六氟异丙醇混合溶剂中，形成10％(w/v)溶液，将丝蛋白混合液吸入10ml注射针筒内，通过微量注射泵以1.5-2ml/h的速率进行推进，前端针头内径为0.8mm的不锈钢平头点胶针。静电纺丝过程中电压控制在15-20kv，针头至接收器的距离为15-20cm。滚筒收集器的转速为300-500次每分钟，将静电纺丝纤维收集在铝箔纸上并真空干燥获得sf支架。

将多巴胺溶解在tris-buffer中，并将8g丝蛋白静电纺丝支架(sf支架)浸入在20ml多巴胺溶液(4mg/ml)中12小时，充分氧化自聚后形成聚多巴胺(pda)沉积层，获得sf-pda支架。

将sf-pda支架浸入到10mle7多肽溶液(72mg/ml,10mmtris,ph8.5)中24小时，形成sf-pda-e7复合支架。

实施例2

支架的制备

实验步骤同实施例1，不同之处在于静电纺丝过程中的电压改为20-25kv。

首先将8g丝蛋白(sf)溶解于80ml六氟异丙醇混合溶剂中，形成10％(w/v)溶液，将丝蛋白混合液吸入10ml注射针筒内，通过微量注射泵以1.5-2ml/h的速率进行推进,前端针头内径为0.8mm的不锈钢平头点胶针。静电纺丝过程中电压控制在20-25kv,针头至接收器的距离为15-20cm。滚筒收集器的转速为300-500次每分钟，将静电纺丝纤维收集在铝箔纸上并真空干燥获得sf支架。

将多巴胺溶解在tris-buffer中，并将8g丝蛋白静电纺丝支架(sf支架)浸入在20ml多巴胺溶液(4mg/ml)中12小时，充分氧化自聚后形成聚多巴胺(pda)沉积层，获得sf-pda支架。

将sf-pda支架浸入到10mle7多肽溶液(72mg/ml,10mmtris,ph8.5)中24小时，形成sf-pda-e7复合支架。

实施例3

支架的制备

实验步骤同实施例1，不同之处在于丝蛋白静电纺丝支架(sf支架)浸入的多巴胺溶液浓度为2mg/ml。

首先将8g丝蛋白(sf)溶解于80ml六氟异丙醇混合溶剂中，形成10％(w/v)溶液，将丝蛋白混合液吸入10ml注射针筒内，通过微量注射泵以1.5-2ml/h的速率进行推进，前端针头内径为0.8mm的不锈钢平头点胶针。静电纺丝过程中电压控制在15-20kv，针头至接收器的距离为15-20cm。滚筒收集器的转速为300-500次每分钟，将静电纺丝纤维收集在铝箔纸上并真空干燥获得sf支架。

将多巴胺溶解在tris-buffer中，并将8g丝蛋白静电纺丝支架(sf支架)浸入在20ml多巴胺溶液(2mg/ml)中12小时，充分氧化自聚后形成聚多巴胺(pda)沉积层，获得sf-pda支架。

将sf-pda支架浸入到10mle7多肽溶液(72mg/ml,10mmtris,ph8.5)中24小时，形成sf-pda-e7复合支架。

实施例4

支架的制备

实验步骤同实施例1，不同之处在于sf-pda支架浸入的e7多肽溶液的浓度为40mg/ml(10mmtris,ph8.5)。

首先将8g丝蛋白(sf)溶解于80ml六氟异丙醇混合溶剂中，形成10％(w/v)溶液，将丝蛋白混合液吸入10ml注射针筒内,通过微量注射泵以1.5-2ml/h的速率进行推进,前端针头内径为0.8mm的不锈钢平头点胶针。静电纺丝过程中电压控制在15-20kv,针头至接收器的距离为20-25cm。滚筒收集器的转速为300-500次每分钟，将静电纺丝纤维收集在铝箔纸上并真空干燥获得sf支架。

将多巴胺溶解在tris-buffer中，并将8g丝蛋白静电纺丝支架(sf支架)浸入在20ml多巴胺溶液(4mg/ml)中12小时，充分氧化自聚后形成聚多巴胺(pda)沉积层，获得sf-pda支架。

将sf-pda支架浸入到10mle7多肽溶液(40mg/ml,10mmtris,ph8.5)中24小时，形成sf-pda-e7复合支架。

实施例5

支架的制备

实验步骤同实施例1，不同之处在于丝素蛋白溶液的浓度为8w/v％。

实施例6

支架的制备

实验步骤同实施例1，不同之处在于将丝蛋白静电纺丝支架(sf支架)浸入在多巴胺溶液(4mg/ml)中8小时。

实施例7

支架的制备

实验步骤同实施例1，不同之处在于将sf-pda支架浸入到e7多肽溶液中15小时，形成sf-pda-e7复合支架。

实施例8

支架的制备

实验步骤同实施例1，不同之处在于丝素蛋白溶液的浓度为20w/v％。

性能检测

以实施例1制备的各支架为例，对各种性能进行检测。

支架形貌观察

支架形貌用扫描电镜进行观察，将丝蛋白静电纺丝纤维支架使用导电胶固定在样品台上，表面喷金后在扫描电镜下观察。根据电镜扫描结果，测量并统计支架纤维的直径以及支架平均孔径。如图1所示扫描电镜表面微观形貌可以看出，电纺纤维表面平滑，直径比较均一，没有粘连现象，纤维呈现相互连通的三维网络状结构。

经过统计计算，丝素蛋白-多巴胺-e7短肽复合支架的纤维由直径为200-500nm的纤维构成，平均为250nm；支架孔径为5-20μm，平均孔径在15μm。

孔隙率的测定

在恒温30℃条件下，比重瓶装满乙醇称重w1，把重w2的样品浸入装有乙醇的比重瓶中，脱气，务必使乙醇充盈于多孔支架中，然后加满乙醇，称重w3，把浸满乙醇的样品取出后，剩余的乙醇与比重瓶称重w4，按以下公式:(w3-w4-w2)/(w1-w4)计算试样的孔隙率，测定3组试样求平均值，即得支架的孔隙率。

根据检测结果，纤维支架的孔隙率为80％-90％之间，平均孔隙率为82％左右。

经检测，实施例2-8制备的复合支架的孔隙率为80％-90％。

吸收性能

在支架上滴一液滴，固体表面上的固－液－气三相交界点处，其气－液界面和固－液界面两切线把液相夹在其中时所成的角，用接触角测试仪测试并拍照记录。

结果如图2所示，结果表明，相对于sf支架、sf-pda支架，sf-pda-e7复合支架具有良好的亲水性，接触角约为31.1±1.8°，三组支架材料的接触角逐渐变小，sf-pda-e7接触角最小，说明e7对支架材料的改性进一步提高了材料的亲水性。

经检测，实施例2-7制备的复合支架的接触角分别约为32.8°、29.5°、32.3°、30.6°、31.5°、29.9°。

细胞粘附实验

将骨髓间充质干细胞均匀接种在纤维支架表面，在培养箱中静置培养24小时，然后细胞用多聚甲醛固定并用pbs洗涤细胞2次，用鬼笔环肽染色液在避光下染色1个小时，并用激光共聚焦显微镜观察细胞形态。

结果如图3所示，结果表明，相对于sf支架、sf-pda支架，sf-pda-e7复合支架能够促进细胞的粘附。细胞在支架表面充分伸展，细胞呈多边形，伪足明显。

经检测，骨髓间充质干细胞在实施例2-8制备的复合支架上也能充分伸展，细胞呈多边形，伪足明显。

细胞募集实验

将骨髓间充质干细胞用于体外transwell模型的研究。将支架置于24孔板底部，将transwell小室放入24孔板。以5000/小室的密度将细胞种在小室中，分别培养12h，将小室取出。置于多聚甲醛固定液溶液中，4℃固定10分钟，用棉球将transwell小室内未穿过膜的细胞擦除，用结晶紫对细胞进行染色，在显微镜下观察，拍照，统计穿过膜的细胞数量，进而评估细胞募集效果。

结果如图4和图5所示，结果表明，相对于sf支架(约20个细胞/mm²)、sf-pda支架(约23个细胞/mm²)，sf-pda-e7复合支架(约32个细胞/mm²)能够募集到更多的骨髓间充质干细胞，细胞数量更多，细胞形态良好，说明e7对骨髓间充质干细胞的募集效果明显且有效。

体内外成骨实验

选取第3代骨髓间充质干细胞，均匀接种于预先置有三组材料的6孔板内。待细胞融合达80％时，吸去孔内培养液，每孔加入成骨诱导液2ml，置培养箱中培养，隔天换液，一周后收集样本，提取细胞rna，利用rt-pcr检测细胞成骨基因的变化。然后，利用sd雄性大鼠颅骨缺损模型，将三组支架材料植入缺损处，8周后将大鼠颅骨取出，进行micro-ct扫描分析和骨再生修复分析。

结果如图6所示，结果表明，相对于sf支架、sf-pda支架，sf-pda-e7复合支架在体外能够促进干细胞成骨分化，提高成骨基因的表达，在体内能够促进骨缺损的修复，促进骨再生。在体外，对细胞的成骨基因的表达增高，明显促进了细胞的成骨分化，在体内，颅骨缺损修复面积大，再生骨组织的骨密度较高。

对比例1

实验步骤同实施例1，不同之处在于丝蛋白溶液浓度：将1.6g丝蛋白(sf)溶解于80ml六氟异丙醇混合溶剂中，形成2％(w/v)溶液。

结果如图7所示，未纺出很好的支架材料，静电纺丝的纤维断裂，纤维之间有颗粒状材料，纤维直径不均匀且形态较差，支架不具备层次，纤维之间相互融合，支架不完整。

对比例2

实验步骤同实施例1，不同之处在于将丝蛋白静电纺丝支架(sf支架)浸入在多巴胺溶液中两个小时。

结果如图8所示，由于多巴胺与支架表面相互作用时间较短，多巴胺在支架材料表面未能充分氧化自聚成聚多巴胺沉积层，支架纤维表面大多光滑。

对比例3

实验步骤同实施例1，不同之处在于sf-pda支架浸入的e7多肽溶液的浓度减少到10mg/ml。

结果如图9所示，由于e7的浓度过低，导致sf-pda支架材料表面e7的接枝量较少，通过transwell实验结果显示，复合支架对骨髓间充质干细胞的体外募集效果不明显，未能充分发挥e7的生物学作用。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。