蝙蝠葛碱在制备治疗阿尔茨海默症线粒体的药物中的应用的制作方法

本发明属于医药技术领域，尤其涉及蝙蝠葛碱在制备治疗阿尔茨海默症线粒体的药物中的应用。

背景技术：

阿尔茨海默病(ad)又叫老年性痴呆，是一种中枢神经系统变性病；其起病隐袭，病程呈慢性进行性，是老年期痴呆最常见的一种类型。据相关数据显示，我国国内阿尔兹海默症(俗称老年痴呆)患者成倍数增长，1999年仅300万人，2016年达到900万人，估计2050年将高达3600万人。目前，阿尔兹海默症主要针对其可能的几种发病机制、aβ蛋白异常沉积、tau蛋白过度磷酸化、突触功能障碍和神经递质异常，以及线粒体自噬功能障碍等进行治疗。有研究表明，阿尔兹海默症患者中存在金属离子代谢紊乱的现象。金属离子尤其是铜离子由于其作为变价金属，研究表明其可以和游离aβ1-42蛋白结合形成复合物，进入细胞并对细胞线粒体产生氧化损伤。在ad患者脑内聚集的淀粉样斑块中经检测发现含有高浓度的cu²⁺，这也是对应脑内氧化应激发生的区域。

目前，国际上在研究ad疾病中最为常用的几种动物模型，即秀丽隐杆线虫，果蝇和鼠，秀丽隐杆线虫由于其生理结构的简易性更容易进行神经功能学研究。而aβ毒性蛋白作为ad中诱发氧化应激的重要因素之一，在许多研究中发现其可以通过氧化应激损伤线粒体功能而诱发神经元的损伤，加重ad症状。因此利用aβ过表达线虫模型来进行研究对相关的学者们提供了便利。

线粒体被认为在神经元中有特别重要的作用，其主要职能包括：钙离子的调控和氧化还原、突触可塑性的调控以及细胞存活和死亡的调控。线粒体对钙离子的调节作用失衡可以触发细胞凋亡和细胞死亡，过多的线粒体分裂通过突触损伤和神经元死亡能够促进ad发病。在神经变性疾病的进展中，线粒体损伤可以导致凋亡性神经元死亡。已有研究表明，药物抑制线粒体功能障碍可以改善ad的记忆功能损害。因此，线粒体功能障碍可能是ad发病潜在的作用机制，保护线粒体功能仍是预防和减慢ad发病和进展的关键。

目前，临床主要采用胆碱酯酶抑制剂减少乙酰胆碱降解，增强胆碱能神经元的途径来治疗ad。胆碱酯酶抑制剂是一线治疗药物，其主要包括被fda认证的他克林、多奈哌齐、利凡斯的明、加兰他敏以及我国sfda认证的石杉碱甲。但是，治疗ad的药物仍然十分缺乏，急需开拓新的治疗途径和药物来更好治疗阿尔兹海默症。

技术实现要素：

本发明目的在于克服现有技术存在的不足，而提供蝙蝠葛碱在制备治疗阿尔茨海默症线粒体的药物中的应用，蝙蝠葛碱上调线粒体膜电位，下调细胞中活性氧浓度，上调细胞中bcl-2蛋白表达量，起到保护阿尔茨海默症线粒体的功效。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：蝙蝠葛碱在制备治疗阿尔茨海默症线粒体的药物中的应用。

作为上述技术方案的改进，蝙蝠葛碱上调线粒体膜电位，下调细胞中活性氧浓度，上调细胞中bcl-2蛋白表达量。

本发明发现蝙蝠葛碱可显著抑制活性氧(ros)的产生，恢复线粒体膜电位，并上调抗凋亡保护因子bcl-2。氧化应激是指体内生成过多的活性氧(ros)，超出机体自身的清除能力而导致体内氧化与抗氧化作用失衡介导的一系列反应。线粒体既是细胞内ros产生的主要场所，也是ros攻击和损伤的主要靶器官。线粒体膜电位(mmp)是评价线粒体功能的敏感指标。正常情况下,线粒体内膜的质子泵将基质内质子泵入外室，使细胞膜内电位比细胞质低1.0～2.0mv。正常的mmp是维持线粒体进行氧化磷酸化、产生三磷酸腺苷的先决条件，mmp的稳定有利于维持细胞的正常生理功能。细胞凋亡时，在dna还未片段化之前细胞的线粒体已出现损伤，出现形态和功能改变，其中以线粒体膜通透性转化孔(ptp)的开放尤为重要。ptp的开放可引起mmp下降，线粒体氧化磷酸化功能障碍，外膜断裂，并释放促凋亡因子如细胞色素c等，导致细胞凋亡。因此，mmp降低是细胞早期凋亡的一个重要特征。bcl-2蛋白具有延长细胞生存时间和抗细胞凋亡的功能，它被称为凋亡抑制基因。有研究表明，抗凋亡的bcl-2蛋白能力的改变，主要原因是膜定位能力的改变。与其他的癌蛋白相比较，bcl-2蛋白促进细胞的存活是因为产生了阻止细胞凋亡的机制，并不是使正常的细胞增殖机制受到破坏的调控。因此，利用本发明蝙蝠葛碱对线粒体功能的保护作用将可以用于开发新型的ad治疗药物。

另外，本发明还提供一种用于治疗治疗阿尔茨海默症线粒体的药物，其包括蝙蝠葛碱。

作为上述技术方案的改进，其还包含药学上可接受的辅料。

本发明所述辅料至少包含赋形剂、粘合剂、稀释剂、表面活性剂、润湿剂、崩解剂或抗氧化剂中的一种。所述赋形剂包括，但并不限于，离子交换剂、铝、硬脂酸铝、卵磷脂、血清蛋白、缓冲物质、甘氨酸、山梨酸、山梨酸钾、饱和植物脂肪酸的部分甘油酯混合物、水、盐或电解质、磷酸氢二钠、磷酸氢钾、氯化钠、锌盐、胶体硅、三硅酸镁、聚乙烯吡咯烷酮、聚丙烯酸脂、蜡、聚乙烯-聚氧丙烯-阻断聚合体、羊毛脂、糖、葡萄糖和蔗糖、淀粉、纤维素和它的衍生物、树胶粉、麦芽、明胶和滑石粉。所述粘合剂包括羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羟乙基纤维素、淀粉1500、聚乙烯吡咯烷酮(聚烯吡酮)和共聚烯吡酮。所述稀释剂包括甘露醇、山梨醇、磷酸二氢钙二水合物、微晶纤维素和粉化纤维素。所述表面活性剂可以为阴离子、阳离子或中性表面活性剂，阴离子表面活性剂包括月桂基硫酸钠、十二烷基磺酸钠；阳离子表面活性剂包括苯扎氯铵和烷基三甲基溴化铵；中性表面活性剂包括甘油单油酸脂、聚氧乙烯脱水山梨糖醇脂肪酸脂、聚乙烯醇和脱水山梨醇脂。所述润湿剂包括泊洛沙姆、聚氧乙烯烷基醚、聚氧乙烯蓖麻油衍生物和聚氧乙烯硬脂酸脂。所述崩解剂可以是数种改性淀粉、改性纤维素聚合物或者聚羧酸中的一种，比如交联羟甲基纤维素钠、淀粉乙醇酸钠、波拉克林钾和羟甲基纤维素钙。抗氧化剂选自生育酚、l-抗坏血酸和它的钠或者钙盐等。

作为上述技术方案的改进，药物的剂型为片剂、膏剂、散剂、汤剂、丸剂或胶囊剂。

另外，本发明还提供一种阿尔茨海默症细胞模型的构建方法，先在神经元细胞中转染app基因，转染后加入150μmcu²⁺并培养2h，即可。

本发明的有益效果在于：本发明提供蝙蝠葛碱在制备治疗阿尔茨海默症线粒体的药物中的应用，本发明公开：蝙蝠葛碱能很好的抑制阿尔茨海默症细胞模型中活性氧的产生，恢复线粒体膜电位，上调抗凋亡保护因子bcl-2；蝙蝠葛碱对阿尔茨海默症线粒体功能的保护作用将可以用于开发新型的ad治疗药物；线虫是国内外目前公认的研究神经科学最常用的动物模型，本发明采用的是aβ过表达的gmc101线虫和对照的野生型n2线虫，gmc101线虫最终导致个体的瘫痪和死亡较高，蝙蝠葛碱可以降低线虫的瘫痪率；另外，本发明构建的阿尔茨海默症细胞模型可以用于ad的研究。

附图说明

图1显示蝙蝠葛碱对细胞凋亡的影响；其中，图1a统计正常组、模型组和加药组中细胞凋亡率，图1b显示正常组、模型组和加药组的细胞凋亡的流式检测结果；正常组表示appsw细胞中未加入cu²⁺进行处理，模型组为appsw细胞中加入cu²⁺进行处理，加药组为appsw细胞中加入cu²⁺进行处理，处理后再加入蝙蝠葛碱(dauricine，即dau)，*表示p<0.05；

图2显示蝙蝠葛碱对线粒体膜电位、活性氧和bcl-2的影响；图2a为线粒体膜电位(mmp)检测结果图，其表明给予蝙蝠葛碱(1μm)后，线粒体膜电位具有显著性回复，蝙蝠葛碱可以有效保护线粒体电位恢复至正常水平；图2b为细胞内活性氧(ros)检测结果图，其表明在给予蝙蝠葛碱(1μm)后，细胞内ros水平明显降低，蝙蝠葛碱可以抑制细胞内活性氧的累积，可以有效保护细胞免受ros的损伤；图2c为细胞内bcl-2蛋白表达水平的检测结果图，其表明给予蝙蝠葛碱(1μm)后，bcl-2蛋白表达水平明显上升；其中，*表示p<0.05；

图3显示蝙蝠葛碱对线虫的影响；其中，图3a显示蝙蝠葛碱对野生型n2线虫的影响，图3b蝙蝠葛碱对gmc101型线虫的影响；control表示不加入蝙蝠葛碱，图3的横坐标为天数，纵坐标为瘫痪率。

具体实施方式

为更好地说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例和附图对本发明作进一步说明。

本发明所述先在神经元细胞中通转染app(myloidbeta(a4)precursorprotein)基因，是一种常规技术：即在sh-sy5y细胞中转染app基因，构建appsw细胞，并结合cu²⁺诱导神经元细胞构建阿尔茨海默症细胞模型。

蝙蝠葛碱对细胞凋亡的影响

用不同浓度的cu²⁺处理appsw细胞后，给予一定浓度(1μm)的蝙蝠葛碱检测细胞活力值，试剂盒为日本同仁cck8检测试剂盒；经过筛选确定cu²⁺浓度为150μm，处理2h时后加入蝙蝠葛碱，结果发现蝙蝠葛碱对appsw细胞的修复效果最好。接下来利用150μmcu²⁺进行阿尔茨海默症细胞模型的构建，并在加入蝙蝠葛碱处理48h后进行细胞凋亡的流式检测，检测试剂盒为bd公司annexinv-fitc/pi细胞凋亡双染试剂盒。

结果如图1所示，相比模型组，加药组细胞存活率显著上升，表明蝙蝠葛碱能抑制细胞凋亡。

蝙蝠葛碱对线粒体膜电位、活性氧和bcl-2的影响

1)线粒体膜电位检测：将appsw细胞以10×10⁴个/ml数量接种在6孔板上，用150μmcu²⁺培养2h后再加入蝙蝠葛碱，48h后利用上海碧云天公司的线粒体膜电位检测试剂盒进行检测；

2)活性氧检测：将appsw细胞以10×10⁴个/ml数量接种在6孔板上，用用150μmcu²⁺培养2h后再加入蝙蝠葛碱，48h之后除去培养基，用磷酸缓冲盐溶液清洗后加入用无血清培养基配置的dcfh-da探针溶液，孵育30min后除去培养基，加入新鲜无血清培养基后用荧光倒置显微镜观察，并用荧光酶标仪进行荧光检测；

3)bcl-2检测：将appsw细胞以10×10⁴个/ml数量接种在6孔板上，用150μmcu²⁺培养2h后再加入蝙蝠葛碱，48h后将细胞收集加入细胞裂解液，充分裂解后离心提取蛋白并煮沸变性，-80℃储存，用提取的蛋白进行bcl-2蛋白检测。

如图2所示，蝙蝠葛碱可以有效降低活性氧的累积，修复线粒体膜电位，并上调抗凋亡因子bcl-2的表达；说明蝙蝠葛碱可以用于靶向治疗阿尔兹海默症线粒体：氧化应激损伤和抗凋亡。

蝙蝠葛碱对aβ蛋白过表达线虫损伤的保护作用

药物食物配置方法：取3gnacl，17g琼脂，2.5g蛋白胨，加入975ml水高压后趁热加入1ml的1m氯化钙，1ml15mg/ml胆固醇溶液，1ml的1mol/ml硫酸镁和25ml磷酸钾缓冲液，混匀后倒板得ngm琼脂板。待琼脂板冷却后加入五氟尿嘧啶(100mg/l)和op50混悬液，其中包含一定浓度的蝙蝠葛碱(0，1，6.4，64μm)，37℃培育24h后待用。

线虫瘫痪率的测定：将30条经过次氯酸钠同步化处理两次的在l3期生长状态下的gmc101(过表达aβ蛋白)和野生型n2线虫放入不同药皿中，在25℃恒温培养箱中培育，每天定时观察各个ngm琼脂板中线虫的生活状态，持续一周，记录并统计结果。

结果如图3所示，在野生型n2线虫中，加入蝙蝠葛碱和空白组的线虫瘫痪率不存在显著性差异；在gmc101线虫中，加药4d后，与空白组相比，加入蝙蝠葛碱后显著减小线虫的瘫痪率；这表明蝙蝠葛碱对ad模型中具有一定的治疗效果。

最后所应当说明的是，以上实施例用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者同等替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。