一种高吸液性丝素蛋白止血膜及其制备方法与流程

本发明属于止血材料制备
技术领域：
，尤其涉及一种高吸液性丝素蛋白止血膜及其制备方法。
背景技术：
：日常生活中受伤在所难免，而止血则是紧急救治的一个重要步骤，尤其是日常生活中出现的突发性创伤、医院的手术治疗等，快速止血都是不可或缺的一部分。而有效的止血剂通常都价格昂贵，药效较低或者引发各种安全问题。因此寻找一种高效、廉价、无毒副作用的新型止血材料显得至关重要。以往采取的止血措施主要是使用止血带或绷带扎住伤口，然后用纱布加压包扎。这些止血方法对于在短时间内抢救伤员发挥了重要作用。但由于止血带无法救治大血管出血，在创口表面粘附不牢固而易脱落造成二次出血等使得其很快被新型止血材料代替。随着现代医学技术的发展与进步，快速高效的止血材料和医疗器械应运而生。它们在止血方面都有一定的效果，但鉴于这些止血材料成本较高、引发二次感染、在生物体内不易降解等缺点而不能广泛推广应用。丝素蛋白作为一种天然纤维材料，曾被广泛应用于纺织行业。近年来的研究表明，丝素蛋白不仅具有人体所必须的多种氨基酸，对机体无毒性、无致敏性和刺激作用，又可部分生物降解。此外，丝素蛋白同时具有良好的透气性和保湿性能促进伤口的快速愈合；而且制作成的多孔膜状材料还具有一定的柔软性和拉伸性能，有望成为一种良好的止血材料。技术实现要素：本发明的目的在于针对现有的止血材料吸液性能不足，止血时间较长等不足，提供一种高吸液性丝素蛋白止血膜及其制备方法，该高吸液性丝素蛋白止血膜免疫原性低，材料来源丰富，具有良好的生物相容性和可降解性能。且该种止血膜所采用的基质为生物可降解材料，可以降解成对人体无害的小分子随人体循环排除体外。为实现上述目的，本发明的技术方案为一种高吸液性丝素蛋白止血膜及，所述的高吸液性丝素蛋白止血膜由聚氧化乙烯、丝素蛋白，海藻酸钠和纳米二氧化硅组成进一步的，所述的高吸液性丝素蛋白止血膜按重量份数计由聚氧化乙烯5-25份、丝素蛋白10-50份、海藻酸钠5-15份、纳米二氧化硅0.5-1份组成。优选地，所述的聚氧化乙烯为1×106购于美国sigma-aldrich公司，所述的海藻酸钠的粘度为200pa·s，购于青岛明悦有限公司，所述的纳米二氧化硅其特征在于，其粒径分布为150-250nm。更进一步的，所述的丝素蛋白从蚕丝提取所得，具体提取方法如下：称取一定质量的蚕丝生丝，按照标准比例（蚕丝质量/g：蒸馏水体积/l：无水碳酸钠质量/g=10：1：5）称取蒸馏水和无水碳酸钠。先加入蒸馏水，再加入无水碳酸钠，100℃加热，待到里面液体完全沸腾后加入蚕丝生丝，加热30分钟。30min后，将蚕丝取出用蒸馏水清洗，直至洗出的水澄清透明。按照上面的步骤再加热30分钟。实验结束后，将得到的丝素蛋白置于60℃烘箱中烘干备用；为实现上述目的，本发明的另一技术方案为：一种高吸液性丝素蛋白止血膜的制备方法，所述的制备方法通过以下步骤实现：（1）止血膜纺丝材料的制备、（2）止血膜的纺丝、（3）止血膜交联处理；进一步的，所述高吸液性丝素蛋白止血膜的制备具体步骤为：（1）止血膜纺丝材料的制备：s1丝素蛋白/纳米二氧化硅纺丝液的制备：按配方比称取一定量的丝素蛋白将其溶解于三氟乙醇中，配制成质量浓度为5-10%的溶液，优选10%，然后按配方比加入纳米二氧化硅，常温下搅拌2-3h，优选2.5h，备用；s2聚氧化乙烯/海藻酸钠纺丝液的制备：称取一定量的聚氧化乙烯溶解于蒸馏水中，配制成质量浓度为5-10%wt的聚氧化乙烯溶液，浓度优选10%wt；称取一定量的海藻酸钠溶解于蒸馏水中，配置成质量浓度为2-3%的海藻酸钠溶液，浓度优选3%wt；按配方便将聚氧化乙烯溶液和海藻酸钠溶液混合，搅拌均匀，消泡后备用；（2）止血膜的纺丝：s1按配方分别将丝素蛋白/纳米二氧化硅纺丝液（a液）和聚氧化乙烯/海藻酸钠纺丝液（b液）加入到静电纺丝机相应的注射器中，静置30-60min，排尽注射器的空气；s2调节纺丝机接收器和纺丝喷头间的距离为10-20cm，优选15cm；接通高压电源，调节至10~20kv，优选15kv；启动注射泵，载有a液注射器的注射泵的输出速度调节至0.5-1.5ml/h，优选1ml/h；载有b液注射器的注射泵的输出速度调节至0.6-1.0ml/h，优选0.8ml/h；启动接收器接收纺丝，接收器的转速设置为200~350rpm，优选250rpm；待其中一组注射器内的纺丝液完全输出后，关闭高压电源，并去下纺丝膜；（3）止血膜交联处理：称取一定量的无水氯化钙溶解于无水乙醇中，配制成质量浓度为2-5%wt的氯化钙交联液，浓度优选5%wt，然后将所制得的纺丝膜浸泡于交联液12-24h，然后用无水乙醇洗涤2-3遍，置于60℃真空烘箱中烘干，即得一种高吸液性丝素蛋白止血膜；优选地，所述的注射器的数量为8-16个，且按注射器内所装的纺丝液的不同，分为a组和b组，对应地，a组注射器由a注射泵控制，b组注射器由b注射泵控制；a组注射器的连接的纺丝喷头对应为a组纺丝喷头，b组注射器的连接的纺丝喷头对应为b组纺丝喷头，a组纺丝喷头和b组纺丝喷头按顺序交替并列固定在纺丝喷头固定滑台上；更进一步地，所述的纺丝喷头，其特征在于，所述的纺丝喷射头孔径为0.5-0.8mm，优选0.6mm。本发明的有益效果：（1）本发明通过交替静电纺丝技术，制备出一种具用多孔网状结构的止血膜，所制得的止血膜其纤维直径为纳米级，能有效提供止血膜的吸液性能，且该种止血膜良好的三维网状结构利于血小板的聚集，能够在短时间内起到止血的效果。（2）本发明以丝素蛋白，海藻酸钠、纳米二氧化硅和聚氧化乙烯为原料所制备的止血膜具有多重的止血机理，纳米二氧化硅具有选择性吸收血液中的水分子，而不吸收血液中其他成分，导致血小板和凝血因子的浓缩，从而达到止血的目的；海藻酸钠能在于伤口接触时形成凝胶从而达到止血的效果；丝素蛋白能将纤维蛋白原转化成能促使伤口周围血液凝固的纤维蛋白，通过封闭血管达到止血目的。附图说明图1为实施例1～3与对比例的吸液比重的对比图；图2为实施例1～3和对比例与血管内皮细胞共培养1天和7天后其对应的细胞相对增殖率的结果对比图；图3为实施例1～3与对比例的活化部分凝血酶时间测试结果对比图；图4为实施例1～3与对比例的凝血原酶时间测试结果对比图。具体实施方式下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。本发明按如下步骤制备得到一种高吸液性丝素蛋白止血膜：（1）止血膜纺丝材料的制备：s1丝素蛋白/纳米二氧化硅纺丝液的制备：按配方比称取一定量的丝素蛋白将其溶解于三氟乙醇中，配制成质量浓度为10%的溶液，然后按配方比加入纳米二氧化硅，常温下搅拌2.5h，备用；s2聚氧化乙烯/海藻酸钠纺丝液的制备：称取一定量的聚氧化乙烯溶解于蒸馏水中，配制成质量浓度为10%wt的聚氧化乙烯溶液；称取一定量的海藻酸钠溶解于蒸馏水中，配置成质量浓度为3%的海藻酸钠溶液；按配方便将聚氧化乙烯溶液和海藻酸钠溶液混合，搅拌均匀，消泡后备用；（2）止血膜的纺丝：s1按配方分别将丝素蛋白/纳米二氧化硅纺丝液（a液）和聚氧化乙烯/海藻酸钠纺丝液（b液）加入到静电纺丝机相应的注射器中，静置60min，排尽注射器的空气；s2调节纺丝机接收器和纺丝喷头间的距离为15cm；接通高压电源，调节至15kv；启动注射泵，载有a液注射器的注射泵的输出速度调节至1ml/h；载有b液注射器的注射泵的输出速度调节至0.8ml/h；启动接收器接收纺丝，接收器的转速设置为250rpm；待其中一组注射器内的纺丝液完全输出后，关闭高压电源，并去下纺丝膜；（3）止血膜交联处理：称取一定量的无水氯化钙溶解于无水乙醇中，配制成质量浓度为5%wt的氯化钙交联液，然后将所制得的纺丝膜浸泡于交联液24h，然后用无水乙醇洗涤2-3遍，置于60℃真空烘箱中烘干，即得一种高吸液性丝素蛋白止血膜；实施例1本发明按上述方法制备一种高吸液性丝素蛋白止血膜，其中聚氧化乙烯的用量为5份、丝素蛋白的用量为50份、海藻酸钠的用量为15份、纳米二氧化硅的用量为1份组成。实施例2本发明按上述方法制备一种高吸液性丝素蛋白止血膜，其中聚氧化乙烯的用量为25份、丝素蛋白的用量为10份、海藻酸钠的用量为5份、纳米二氧化硅的用量为0.5份组成。实施例3本发明按上述方法制备一种高吸液性丝素蛋白止血膜，其中聚氧化乙烯的用量为15份、丝素蛋白的用量为30份、海藻酸钠的用量为10份、纳米二氧化硅的用量为0.75份组成。实施例4对比例：（参考申请号201410150503.7一种生物可吸收止血膜所制得）实验组1～3：为实施例1～3所得的一种高吸液性丝素蛋白止血膜。（1）吸液性能的检测将上述实施例1～3所制备的一种高吸液性丝素蛋白止血膜与对比例进行吸液性能评价实验，将已知质量（w）的5×5cm的样品置于培养皿内。加入预热至（37±1）℃的生理盐水，生理盐水的添加量为供试材料的40倍，±0.5g，移入培养箱内，在（37±1）℃下保持30min，然后用镊子夹持样品一角或一端，悬垂30s，称量，此时样品重量为w1，吸水倍率=（w1-w）/w，每组样品设置5个平行样，实验结果如图1示。从图1中可以看到通过本发明所公开的方法所制得的一种高吸液性丝素蛋白止血膜实施例1～3的吸液性能明显较对比例要高，实施例1的吸液性能为对比例的1.49倍，吸液比重为10.21，说明本发明所制得的高吸液性丝素蛋白止血膜具有良好的吸液性能。（2）细胞毒性的检测将上述实施例1～3所制备的一种高吸液性丝素蛋白止血膜进行细胞毒性评价实验（按国标gb/t16886.5-2003进行实验），对比实施例1~3和对比例。实验结果如图2示。细胞毒性检测结果显示实施例1-3在与上皮细胞共培养1天和7天后其对应的细胞相对增殖率均在85%以上，证明采用本发明所公开的制备方法所制得的牙周组织再生修复膜具有良好的生物相容性。（3）体外凝血性能检测：体外凝血性能采用活化部分凝血酶时间（aptt）和凝血原酶时间（pt）来进行检测；活化部分凝血酶时间的测试步骤如下：在试管中加入贫血小板血浆和aptt试剂，在37℃下恒温5min，然后加入氯化钙以及待测样品，放入aptt试管中，通过全自动血液凝固分析仪采集结果；凝血原酶时间（pt）的测试步骤如下：将贫血小板血浆和pt试剂分别在37℃下恒温5min，然后一同加入pt试管中，并加入待测样品，通过全自动血液凝固分析仪采集结果；活化部分凝血酶时间（aptt）在临床上是指待测血浆在钙离子作用下纤维蛋白原转变为不溶性纤维蛋白时，凝固所需要的时间，反映了材料对内源性凝血系统的影响。凝血原酶时间（pt）是外源性组织因子在钙离子作用下生成组织凝血酶原激活物的时间，当组织受到损伤时，激活的凝血因子能将可溶性的纤维蛋白原活化形成不溶性的纤维蛋白凝块，从而阻止血液的流失，它反应了材料对外源性凝血系统的影响。从图3和图4的测试结果可知，通过本发明所制得的高吸液性止血膜其aptt测试结果相比于空白组具有显著的下降，说明材料通过作用于血液的内源性凝血系统的途径促进凝血，而pt测试均没有显著的变化，表明其不影响血液的外源性凝血系统。（4）体内止血实验取健康成年sd大鼠20只，随机分成4组，每组5只。实验前，先采用3%戊巴比妥钠（3mg/100g）溶液对sd大鼠进行静脉腹腔注射麻醉，然后用手术剪沿着腹中线剪切一长度约2cm的纵行切口，逐层进入腹腔，暴露肝中叶。立即用无菌纱布吸干肝脏周围腹腔液，以免腹腔液渗透影响纱布质量的称量。另取一片干净的纱布垫于肝中叶下方，用手术剪刀在肝中叶下缘剪下2cm的切口，迅速施加待测样品止血，观察并记录止血时间和出现量。结果如下表所示：实施例1实施例2实施例3对比例止血时间(s)121±3.1157±3.2134±2.1160±3.4出血量(g)0.34±0.010.51±0.030.47±0.040.64±0.02表1-动物止血实验结果从实验数据可以看出本发明所制得的高吸液性丝素蛋白止血膜具有快速止血的能力，能有效地在短时间内止血。显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定；对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举；凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。当前第1页12